Summary
Nous décrivons un protocole pour l'isolement et la purification des neutrophiles de la moelle osseuse de souris par centrifugation de gradient de densité et de neutrophiles étiquetage utilisant des colorants CellTracker. Cela représente une méthode simple, rapide, reproductible et économique pour obtenir un grand nombre de neutrophiles pour des études fonctionnelles en aval ou des expériences de transfert et de suivi adoptifs.
Abstract
Les neutrophiles sont des cellules effectrices critiques du système immunitaire inné. Ils sont rapidement recrutés dans les sites d'inflammation aiguë et exercent des effets protecteurs ou pathogènes en fonction du milieu inflammatoire. Néanmoins, en dépit du rôle indispensable des neutrophiles dans l'immunité, la compréhension détaillée des facteurs moléculaires qui interviennent effets effectrices et immunopathogène de neutrophiles dans différentes maladies infectieuses et les affections inflammatoires qui manque encore, en partie en raison de leur courte demi-vie, les difficultés de manipulation de ces cellules et du manque de protocoles expérimentaux fiables pour obtenir un nombre suffisant de neutrophiles pour des études fonctionnelles en aval et des expériences de transfert adoptif. Par conséquent, des méthodes simples, rapides, économiques et fiables sont hautement souhaitables pour récolter un nombre suffisant de neutrophiles de souris pour évaluer les fonctions telles que la phagocytose, le meurtre, la production de cytokines, la dégranulation et la traite. À cette fin,Nous présentons une densité protocole centrifugation basée reproductible gradient, qui peut être adapté à n'importe quel laboratoire d'isoler un grand nombre de neutrophiles à partir de la moelle osseuse de souris avec une grande pureté et sa viabilité. En outre, nous présentons un protocole simple qui utilise des colorants CellTracker d'étiqueter les neutrophiles isolés, qui peuvent ensuite être adoptive transférés dans des souris receveuses et suivis dans plusieurs tissus pendant au moins 4 heures post-transfert en utilisant la cytométrie de flux. En utilisant cette approche, le différentiel étiquetage des neutrophiles des souris de type sauvage et le gène déficient avec différents colorants CellTracker peut être employée avec succès pour réaliser des études de repeuplement compétitifs pour évaluer le rôle direct de gènes spécifiques dans le trafic des neutrophiles dans le sang dans les tissus cibles in vivo .
Introduction
Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants chez les humains. Ils sont la principale composante cellulaire du système immunitaire inné et agissent comme première ligne de défense contre les micro-organismes envahisseurs. Les patients présentant une neutropénie acquise et immunodéficiences primaires qui affectent nombre de neutrophiles et / ou la fonction développent des infections bactériennes et fongiques invasives potentiellement mortelles, en soulignant l'importance de ces cellules en défense de l'hôte 1. Reconnaissance immunitaire des pathogènes envahissants sur le site de l'infection par leurs parentes de reconnaissance des formes récepteurs résulte en l'induction d'une orchestrée réponse immunitaire innée, ce qui conduit à une sécrétion de chemoattractants qui génèrent un gradient chimiotactique capable de recruter des neutrophiles de la circulation sanguine dans les tissus enflammés 2 . Après neutrophiles entrer dans le site de l'infection, ils deviennent activées, ce qui conduit à des cytokines et chimiokines production, l'absorption des agents pathogènes, et tuant par moi oxydative et non oxydativecanismes 3. Outre leur rôle bien connu dans l'immunité innée, neutrophiles ont également été montré récemment à jouer des rôles importants comme initiateurs de réponses immunitaires adaptatives efficaces 4. D'autre part, en dehors de leur rôle de protection de l'immunité, les neutrophiles peuvent également arbitrer des lésions tissulaires et immunopathologie due à l'accumulation excessive et / ou l'activation des sites d'inflammation, comme le montre une variété de maladies infectieuses et auto-immunes 5-7.
