Summary
We beschrijven een protocol voor isolatie en zuivering van neutrofielen van muizen beenmerg door dichtheidsgradiënt centrifugatie en neutrofielen labeling met CellTracker kleurstoffen. Dit is een eenvoudige, snelle, reproduceerbare en economische methode voor het verkrijgen van grote aantallen neutrofielen voor downstream functionele studies of adoptieve overdracht en experimenten volgen.
Abstract
Neutrofielen zijn kritisch effector cellen van het aangeboren immuunsysteem. Ze zijn snel aangeworven op plaatsen van acute ontsteking en oefenen beschermende of pathogene effecten, afhankelijk van de inflammatoire milieu. Toch, ondanks de onmisbare rol van neutrofielen bij de immuniteit, gedetailleerd inzicht in de moleculaire factoren die neutrofielen 'effector en immunopathogene effecten in verschillende infectieziekten en ontstekingen bemiddelen ontbreekt nog, deels vanwege hun korte halfwaardetijd, de problemen met de afhandeling van deze cellen en het ontbreken van betrouwbare experimentele protocollen voor het verkrijgen van voldoende aantallen neutrofielen voor downstream functionele studies en adoptieve overdracht experimenten. Daarom, eenvoudige, snelle, zuinige en betrouwbare methoden zijn zeer wenselijk voor het oogsten van voldoende aantallen muis neutrofielen voor het beoordelen van functies zoals fagocytose, moord, cytokine productie, degranulatie en mensenhandel. Daartoepresenteren wij een reproduceerbare dichtheidsgradiënt centrifugatie gebaseerd protocol kan worden aangepast in een laboratorium grote aantallen neutrofielen isoleren uit het beenmerg van muizen met een hoge zuiverheid en levensvatbaarheid. Bovendien presenteren we een eenvoudig protocol dat CellTracker kleurstoffen gebruikt om de geïsoleerde neutrofielen, die vervolgens kunnen adoptief overgebracht in ontvangende muizen en bijgehouden in verscheidene weefsels ten minste 4 uur na overdracht met flowcytometrie label. Met deze aanpak kan differentiële labeling van neutrofielen van wild-type en gen-deficiënte muizen met verschillende CellTracker kleurstoffen met succes worden gebruikt om concurrerende herbevolking studies uit te voeren voor het evalueren van de directe rol van specifieke genen in de handel van neutrofielen uit het bloed in doelweefsels in vivo .
Introduction
Neutrofielen zijn de meest voorkomende leukocyten in de mens. Zij zijn de belangrijkste cellulaire component van het aangeboren immuunsysteem en fungeren als een eerste lijn van verdediging tegen binnendringende micro-organismen. Patiënten met verworven neutropenie en primaire immuundeficiënties dat neutrofielen nummers en / of functie beïnvloeden de ontwikkeling van levensbedreigende invasieve bacteriële en schimmelinfecties, met de nadruk op het belang van deze cellen in de afweer 1. Immuunherkenning van binnendringende ziekteverwekkers op de infectieplaats door hun verwante patroonherkenning receptoren resulteert in de inductie van een georkestreerde aangeboren immuunreactie, wat leidt tot uitscheiding van chemoattractants een chemotactische gradiënt kan werven neutrofielen uit het bloed in ontstoken weefsel 2 genereren . Na neutrofielen alstublieft de besmettingsplaats, worden ze geactiveerd, wat leidt tot cytokine en chemokine productie pathogeen opname en doden via oxidatieve en niet-oxidatieve mechanisms 3. Naast hun goed-erkende rol in aangeboren immuniteit, neutrofielen zijn ook onlangs aangetoond dat een belangrijke rol spelen als initiatiefnemers van effectieve adaptieve immuunreacties 4. Anderzijds, los van hun beschermende rol in immuniteit, neutrofielen bemiddelen ook weefselschade en immunopathologie door overmatige accumulatie en / of activatie op plaatsen van ontsteking, zoals getoond in diverse infectieziekten en auto-immuunziekten 5-7.