En dépit du rôle indispensable des neutrophiles dans le montage réponses immunitaires innées efficaces et leurs fonctions effectrices pléiotropiques dans plusieurs maladies infectieuses et les affections inflammatoires, les difficultés techniques avec la manipulation de ces cellules et l'absence de protocoles expérimentaux fiables a entravé la recherche avec des neutrophiles au cours des dernières décennies. Par conséquent, l'utilisation de tests reproductibles pour l'isolement des neutrophiles devrait faciliter la recherche sur médiée par les neutrophiles immunologiquesgique fonctions ex vivo et in vivo. A ce jour, plusieurs méthodes ont été décrites pour l'isolement de cellules neutrophiles telles que centrifugation en gradient de densité du sang humain et du sang de souris ou de moelle osseuse 8,9, enrichissement immunomagnétique positif ou négatif des neutrophiles à partir de sang de la souris ou de moelle osseuse 10,11, et la récolte des neutrophiles de la cavité péritonéale de souris après injection intrapéritonéale de thioglycollate ou d'autres agents anti-inflammatoires 12. Bien que les neutrophiles peuvent être facilement isolés en grand nombre à partir de sang humain, cette méthode n'est pas optimale chez la souris en raison du volume limité de sang de souris qui empêche l'isolement des neutrophiles suffisantes pour des études fonctionnelles ou des expériences de transfert adoptif 13. En outre, bien que le rendement de thioglycolate cellules de la cavité péritonéale est supérieure par rapport à celle du sang de la souris, la pureté des neutrophiles dans le lavage péritonéal inflammatoire varie entre60 à 90%, et les neutrophiles isolées présentent un phénotype activé. Ainsi, les cellules recueillies en utilisant cette méthode ne peut être utilisée pour effectuer des études fonctionnelles activé mais pas de neutrophiles non stimulés, comme la cavité péritonéale de souris a peu de neutrophiles à l'état stationnaire 12. Au lieu de cela, la moelle osseuse est un réservoir commode pour récolter un grand nombre de neutrophiles soit non stimulés ou activés 11,14, qui peuvent ensuite être utilisés pour des études fonctionnelles en aval tels que la phagocytose, le meurtre et la dégranulation, ou pour le transfert adoptif dans des souris receveuses.
Ici, nous décrivons un moyen simple et rapide (~ 2 h), ce qui présente un rendement élevé (~ 6-12 × 10 6 neutrophiles / souris non infectées, soit jusqu'à 30-40 × 10 6 neutrophiles / souris infectées) de pur (80 -95%) avec les neutrophiles> 95% la viabilité de la moelle osseuse. Cette méthode utilise Histopaque disponible dans le commerce, qui sont séparés densité cellulaire de gradientmédias de rations composées de Ficoll et diatrizoate de sodium, afin de séparer les neutrophiles de la moelle osseuse de souris. Cette méthode donne beaucoup plus grand nombre de neutrophiles par la souris par rapport au sang ou à cavité péritonéale, il peut être utilisé pour collecter des neutrophiles de souris à la fois à l'état d'équilibre ou après l'infection, et il est plus facile de couche par rapport à la méthode de centrifugation de gradient de densité qui utilise discontinue gradients de Percoll composé de 55% / 65% / 75% Percoll dans PBS 9. En outre, le temps et les ressources nécessaires pour recueillir les neutrophiles purs sont sensiblement diminué par rapport à l'isolement des neutrophiles par tri cellulaire activé par fluorescence. Aussi, parce que cette méthode n'implique pas une étape d'enrichissement immunomagnétique, il est plus rentable, et il évite l'exposition des cellules à la colonne magnétique et des anticorps, diminuant ainsi la probabilité d'activation des neutrophiles.
En plus d'effectuer des études fonctionnelles de neutroph isoléILS ex vivo et le transfert adoptif de cellules dans des souris receveuses, ce protocole décrit également un procédé de marquage des neutrophiles isolés à l'aide de différents colorants CellTracker. Différentiel étiquetage des neutrophiles des souris de diverses origines génétiques peut être adapté à des études de repeuplement compétitifs pour le suivi des neutrophiles transférés dans les tissus des souris receveuses par cytométrie en flux, qui peuvent fournir une approche mécanistique sur le rôle direct de gènes spécifiques dans le trafic des neutrophiles dans le sang en cibles organes enflammés 6.
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Protocol
1. Isolement de souris cellules de moelle osseuse
- Euthanasier les souris en utilisant le protocole de soin des animaux de l'institution comité approuvé et vaporiser la surface des animaux avec de l'éthanol à 70%.
- Faire une incision de la peau dans le milieu de l'abdomen et enlever la peau de la partie distale de la souris, y compris la peau qui recouvre les extrémités inférieures.
- Coupez les muscles des membres inférieurs à l'aide de ciseaux et disloquer soigneusement le cotyle de la hanche, tout en évitant de se casser la tête du fémur.
- Supprimer les muscles restants du fémur et le tibia à l'aide d'un scalpel, ciseaux et séparer le fémur du tibia au soin d'exercer l'articulation du genou pour ne pas casser les extrémités de l'os. Placez les os dans une boîte de Pétri contenant de la glace-froid RPMI 1640 1X supplémenté avec 10% de FBS et 1% de pénicilline / streptomycine.
- Procédez aux étapes suivantes sous une hotte de culture de tissus. Prendre des précautions supplémentaires pour maintenir techniques stériles strictes pour éviter neutrophil activation.
- Rincez chaque os avec de l'éthanol à 70% (dans une boîte de Pétri), suivie de trois lavages ultérieurs glacée PBS stérile (dans les boîtes de Pétri) pour se rincer l'éthanol à partir de la surface des os.
- L'intérieur d'une boîte de Pétri stérile propre, couper les épiphyses des os et garder de côté.
- Utiliser une aiguille de calibre 25 et une seringue de 12 cc remplie de RPMI complété avec 10% de FBS et 2 mM EDTA, et vider les cellules de moelle osseuse des deux extrémités des arbres d'os sur une vis en haut tube Falcon de 50 ml muni d'un 100 um filtrer. Afin d'éliminer efficacement toutes les cellules, gratter la surface interne de l'os à l'aide de l'aiguille de calibre 25.
NOTE: Le blanchiment des os indique que les cellules ont été suffisamment gratté.
Remarque: Utilisez environ 10 ml de milieu pour vider un fémur / tibia paire. Ajout d'EDTA au milieu est essentiel pour empêcher l'agglutination des cellules.
- Couper les épiphyses des osdans les petites 0,5-1 mm 3 pièces avec un scalpel et les écraser à travers le filtre 100 um en utilisant l'extrémité arrière d'une pointe de pipette Biopur ml Eppendorf Combitip Plus 2.5.
- Centrifuger à 1400 rpm pendant 7 min à 4 ° C.
- Lyse des globules rouges par la remise en suspension du culot cellulaire dans 20 ml de NaCl 0,2% pendant environ 20 secondes puis on ajoute 20 ml de NaCl 1,6%. (Critique: Ne pas dépasser 20-30 sec de lyse hypotonique pour éviter la mort des cellules de la moelle osseuse L'utilisation de hypotonique NaCl pour la lyse est recommandé au tampon de lyse ACK parce que ce dernier a la possibilité d'activer les neutrophiles.).
- Centrifuger pendant 7 min à 1400 rpm à 4 ° C à recueillir les cellules.
- Laver les cellules avec RPMI 1640 1X supplémenté avec 10% de FBS et 2 mM EDTA et centrifuger comme à l'étape 1.12.
- Le rendement des cellules de moelle osseuse à l'aide de cette méthode est d'environ 60 à 80 millions par infectées 8-12 semaines, âgé de souris C57BL / 6.
2. Séparation des neutrophilespar centrifugation en gradient
- Compter les cellules de la moelle osseuse et remettre en suspension dans 1 ml de PBS glacé stérile.
- Ajouter 3 ml de Histopaque 1119 (densité 1.119 g / ml) dans un tube conique de 15 ml.
- Overlay 3 ml de Histopaque 1077 (densité 1,077 g / ml) sur la 3 ml de Histopaque 1119.
NOTE: Histopaque 1119 Histopaque 1077 doivent être chauffés à 18-26 ° C avant utilisation.
Etape critique: Préparer gradients immédiatement avant l'utilisation que la préparation du gradient à l'avance se traduira par diffusion entre les deux couches et la pureté des neutrophiles optimale et la récupération.
Etape critique: Superposition Histopaque 1077 sur 1119 doit être fait lentement afin d'éviter le mélange des deux densités, ce qui empêchera la séparation des cellules pendant la centrifugation.
- Superposez la suspension de cellules de la moelle osseuse au-dessus de la Histopaque 1077.
Etape critique: Overlaying la suspension de cellules de la moelle osseuse au cours Histopaque 1077 doit être fait lentement, afin d'éviter de perturber l'interface entre les cellules et Histopaque 1077.