Ondanks de onmisbare rol van neutrofielen bij de montage effectieve aangeboren immuunrespons en hun pleiotropische effector functies in diverse infectieziekten en ontstekingen, technische problemen met de behandeling van deze cellen en het ontbreken van betrouwbare experimentele protocollen heeft belemmerd onderzoek met een aantal neutrofielen in de afgelopen decennia. Daarom wordt gebruik van reproduceerbare assays voor isolatie van neutrofielen moet verder onderzoek neutrofiel-gemedieerde immunolo vergemakkelijkengische functies ex vivo en in vivo. Tot op heden zijn verscheidene werkwijzen beschreven voor het isoleren van neutrofielen zoals dichtheidsgradiënt centrifugering van bloed en muis bloed of beenmerg 8,9, positieve of negatieve immunomagnetische verrijking van neutrofielen van muizen bloed of beenmerg 10,11 en oogsten van neutrofielen uit de peritoneale holte van muizen na intraperitoneale injectie van thioglycollaat of andere inflammatoire middelen 12. Hoewel neutrofielen gemakkelijk afzonderlijk in grote aantallen uit menselijk bloed, deze methode niet optimaal bij muizen vanwege de beperkte hoeveelheid muizenbloed die isolatie voldoende neutrofielen voor functionele studies of adoptieve overdrachtsexperimenten 13 uitsluit. Bovendien, hoewel de opbrengst van thioglycollaat-opgewekte cellen van de peritoneale holte groter is vergeleken met die van muizenbloed, de zuiverheid van neutrofielen in de inflammatoire peritoneale lavage varieert60-90%, en de geïsoleerde neutrofielen vertonen een geactiveerde fenotype. Aldus, de cellen verzameld met deze methode alleen gebruikt voor het uitvoeren van functionele studies van geactiveerde, maar niet die van niet-gestimuleerde neutrofielen, zoals de muis peritoneale holte weinig neutrofielen bij het stationaire 12. In plaats daarvan, het beenmerg is handig reservoir voor het oogsten grote aantallen of ongestimuleerde of geactiveerde neutrofielen 11,14, die vervolgens kunnen worden gebruikt voor stroomafwaartse functionele studies zoals fagocytose en doden degranulatie of voor adoptieve overdracht in ontvangende muizen.
Een eenvoudige en snelle (~ 2 uur) protocol, dat een hoge opbrengst geeft Hierin beschrijven we (~ 6-12 x 10 6 cellen / geïnfecteerde muis of tot 30-40 x 10 6 cellen / geïnfecteerde muizen) zuiver (80 -95%) neutrofielen bij> 95% levensvatbaarheid van het beenmerg. Deze methode maakt gebruik van commercieel verkrijgbare Histopaque, die dichtheidsgradiënt cel separantsoen media bestaande uit Ficoll en natrium diatrizoaat te scheiden neutrofielen uit het beenmerg van muizen. Deze methode levert veel grotere aantallen neutrofielen per muis vergeleken met bloed of peritoneale holte, kan het worden gebruikt om neutrofielen ophalen muizen zowel steady state of na infectie, en het is gemakkelijker te laag ten opzichte van de dichtheidsgradiënt centrifugatie methode gebruikt discontinue Percoll gradiënt bestaande uit 55% / 65% / 75% Percoll in PBS 9. Bovendien worden de tijd en de middelen om pure neutrofielen verzamelen significant verlaagd vergeleken met neutrofiel isolatie met fluorescentie-geactiveerde celsortering. Ook, omdat deze methode geen sprake van een immuno verrijkingsstap is rendabeler en vermijdt de blootstelling van cellen aan de magnetische kolom en antilichamen, wordt de kans op neutrofiel activatie afneemt.
Naast het uitvoeren van functionele studies van geïsoleerde neutrophils ex vivo en adoptieve overdracht van cellen in de ontvangende muizen, dit protocol beschrijft ook een werkwijze voor het labelen van geïsoleerde neutrofielen met verschillende CellTracker kleurstoffen. Differentiële labeling van neutrofielen van muizen van verschillende genetische achtergronden kan worden aangepast in concurrerende herbevolking studies voor het bijhouden van de overgedragen neutrofielen in de weefsels van de ontvangende muizen met behulp van flowcytometrie, die mechanistisch inzicht kan verschaffen over de directe rol van specifieke genen in de handel van neutrofielen uit het bloed in doel ontstoken organen 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolatie van beenmergcellen van de muis
- Euthanaseren muizen met behulp van dierlijke zorg van de instelling commissie-goedgekeurde protocol en spuit het dier oppervlak met 70% ethanol.
- Maak een incisie van de huid in het midden van de buik en verwijder het vel van het distale deel van de muis met inbegrip van de huid die de onderste ledematen.
- Afgesneden van de spieren van de onderste ledematen met een schaar en zorgvuldig ontwrichten de heupkom van het heupgewricht, terwijl het vermijden van het breken van de femurkop.
- Verwijder de resterende spieren van het bovenbeen en onderbeen met behulp van een scalpel en schaar en scheiden het dijbeen van de tibia op het kniegewricht uitoefening zorg aan niet op het bot uiteinden breken. Plaats de botten in een petrischaal met ijskoude RPMI 1640 1X aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline / streptomycine.
- Ga verder met de volgende stappen onder een weefselkweek kap. Neem extra voorzorgsmaatregelen om strikte steriele technieken te behouden om neutrophi voorkomenl activatie.