NOTE: La remise en suspension des cellules de moelle osseuse provenant d'une souris non infectées dans 1 ml de PBS donne la pureté de neutrophiles> 90%. Toutefois, la mise en commun de nombreux échantillons de moelle osseuse compromet la pureté des neutrophiles, par exemple, la remise en suspension 300 x 10 6 cellules dans 3 ml de PBS réduit la pureté des neutrophiles à partir de> 90% à environ 80%. Par conséquent, les enquêteurs devraient procéder à des expériences pilotes visant à identifier les comptage / volume conditions cellulaires idéales pour leurs expériences spécifiques
- Centrifugeuse pendant 30 min à 2000 rpm à 25 ° C sans frein.
NOTE: La centrifugation de gradient à la température ambiante est crucial et essentiel pour la séparation effective des neutrophiles.
- Recueillir les neutrophiles à l'interface de la Histopaque 1119 Histopaque 1077 couches. Laver les neutrophiles collectés deux fois avec RPMI 1640 1X supplémenté avec 10% de FBS et 1% de pénicilline / streptomycine et centrifuger à 1400 rpm pendant 7 min à 4 ° C.
- Comptez le nombre de neutrophiles et de déterminer leur viabilité.
NOTE: Les neutrophiles sont typiquement> 95% viable et pureté> 90%, tel que déterminé par analyse FACS. Le rendement typique des neutrophiles dans la moelle osseuse (soit 2 fémur et du tibia os 2) d'un non infecté 8-12 semaines, âgé de souris C57BL / 6 cellules est ~ 6 à 12 millions. Ce nombre est sensiblement plus grande lorsque les neutrophiles sont récoltées à partir de la moelle osseuse des animaux infectés. Par conséquent, ~ 30-40 millions de neutrophiles / souris ont été récupérés chez des souris infectées par Candida ont été utilisés pour la récolte de 6 cellules.
3. Étiquetage des neutrophiles utilisant des colorants CellTracker
- Reprendre les neutrophiles à 5 x 10 6 cellules / ml dans PBS préchauffé à 37 ° C.
- Ajouter un colorant CellTracker à une concent finaleration de 5 pm.
NOTE: CellTracker Green (CMFDA (5 Chloromethylfluorescein Diacetate) et CellTracker Orange (CMTMR (5 - (et-6)-4-Chlorométhyl tétraméthylrhodamine Amino benzoyle) a été utilisé dans ce protocole d'étiqueter différemment neutrophiles de type sauvage et le gène déficient souris.
NOTE: Préparer une solution stock de 10 mM de CellTracker vert et CellTracker Orange, aliquote et conserver à -80 ° C jusqu'à ce que le jour de l'expérience.
- Incuber neutrophiles avec 5 M de la teinture CellTracker correspondant pendant 10 min à 37 ° C dans un bain d'eau agité dans l'obscurité.
- Laver les cellules deux fois avec de la glace-froid RPMI 1640 1X supplémenté avec 10% de FBS et 1% de pénicilline / streptomycine.
NOTE: Un lavage efficace des cellules après l'étape de marquage avec du colorant CellTracker est essentielle pour éviter la contamination croisée colorant avant de mélanger les populations de neutrophiles différemment marquées pour dépréciationsétudes de repeuplement compétitifs tream.
4. Le transfert adoptif de neutrophiles chez la souris et analyse des neutrophiles transférés par cytométrie en flux
- Neutrophiles remettre en suspension dans PBS glacé à une concentration de 25 x 10 6 cellules / ml et injecter 200 pi de la suspension dans la veine caudale latérale de sorte que 5 x 10 6 neutrophiles sont transférés par souris. Pour les études concurrentielles de neutrophiles de repeuplement, mélanger neutrophiles de type sauvage et le gène déficient à un ratio de 1:1 et injecter un total de 5 x 10 6 neutrophiles par souris comme ci-dessus.
NOTE: Au moins jusqu'à 10 x 10 6 neutrophiles peuvent être adoptive transférés par souris sans toxicité évidente immédiate chez les animaux.
- À différents moments après le transfert adoptif (par exemple 1, 2, 3 ou 4 heures post-transfert), euthanasier les souris et du sang de récolte et / ou de la moelle osseuse et / ou un autre organe cible (s) d'intérêt.