- Spoel elk been met 70% ethanol (bij een petrischaal) gevolgd door drie opeenvolgende wasbeurten in ijskoud steriel PBS (binnen Petrischalen) te spoelen van de ethanol uit het oppervlak van de botten.
- Binnen een schone steriele petrischaal, afgesneden van de epifysen van de botten en houd ze apart.
- Gebruik een 25-gauge naald en een 12 cc spuit gevuld met RPMI gesupplementeerd met 10% FBS en 2 mM EDTA, en spoel de beenmergcellen van beide uiteinden van het bot assen op een schroefdop ml Falcon buis 50 voorzien van een 100 urn filteren. Om efficiënt alle cellen te verwijderen, schraap het binnenoppervlak van de botten met de 25-gauge naald.
OPMERKING: blancheren van botten geeft aan dat de cellen voldoende zijn geschraapt.
OPMERKING: Gebruik ongeveer 10 ml van de media om een femur / tibia paar spoelen. Het toevoegen van EDTA aan het medium essentiële klonteren van de cellen te voorkomen.
- Snijd het bot epifysenin kleine 0.5-1 mm 3 stuks met een scalpel en smash hen door de 100 um filter met behulp van de back-end van een 2,5 ml Eppendorf Combitip Plus Biopur pipet tip.
- Centrifugeer bij 1.400 rpm gedurende 7 minuten bij 4 ° C.
- Lyse de rode bloedcellen door resuspenderen de celpellet in 20 ml 0,2% NaCl gedurende ongeveer 20 seconden gevolgd door toevoeging van 20 ml 1,6% NaCl. (Kritiek: Neem niet meer dan 20-30 sec van hypotone lysis om beenmerg celdood te voorkomen Het gebruik van hypotone NaCl voor lysis wordt aanbevolen boven ACK lyseren buffer omdat de laatste heeft het potentieel om de neutrofielen te activeren.).
- Centrifugeer gedurende 7 minuten bij 1400 rpm bij 4 ° C om de cellen te verzamelen.
- Was de cellen met RPMI 1640 1X aangevuld met 10% FBS en 2 mM EDTA en gecentrifugeerd zoals in stap 1.12.
- De opbrengst van beenmergcellen met deze methode is ongeveer 60-80.000.000 per geïnfecteerde 8-12 weken oude C57BL / 6 muis.
2. Scheiding van neutrofielendoor dichtheidsgradiëntcentrifugatie
- Tel de beenmergcellen en opnieuw in suspensie in 1 ml ijskoude steriele PBS.
- Voeg 3 ml Histopaque 1119 (dichtheid, 1,119 g / ml) in een 15-ml conische buis.
- Overlay 3 ml Histopaque 1077 (dichtheid 1,077 g / ml) op de 3 ml Histopaque 1119.
OPMERKING: Histopaque 1119 en Histopaque 1077 dient te worden opgewarmd 18-26 C vóór gebruik °.
Critical Stap: Bereid gradiënten direct voor gebruik als werkvoorbereiding gradient vooraf leidt tot diffusie tussen de twee lagen en suboptimale neutrofielen zuiverheid en terugwinning.
Critical Stap: overlay Histopaque 1077 op 1119 moet langzaam gebeuren om te vermengen de twee dichtheden, welke cel separatie verhinderen tijdens het centrifugeren.
- Overlay het beenmerg celsuspensie bovenop Histopaque 1077.
Kritische stap: Overlaying het beenmerg celsuspensie op Histopaque 1077 moet langzaam gebeuren om te voorkomen dat verstoring van de interface tussen de cellen en Histopaque 1077.
Opmerking: Het mengen beenmergcellen uit een geïnfecteerde muizen in 1 ml PBS levert neutrofiel zuiverheid van> 90%. Echter, pooling veel beenmergmonsters compromitteert neutrofielen zuiverheid, bijvoorbeeld resuspenderen 300 x 10 6 cellen in 3 ml PBS vermindert neutrofielen zuiverheid van> 90% tot ~ 80%. Daarom moeten onderzoekers proefprojecten uit te voeren om de ideale celgetal / volume voorwaarden vaststellen voor hun specifieke experimenten
- Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 2000 rpm bij 25 ° C zonder rem.
OPMERKING: Centrifugeren van de gradiënt bij kamertemperatuur kritisch en essentieel voor effectieve scheiding van de neutrofielen.
- Verzamel de neutrofielen op het grensvlak van de Histopaque 1119 en Histopaque 1077 lagen. Was tweemaal de verzamelde neutrofielen met RPMI 1640 aangevuld met 1X 10% FBS en 1% penicilline / streptomycine en centrifugeer bij 1400 rpm gedurende 7 minuten bij 4 ° C.
- Tel de neutrofielen en bepalen hun levensvatbaarheid.
OPMERKING: Neutrofielen typisch> 95% levend en> 90% zuiver zoals bepaald door FACS-analyse. De typische opbrengst van neutrofielen uit het beenmerg (dwz 2 femur en tibia bot 2) van een niet-geïnfecteerde 8-12 weken oude C57BL / 6 muis ~ 6-12.000.000 cellen. Dit aantal is aanzienlijk groter wanneer neutrofielen geoogst uit beenmerg van geïnfecteerde dieren. Vandaar ~ 30-40000000 neutrofielen / muis werden teruggevonden bij Candida-geïnfecteerde muizen werden gebruikt voor mobiele oogsten 6.
3. Etikettering van neutrofielen gebruik CellTracker Kleurstoffen
- Resuspendeer de neutrofielen tot 5 x 10 6 cellen / ml in PBS voorverwarmd bij 37 ° C.
- Voeg een CellTracker kleurstof bij een uiteindelijke concentrantsoen van 5 uM.
OPMERKING: CellTracker Groen (CMFDA (5-Chloromethylfluorescein Diacetaat) en CellTracker Oranje (CMTMR (5 - (en-6)-4-Chloormethyl Benzoyl Amino tetramethylrhodamine) werd gebruikt in dit protocol om differentieel labelen neutrofielen van wild-type en gendeficiënte muizen.
OPMERKING: Bereid een voorraad oplossing van 10 mM van CellTracker Groen en CellTracker Orange, hoeveelheid, en bewaar bij -80 ° C tot de dag van het experiment.
- Incubeer neutrofielen met 5 uM van de overeenkomstige CellTracker kleurstof gedurende 10 min bij 37 ° C in een schuddend waterbad in het donker.
- Was de cellen tweemaal met ijskoude RPMI 1640 1X aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline / streptomycine.
OPMERKING: Efficiënte wassen van de cellen na het labelen stap met de CellTracker kleurstof is essentieel voor dye kruisbesmetting te vermijden alvorens te mengen differentieel-gelabelde neutrofielen bevolking voor downstream concurrerende herbevolking studies.
4. Adoptieve overdracht van neutrofielen in Muizen en analyse van Overgedragen Neutrophils Met behulp van flowcytometrie
- Resuspendeer neutrofielen in ijskoude PBS bij een concentratie van 25 x 10 6 cellen / ml en injecteer 200 ul van de suspensie in de laterale staartader zodat 5 x 10 6 neutrofielen per muis worden overgedragen. Voor een concurrentiegerichte herbevolking neutrofielen studies, meng wild-type en gendeficiënte neutrofielen op een 1:1 verhouding en injecteer een totaal van 5 x 10 6 neutrofielen per muis als hierboven.
Opmerking: In ieder geval tot 10 x 10 6 neutrofielen adoptief per muis worden overgedragen zonder duidelijke directe toxiciteit voor de dieren.
- Op verschillende tijdstippen na adoptieve overdracht (bijv. 1, 2, 3 of 4 uur na overdracht), euthanize muizen en oogsten bloed en / of beenmerg en / of andere doelorganen (s) plaats.
- Bereid single celsuspensies van deze weefsels voor de kwantitatieve en kwalitatieve analyse van adoptief overgedragen gelabelde neutrofielen behulp gepubliceerde protocollen 6,15.
- Naar aanleiding van levende / dode levensvatbaarheid kleuring en Fc blokkade, label cellen met CD45 (kloon 30-F11), Ly6G (kloon 1A8) en CD11b (kloon M1/70) en poort op live CD45 + Ly6G + CD11b + neutrofielen. Neutrofielen in deze poort bevatten ingebouwde neutrofielen van de ontvanger muis en de adoptief overgedragen gemerkte neutrofielen, die FITC + (indien gelabeld met CellTracker groen) of PE + (indien gelabeld met Cell Tracker Orange).
OPMERKING: Neutrofielen worden bijgehouden in bloed, beenmerg en nier van Candida-geïnfecteerde muizen gedurende tenminste 4 uur na overdracht.
OPMERKING: Bevestiging met 2% paraformaldehyde in PBS geen nadelige invloed op de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de neutrofielen gelabeld met CellTracker GrENL of CellTracker Oranje gedurende tenminste 48 uur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol is geoptimaliseerd voor de oogst van beenmergcellen van muizen en de daaropvolgende afscheiding van neutrofielen uit deze cellen door dichtheidsgradiënt centrifugatie met behulp van commercieel verkrijgbaar Histopaque cel scheidingsmedium. Neutrofielen geïsoleerd met behulp van deze methode kan worden gebruikt voor een verscheidenheid van stroomafwaartse functionele studies ex vivo en adoptieve overdrachtsexperimenten in ontvangende muizen.