- Préparer sisuspensions cellulaires NGLE de ces tissus pour l'analyse quantitative et qualitative des neutrophiles marquées par transfert adoptif utilisant des protocoles publiés 6,15.
- Après la coloration vivants / morts viabilité et le blocus Fc, les cellules d'étiquettes avec CD45 (clone 30-F11), Ly6G (clone 1A8) et CD11b (clone M1/70) et porte sur Live CD45 + Ly6G + CD11b + neutrophiles. Neutrophiles dans cette porte comprennent les neutrophiles natifs de la souris receveuse ainsi que les neutrophiles marquées par transfert adoptif, qui sont FITC + (si étiqueté avec CellTracker vert) ou PE + (si étiqueté avec la revue Cell Tracker orange).
NOTE: Les neutrophiles peuvent être suivis dans le sang, la moelle osseuse et les reins des souris infectées par Candida pendant au moins 4 heures post-transfert.
NOTE: Fixation avec 2% de paraformaldéhyde dans du PBS n'affecte pas l'intensité de fluorescence moyenne des neutrophiles marquées par Gr. CellTrackereen ou CellTracker orange pendant au moins 48 h.
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Representative Results
Ce protocole est optimisé pour la récolte de cellules de moelle osseuse de souris et la séparation subséquente des neutrophiles à partir de ces cellules par centrifugation de gradient de densité à l'aide de médias disponibles dans le commerce de séparation des cellules Histopaque. Neutrophiles isolés en utilisant cette méthode peut être utilisée pour une variété d'aval études fonctionnelles ex vivo et pour les expériences de transfert adoptif de souris receveuses.
Le rendement typique de la collecte de cellules de moelle osseuse du fémur et du tibia fois par semaine infecté 8-12 C57BL / 6 souris est de ~ 60 à 80 millions cellules avec une viabilité de ~ 94-98%. En aval centrifugation de gradient de densité de ces cellules en utilisant les médias de séparation par densité Histopaque donne typiquement ~ 6-12 millions de neutrophiles par souris non infectées. Les neutrophiles sont 80-95% pure et> 95% viable, comme vérifié par cytométrie de flux (Figure 1). Bien qu'il soit possible pour les cellules de la moelle osseuse de la piscine à partir de plusieurs animaux avant que la densitéétape de centrifugation de gradient, les cellules de mise en commun diminue légèrement la pureté des neutrophiles isolés. Par exemple, si la superposition de 60 à 80 millions de cellules de moelle osseuse provenant d'une souris non infectées dans 1-3 ml de rendements PBS> 90% de polynucléaires neutrophiles purs, la pureté de cellules diminue à environ 80% en environ 300 millions de cellules de moelle osseuse sont mis en commun à 3 ml de PBS et superposées.
En outre, ce protocole décrit également les étapes pour le repérage ultérieur de neutrophiles avec des colorants CellTracker, ce qui permet le suivi des cellules adoptive transférés dans des souris receveuses par cytométrie en flux. Étiquetage des neutrophiles avec 5 M de CMFDA ou CMTMR ne semble pas affecter la survie des neutrophiles comme les neutrophiles marqués restent> 95% viable (données non présentées). Neutrophiles marqués peuvent être suivis dans différents tissus de souris pendant au moins 4 heures après le transfert adoptif utilisant la cytométrie de flux par gating sur Live CD45 + Ly6G + CD11b + cellules (figure 2).L'utilisation de colorants d'étiquetage des différentiels dans les neutrophiles de type sauvage contre gène déficient dans les études de repeuplement concurrence permet une évaluation du rôle direct d'un gène spécifique (par exemple récepteur de chemoattractant 6) dans le trafic de neutrophiles dans le sang dans un organe cible donnée.
Figure 1. Représentative FACS parcelle de neutrophiles isolé à partir de cellules de la moelle osseuse d'une souris C57BL non infecté / 6 souris en utilisant le protocole de centrifugation en gradient de densité. La partie gauche montre le déclenchement initial utilisé pour les cellules de moelle osseuse recueillies à partir de l'interface de Histopaque 1119 et Histopaque 1077 à l'aide de l'avant et diffusion latérale (FSC / SSC). Comme on le voit, les neutrophiles recueillies à partir de l'interface sont> 90% (panneau du milieu) et> 95% viable (à droite).