De typische opbrengst van de collectie van beenmergcellen van beide dijbenen en scheenbeen per geïnfecteerde 8-12 weken oude C57BL / 6 muis is ~ 60-80000000 cellen met een levensvatbaarheid van ~ 94-98%. Downstream dichtheidsgradiënt centrifugatie van deze cellen met de Histopaque dichtheid scheidingsmedium levert waarschijnlijk ~ 6-12.000.000 neutrofielen per geïnfecteerde muis. Neutrofielen zijn 80-95% zuiver en> 95% levensvatbaar is bevestigd door flowcytometrie (figuur 1). Hoewel het mogelijk is om collectief beenmergcellen van verscheidene dieren vóór de dichtheidgradiënt centrifugatie stap pooling cellen enigszins vermindert de zuiverheid van de geïsoleerde neutrofielen. Bijvoorbeeld, terwijl overlappen 60-80.000.000 beenmergcellen ve geïnfecteerde muizen in 1-3 ml PBS opbrengst> 90% zuiver neutrofielen, de cel zuiverheid afneemt tot ~ 80% bij ~ 300.000.000 beenmergcellen elkaar samengevoegd in 3 ml PBS en overlay.
Bovendien, dit protocol beschrijft ook de stappen voor het naderhand coderen van neutrofielen met CellTracker kleurstoffen, die zorgt voor het volgen van de adoptief overgedragen cellen in ontvangende muizen met flowcytometrie. Labeling van neutrofielen met 5 pM CMFDA of CMTMR blijkt geen neutrofiel overleving beïnvloeden en gemerkte neutrofielen blijft> 95% levend (gegevens niet getoond). Gelabelde neutrofielen kunnen worden gevolgd in verschillende muisweefsels gedurende tenminste 4 uur na adoptieve overdracht met behulp van flowcytometrie door gating op live CD45 + Ly6G + CD11b +-cellen (Figuur 2).Het gebruik van differentiële labeling kleurstoffen in wildtype versus gendeficiënte neutrofielen in competitieve repopulatie studies maakt beoordeling van de directe rol van een specifiek gen (bijv. chemoattractant receptor 6) in de handel van neutrofielen uit het bloed in een bepaald doelorgaan.
Figuur 1. Representatieve FACS plot van geïsoleerde neutrofielen uit beenmergcellen van een niet-geïnfecteerde C57BL / 6 muis met de dichtheidsgradiënt centrifugatie protocol. Het linkerpaneel toont de initiële gating voor beenmergcellen vanuit het raakvlak van Histopaque 1119 en Histopaque 1077 met voor-en zijwaartse verstrooiing (FSC / SSC). Zoals getoond, neutrofielen verzameld van de interface zijn> 90% zuiver (middelste paneel) en> 95% levensvatbare (rechter paneel).
<img alt = "Figuur 2" src = "/ files/ftp_upload/50586/50586fig2.jpg" />
Figuur 2. Representatieve FACS plot van adoptief overgedragen CMTMR-gelabelde neutrofielen geoogst uit bloed, beenmerg en de nieren van een ontvanger Candida-infectie C57BL / 6 muis 4 hr volgende cel overdracht. De adoptief overgedragen CMTMR-gelabelde neutrofielen zijn PE-positief en kan worden onderscheiden van de inheemse neutrofielen van de ontvanger muis, die zijn PE-negatief. Merk op dat de expressie van CD 11 is groter in geoogst van de nieren ten opzichte geoogst uit bloed en beenmerg neutrofielen neutrofielen. De toename in expressie CD11b nier neutrofielen is consistent met eerdere resultaten 15 en waarschijnlijk wijst activatie van de cellen bij binnenkomst in de nier, hetgeen de belangrijkste doelorgaan in het muismodel van systemische candidiasis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hierin presenteren we een betrouwbaar, eenvoudig, snel en economisch protocol voor isolatie van grote aantallen van neutrofielen uit het beenmerg van muizen met een hoge zuiverheid en levensvatbaarheid met een dichtheidsgradiënt centrifugatie benadering. Wanneer dit protocol correct wordt uitgevoerd, kan ~ 6-12 × 10 6 neutrofielen worden verhaald op een niet-geïnfecteerde muizen en maar liefst ~ 30-40 × 10 6 neutrofielen kunnen worden geïsoleerd uit een muis na infectie 6. De geïsoleerde neutrofielen zijn 80-95% zuiver en> 95% haalbaar.
Beenmerg is een geschikt reservoir voor het verkrijgen van de muis neutrofielen voor downstream functionele studies en adoptieve overdracht experimenten. Ten eerste, het is eerder aangetoond dat het beenmerg neutrofielen zijn functioneel vergelijkbaar met bloed neutrofielen bij muizen als cellen uit beide compartimenten vertonen gelijkaardige oxidatieve uitbarsting en degranulatie 16. Ten tweede, hebben de muis beenmerg neutrofielen is aangetoond dat protr overlevengehandeld perioden in cultuur, significant langer in vergelijking met de muis bloedneutrofielen 16. Daarom is het oogsten van beenmerg dan bloedneutrofielen kan zorgen voor een grotere opbrengst van cellen wanneer verwerkt voor functionele assays ex vivo. Ten derde, isolatie van neutrofielen uit het beenmerg biedt het voordeel van het herstellen significant grotere aantallen neutrofielen, die voldoende voor downstream adoptieve overdrachtsexperimenten, zowel steady state en na infectie. In plaats daarvan kunnen aanzienlijk minder neutrofielen worden gewonnen uit muizen bloed, zelfs na infectie, en niet veel neutrofielen aanwezig in dynamisch evenwicht in de peritoneale holte zijn. Derhalve worden thioglycollaat of andere middelen gewoonlijk gebruikt om rekrutering van geactiveerde neutrofielen in het peritoneum te bevorderen, deze methode wordt belemmerd door de variabele zuiverheid van neutrofielen in de peritoneale acute inflammatoire exsudaat (ongepubliceerde gegevens niet getoond) en de inductie van een geactiveerde neutrofielen phenotype, die verschilt van die van niet-gestimuleerde neutrofielen vorderen gemanipuleerde muizen.
Verscheidene werkwijzen zijn beschikbaar voor het isoleren van neutrofielen uit het beenmerg van muizen. Deze omvatten (a) dichtheidsgradiënt centrifugatie nadert zoals de hier geïntroduceerde dat Histopaque dichtheid scheidingsmedium wordt gebruikt en een dergelijke werkwijze die discontinue Percoll gradiënten gebruikt 17 (b) positieve immunomagnetische selectie benaderingen waarbij beenmergcellen gelabeld met neutrophil-specifiek antilichaam zoals Ly6G en neutrofielen vervolgens verrijkt door binding van de Ly6G-positieve cellen op een magnetische kolom 18, (c) negatieve selectie immuno benaderingen waarbij beenmergcellen worden gelabeld met een cocktail van antilichamen die binden uitzondering van neutrofielen (bijvoorbeeld CD5 voor T lymfocyten, B-lymfocyten voor CD45R/B220, CD49b/DX5 NK cellen, CD117 voor mestcellen en hematopoietische stamcellen, F4/80 voor cellenmacrofagen en Ter119 voor erytrocyten) 11, en neutrofielen worden verrijkt door elutie als de antilichaam-negatieve fractie van cellen die niet bindt aan de magnetische kolom en (d) Fluorescence Activated Cell Sorting, waarbij beenmergcellen worden gelabeld met antistoffen die binden aan neutrofielen en andere cellen en neutrofielen worden vervolgens gescheiden met een Fluorescence Activated Cell Sorter als de cellen die positief zijn voor neutrofiel markers zoals de combinatie van Ly6G en CD11b.
Hoewel beide positieve immunomagnetische selectie benaderingen en Fluorescence Activated Cell Sorting bieden zeer hoge opbrengsten en zuiverheden van de muis neutrofielen, deze werkwijzen hebben het nadeel tegenover ons protocol dat labeling agents binden aan het oppervlak van neutrofielen, die mogelijk hun functie kunnen veranderen. Positieve immunomagnetische selectie benaderingen hebben de extra beperking dat antilichaam-gelabelde neutrofielen binden op een magnetische kolom voor separation, die ook kan beïnvloeden celfunctie. Fluorescence Activated Cell Sorting heeft als bijkomend nadeel dat significant langere tijd nodig voor het verzamelen van de cellen met behulp van een Fluorescence Activated Cell Sorter in een laboratorium kernfaciliteit, die overleving van neutrofielen vanwege hun korte halfwaardetijd nadelig kunnen beïnvloeden. De methode is vergelijkbaar met de dichtheidsgradiënt centrifugatie methode discontinue Percoll gradiënten gebruikt, maar de twee lagen Histopaque dichtheid scheidingsmedium is technisch minder uitdagend opzichte gelaagdheid van de Percoll gradiënt bestaande uit 55%, 65% en 75% vol / vol in PBS , waardoor vaak vermenging van de Percoll interfaces vanwege de kleine dichtheid tussen de drie lagen. Voor negatieve immunomagnetische selectie benaderingen, zijn ze ook gemeld betrouwbaar voor isolatie van grote aantallen functioneel bevoegde neutrofielen met hoge zuiverheid en levensvatbaarheid van beenmerg van muizen 11
Geïsoleerde neutrofielen gebruikmaking van de beschreven dichtheidsgradiënt centrifugeren methode kan worden gebruikt voor een verscheidenheid van stroomafwaartse functionele studies ex vivo zoals fagocytose, doden, chemotaxis, cytokineproductie, oxidatieve uitbarsting en degranulatie assays op basis van gepubliceerde protocollen 6. Daarnaast kunnen geïsoleerde neutrofielen zijnadoptief overgebracht naar ontvangende geïnfecteerde muizen de rol van neutrofielen transfer bij muis overleving en de effecten overgedragen neutrofielen op immunologische correlaten zoals cytokine productie op plaatsen van infectie in ontvangende muizen te evalueren. Daartoe Tosello Boari en collega adoptief overgebracht beenmergafgeleide neutrofielen in Trypasonoma-geïnfecteerde ontvangende muizen die down-gereguleerd IFN-γ productie in geïnfecteerde milt en lever en resulteerde in verbeterde overleving in een IL-10 afhankelijke wijze 19.