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Figure 2. Représentant FACS parcelle de transfert adoptif CMTMR marqués neutrophiles récoltés dans le sang, la moelle osseuse et les reins d'un destinataire Candida infecté souris C57BL / 6 4 hr transfert de cellule suivante. Les neutrophiles CMTMR marqués par transfert adoptif sont PE-positive et peuvent être différenciés des les neutrophiles natifs de la souris receveuse, qui sont en PE-négatif. Notez que l'expression de CD11b est plus grande dans les neutrophiles récoltés dans le rein par rapport aux neutrophiles récoltés dans le sang et la moelle osseuse. L'augmentation de CD11b expression dans les neutrophiles du rein est cohérent avec les résultats précédents 15 et reflète vraisemblablement l'activation des cellules lors de l'entrée dans le rein, qui est le principal organe cible dans le modèle murin de candidose systémique.
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Discussion
Ici, nous présentons un protocole fiable, simple, rapide et économique pour l'isolement d'un grand nombre de neutrophiles dans la moelle osseuse de souris avec une grande pureté et de la viabilité en utilisant une approche de centrifugation de gradient de densité. Lorsque ce protocole est réalisé correctement, ~ 6-12 × 10 6 neutrophiles peuvent être récupérés à partir d'une souris non infectées et jusqu'à ~ 30-40 × 10 6 neutrophiles peuvent être isolés à partir d'une souris après l'infection 6. Les neutrophiles sont isolés 80-95% pure et> 95% viable.
La moelle osseuse est un réservoir approprié pour obtenir des neutrophiles de souris pour des études fonctionnelles en aval et des expériences de transfert adoptif. Tout d'abord, il a été précédemment montré que les neutrophiles de la moelle osseuse sont fonctionnellement similaires aux neutrophiles dans le sang chez la souris que les cellules des deux compartiments présentent une stimulation du métabolisme oxydatif et la dégranulation similaire 16. Deuxièmement, osseuse de souris neutrophiles de moelle ont été montré pour survivre protrpériodes agi de temps dans la culture, significativement plus longue par rapport aux souris neutrophiles sanguins 16. Par conséquent, la récolte de moelle osseuse sur des neutrophiles dans le sang pourrait permettre un meilleur rendement des cellules lorsqu'elles sont traitées pour des tests fonctionnels ex vivo. Troisièmement, l'isolement des neutrophiles dans la moelle osseuse offre l'avantage de récupérer beaucoup plus grand nombre de neutrophiles, qui sont suffisantes pour les expériences de transfert adoptif en aval, à la fois à l'état stable et après l'infection. Au lieu de cela, beaucoup moins de neutrophiles peuvent être récupérés à partir du sang de souris, même après l'infection, et pas beaucoup de neutrophiles sont présents à l'état stationnaire dans la cavité péritonéale. Ainsi, thioglycollate ou d'autres agents sont généralement utilisés pour promouvoir le recrutement des neutrophiles activés dans le péritoine, cette méthodologie est gênée par la pureté variable de neutrophiles au sein de l'exsudat inflammatoire aiguë péritonéale (données non publiées, non représenté) et l'induction d'une neutrophiles phenotyp activée, ce qui est différent de celui des neutrophiles non stimulés récupérés à partir de souris non manipulées.
Plusieurs méthodes sont disponibles pour l'isolement des neutrophiles de la moelle osseuse de souris. Ceux-ci comprennent: (a) un gradient de densité centrifugation approches telles que celle que nous présentons ici qui utilise les médias de séparation par densité Histopaque, et une méthodologie similaire qui utilise discontinue gradients de Percoll 17, (b) les approches de sélection immunomagnétiques positifs, au cours de laquelle les cellules de la moelle osseuse sont étiquetés avec un anticorps neutrophiles spécifique comme Ly6G, et les neutrophiles sont ensuite enrichie par la fixation des cellules Ly6G positifs sur une colonne magnétique 18, (c) les approches immunomagnétiques de sélection négative, au cours de laquelle les cellules de la moelle osseuse sont étiquetés avec un cocktail d'anticorps qui se lient sur des cellules autres que les neutrophiles (c.-à-CD5 des lymphocytes T, CD45R/B220 pour les lymphocytes B, les cellules NK pour CD49b/DX5, CD117 pour des mastocytes et des cellules souches hématopoïétiques, pour F4/80macrophages et Ter119 pour érythrocytes) 11, puis neutrophiles sont enrichies par élution la fraction négatifs en anticorps des cellules qui ne se lient pas sur la colonne magnétique, et (d) Fluorescence Activated Cell Sorting, au cours de laquelle les cellules de moelle osseuse sont marqués avec des anticorps qui se fixent sur les neutrophiles et d'autres cellules, et les neutrophiles sont ensuite séparés en utilisant un trieur de cellules à fluorescence que les cellules qui sont positives pour les marqueurs des neutrophiles comme la combinaison de Ly6G et CD11b.