Bovendien is de mogelijkheid om neutrofielen met CellTracker kleurstoffen CMFDA en CMTMR labelen zonder zichtbare kleurstof-geïnduceerde afname in cellevensvatbaarheid biedt de gelegenheid om differentieel labelen neutrofielen van muizen van verschillende genetische achtergronden en volgen de adoptief overgedragen gelabelde cellen in verschillende muizen doelorganen middels stroming cytometrie of opklaren. De CellTracker kleurstoffen worden in viabl behoudene neutrofielen en niet verspreiden naar aangrenzende cellen. In onze studies gebruiken we een concentratie van 5 uM voor cel-etikettering en zijn we in staat om met succes te volgen gelabelde neutrofielen in het bloed, het beenmerg en de nieren van Candida-geïnfecteerde ontvangende muizen gedurende minstens 4 uur na neutrofielen overdracht 6. Naast CellTracker Groen en CellTracker Oranje, andere kleurstoffen zoals CellTracker Violet, CFSE en SNARF-1 zijn ook met succes gebruikt om het etiket muis beenmerg afgeleide neutrofielen voor adoptieve overdracht experimenten 11,19,20. Bovendien hebben de CellTracker groene en CellTracker Orange kleurstoffen daadwerkelijk gebruikt een vergelijkbare concentratie van 5 uM voor het labelen milt van de muis T cellen voor adoptieve overdracht en tracking experimenten 21. De mogelijkheid om differentieel labelen neutrofielen met diverse CellTracker kleurstoffen maakt het ontwerpen competitieve repopulatie experimenten waarbij een 1:1 verhouding van verschillend gemerkte neutrofielen van muizen met verschillendegenetische achtergronden kunnen adoptief worden overgebracht naar ontvangende muizen met als doel om de directe rol van specifieke genen te bepalen in de handel van neutrofielen uit het bloed in ontstoken weefsels. We hebben onlangs gemeld dat de chemokinereceptor CCR1 medieert transport van neutrofielen uit het bloed in Candida-geïnfecteerde nieren laat in het verloop van de infectie, waardoor excessieve accumulatie van neutrofielen in de nier, weefselbeschadiging en verminderde overleving 6.
Zoals bij elk protocol, onze methode heeft ook beperkingen. Bijvoorbeeld, ondanks de eerder genoemde voordelen van de oogst neutrofielen uit beenmerg meer bloed er opmerkelijke verschillen tussen neutrofielen verkregen uit deze twee compartimenten, die afhankelijk van de downstream onderzoek toepassing van de geoogste cellen invloed op de experimentele resultaten kan hebben. Concreet bloedneutrofielen zijn volwassen cellen, terwijl neutrofielen uit het beenmerg tegensist drie verschillende subpopulaties die variëren van onrijpe promyleocyten / myelocyten minder onrijpe metamyelocyten / band vormen om volwassen neutrofielen, zoals eerder beschreven 22. Derhalve kan het verschil in looptijd van cel beenmerg en bloed neutrofielen leiden tot variatie in bepaalde cel functionele eigenschappen eerder werd gerapporteerd voor neutrofiel respons op fMLF (N-formyl-methionyl-leucyl-fenylalanine) en inslikken van deeltjes 23. Bovendien, omdat elke neutrofielen manipulatie ex vivo kan leiden tot cel activatie en apoptose, is voorzichtigheid geboden bij het hanteren van de cellen tijdens gradiëntcentrifugatie. Bovendien, omdat de CellTracker kleurstoffen in concentraties hoger dan 5 pM nadelig kunnen beïnvloeden neutrofiele overleving van deze mogelijkheid in pilootexperimenten getest door individuele onderzoekers, afhankelijk van de stroomafwaartse functionele assay die wordt getest.
Kortom, wij prestuurde een betrouwbare en reproduceerbare methode die kan worden gebruikt door elk laboratorium te verzamelen en te etiketteren grote aantallen muis neutrofielen uit het beenmerg. Deze benadering kan worden gebruikt voor een verscheidenheid van functionele studies met neutrofielen in vivo adoptieve overdracht en tracking experimenten van flowcytometrie intravitale microscopie. Het gebruik van deze en van andere betrouwbare protocollen voor muis neutrofielen zuivering, isolatie, etikettering en downstream adoptieve overdracht en tracking studies moeten ons begrip van neutrofielen fysiologie verdiepen op het moleculaire niveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de afdeling Intramurale Onderzoek van het Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten (NIAID), National Institute of Health (NIH), USA.
Alle muizen werden gehandhaafd op een Amerikaanse Vereniging voor de Accreditatie van Laboratory Animal Care-geaccrediteerde dierfaciliteit bij het Nationale Instituut voor Allergie en Infectieziekten (NIAID) en gehuisvest in overeenstemming met de in de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren procedures onder de auspiciën van een protocol door de Animal Care en gebruik Comite van de NIAID goedgekeurd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | GemCell | 100500 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Quality Biological Inc | 351-027-101 | |
| 0.2% and 1.6% sodium chloride | JT Baker | 3624 | Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C-7025 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) | Invitrogen | C-2927 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
| Anti-mouse CD11b (Clone M1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | Use at 1:100 dilution |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Molecular Probes | L-23105 | Use at 1:1000 dilution |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils. | |||
| Materials | |||
| C57BL/6 mice | Taconic | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes (3 ml) | BD Falcon | 357575 | |
| 12 ml syringes | Kendall monoject | 512878 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 mm cell strainers | BD Falcon | 352360 | |
| Bactericidal Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
| Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
| Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel) | Biomedical Research Instruments | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | Instruments sterilized prior to use |
| Equipment | |||
| Tissue culture hood | The Baker Company | SG403 | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37 °C shaking water bath | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol. |
References
- Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22, 891-928 (2004).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu. Rev. Immunol. 30, 459-489 (2012).
- Blomgran, R., Ernst, J. D. Lung neutrophils facilitate activation of naive antigen-specific CD4+ T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. J. Immunol. 186 (12), 7110-7119 (2011).
- Narasaraju, T., Yang, E., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am. J. Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
- Lionakis, M. S., Fischer, B. G., et al. Chemokine receptor Ccr1 drives neutrophil-mediated kidney immunopathology and mortality in invasive candidiasis. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
- Cascão, R., Rosário, H. S., Souto-Carneiro, M. M., Fonseca, J. E. Neutrophils in rheumatoid arthritis: More than simple final effectors. Autoimmun. Rev. 9 (8), 531-535 (2010).
- Denny, M. F., Yalavarthi, S., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J. Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
- Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am. J. Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
- Hasenberg, M., Köhler, A., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).
- Gao, J. L., Lee, E. J., Murphy, P. M. Impaired antibacterial host defense in mice lacking the N-formylpeptide receptor. J. Exp. Med. 189 (4), 657-662 (1999).
- Pruijt, J. F., Verzaal, P., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (9), 6228-6233 (2002).
- Eash, K. J., Greenbaum, A. M., Gopalan, P. K., Link, D. C. CXCR2 and CXCR4 antagonistically regulate neutrophil trafficking from murine bone marrow. J. Clin. Invest. 120 (7), 2423-2431 (2010).
- Lionakis, M. S., Lim, J. K., Lee, C. C., Murphy, P. M. Organ-specific innate immune responses in a mouse model of invasive candidiasis. J. Innate. Immun. 3 (2), 180-199 (2011).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourié, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nüsse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J. Leukoc. Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
- Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J. Immunol. Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).
- Tosello Boari, J., Amezcua Vesely, M. C., et al. IL-17RA signaling reduces inflammation and mortality during Trypanosoma cruzi infection by recruiting suppressive IL-10-producing neutrophils. PLoS Pathog. 8 (4), e1002658 (2012).
- Hattori, H., Subramanian, K. K., et al. Small-molecule screen identifies reactive oxygen species as key regulators of neutrophil chemotaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (8), 3546-3351 (2010).
- Wan, W., Lionakis, M. S., Liu, Q., Roffê, E., Murphy, P. M. Genetic Deletion of Chemokine Receptor Ccr7 Exacerbates Atherogenesis in ApoE-deficient Mice. Cardiovasc. Res. 97 (3), 580-588 (2013).
- Ueda, Y., Kondo, M., Kelsoe, G. Inflammation and the reciprocal production of granulocytes and lymphocytes in bone marrow. J. Exp. Med. 201 (11), 1771-1780 (2005).
- Berkow, R. L., Dodson, R. W. Purification and functional evaluation of mature neutrophils from human bone marrow. Blood. 68 (4), 853-860 (1986).