Bien que les deux approches de sélection immunomagnétiques positifs et la fluorescence tri cellulaire activé offrent des rendements et de la pureté de neutrophiles de souris très élevés, ces méthodes ont l'inconvénient par rapport à notre protocole que les agents d'étiquetage se lient à la surface des neutrophiles, ce qui pourrait altérer leur fonction. Approches de sélection immunomagnétiques positifs ont la limitation supplémentaire anticorps marqués neutrophiles se fixent sur une colonne magnétique pour sa séparation, qui peuvent aussi affecter la fonction des cellules. Fluorescence tri cellulaire activé présente l'inconvénient supplémentaire que beaucoup plus de temps est nécessaire pour la collecte des cellules en utilisant un trieur de cellules à fluorescence dans une installation de base de laboratoire, ce qui peut nuire à la survie des neutrophiles en raison de leur courte demi-vie. Notre procédé est comparable au procédé de centrifugation à gradient de densité qui utilise des gradients de Percoll discontinu, mais superposition des deux milieux de séparation par densité Histopaque est techniquement beaucoup moins difficiles par rapport à la stratification des gradients de Percoll constitués de 55%, 65% et 75% v / v dans du PBS , ce qui se traduit souvent par mélange des interfaces de Percoll dus aux petites différences de densité entre les trois couches. En ce qui concerne les approches de sélection immunomagnétiques négatifs, ils ont également été signalés pour être fiables pour l'isolement d'un grand nombre de neutrophiles compétentes fonctionnellement avec une grande pureté et de la viabilité de la moelle osseuse de souris 11
Neutrophiles isolés à l'aide de la densité méthode de centrifugation de gradient décrit peut être utilisé pour une variété d'aval études fonctionnelles ex vivo tels que la phagocytose, le meurtre, la chimiotaxie, la production de cytokines, oxydative et tests de dégranulation utilisant publiée protocoles 6. En outre, les neutrophiles isolés peuvent êtreadoptive transférés dans des souris infectées bénéficiaires afin d'évaluer le rôle du transfert des neutrophiles sur la survie des souris et les effets de neutrophiles transférés sur les corrélats immunologiques tels que la production de cytokines dans les sites d'infection chez les souris receveuses. À cette fin, Tosello Boari et collègues transfert adoptif os des neutrophiles dérivées de la moelle dans les souris receveuses Trypasonoma-infectés, qui régulé à la baisse IFN-γ production dans la rate infectée et le foie et permis d'améliorer la survie d'une manière IL-10 dépendante 19.
En outre, la possibilité d'étiqueter neutrophiles avec le CellTracker colorants CMFDA et CMTMR sans diminution colorant induite apparent de la viabilité cellulaire offre la possibilité d'étiqueter différemment neutrophiles des souris de différentes origines génétiques et de suivre les cellules marquées par transfert adoptif dans différents organes cibles de la souris à l'aide de flux cytométrie ou microscopie intravitale. Les colorants CellTracker sont conservés dans viable neutrophiles et ne diffusent pas de cellules adjacentes. Dans nos études, nous utilisons une concentration de 5 M pour le marquage cellulaire et nous sommes en mesure de suivre avec succès neutrophiles marquées dans le sang, la moelle osseuse et les reins des souris receveuses Candida infectés pendant au moins 4 heures après le transfert des neutrophiles 6. Outre Green CellTracker et CellTracker Orange, d'autres colorants dont Violet CellTracker, CFSE et SNARF-1 ont également été utilisée avec succès pour étiquette osseuse de souris de neutrophiles dérivées de la moelle pour des expériences de transfert adoptif 11,19,20. En outre, le Green CellTracker et CellTracker colorants oranges ont été effectivement utilisé à une concentration similaire de 5 M pour l'étiquetage des cellules T spléniques de la souris pour le transfert adoptif et le suivi des expériences 21. L'aptitude à marquer de manière différentielle les neutrophiles avec divers colorants CellTracker permet de concevoir des expériences de repeuplement compétitives dans lequel un rapport de 1:1 de neutrophiles marquées de façon différentielle à partir de souris avec différentsorigines génétiques peuvent être adoptive transférés dans des souris receveuses dans le but de déterminer le rôle direct de gènes spécifiques dans le trafic des neutrophiles du sang vers les tissus enflammés. Nous avons récemment rapporté que le récepteur de chimiokine CCR1 médiateur traite des neutrophiles dans le sang dans les reins Candida infectées tardivement dans l'évolution de l'infection, qui se traduit par une accumulation excessive de neutrophiles dans le rein, des lésions tissulaires et une diminution de la survie 6.
Comme avec n'importe quel protocole, notre méthode a aussi ses limites. Par exemple, malgré les avantages précités de la récolte des neutrophiles de la moelle osseuse dans le sang, il ya des différences notables entre les neutrophiles obtenus à partir de ces deux compartiments, qui selon l'application de la recherche en aval des cellules récoltées pourraient avoir un impact sur les résultats expérimentaux. Plus précisément, les neutrophiles sanguins sont des cellules matures, alors que les neutrophiles des inconvénients de la moelle osseuseiste des trois sous-populations différentes qui vont de promyelocytes / myelocytes immatures métamyélocytes moins immatures / formulaires de bande pour les neutrophiles matures, comme décrit précédemment 22. Ainsi, la différence de maturité cellulaire entre la moelle osseuse et les neutrophiles sanguins pourrait entraîner des variations dans certaines caractéristiques fonctionnelles cellulaires comme il a été précédemment rapporté des réponses neutrophiles à fMLF (N-formylméthionyl-leucyl-phénylalanine) et l'ingestion de particules 23. En outre, parce que tout neutrophiles manipulation ex vivo pourrait entraîner une activation cellulaire et l'apoptose, la prudence est indispensable lors de la manipulation des cellules pendant la centrifugation de gradient. En outre, parce que les colorants CellTracker à des concentrations supérieures à 5 uM pourraient nuire à la survie des neutrophiles, cette possibilité devrait être testée dans des expériences pilotes par des chercheurs individuels, selon l'analyse fonctionnelle en aval qui sera testé.
En résumé, nous préenvoyé une méthode fiable et reproductible qui peut être utilisé par n'importe quel laboratoire de recueillir et de marquer un grand nombre de neutrophiles de souris à partir de la moelle osseuse. Cette approche peut être utilisée pour une variété d'études fonctionnelles des neutrophiles, notamment dans le transfert adoptif vivo et expériences de suivi par cytométrie en flux et microscopie intravitale. L'utilisation de ce et d'autres protocoles fiables pour la souris neutrophiles purification, l'isolement, l'étiquetage et le transfert adoptif en aval et des études de suivi devrait approfondir notre compréhension de la physiologie des neutrophiles au niveau moléculaire.
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Disclosures
Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Division de la recherche intra-muros de l'Institut national des maladies allergiques et infectieuses (NIAID), l'Institut National de la Santé (NIH), USA.
Toutes les souris ont été maintenus à une association américaine pour l'accréditation de l'animalerie accrédité par les soins des animaux de laboratoire à l'Institut national des maladies allergiques et infectieuses (NIAID) et logés conformément aux procédures décrites dans le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire sous les auspices d'un protocole approuvé par le soin des animaux et du Comité de l'utilisation du NIAID.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | GemCell | 100500 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Quality Biological Inc | 351-027-101 | |
| 0.2% and 1.6% sodium chloride | JT Baker | 3624 | Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C-7025 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) | Invitrogen | C-2927 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
| Anti-mouse CD11b (Clone M1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | Use at 1:100 dilution |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Molecular Probes | L-23105 | Use at 1:1000 dilution |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils. | |||
| Materials | |||
| C57BL/6 mice | Taconic | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes (3 ml) | BD Falcon | 357575 | |
| 12 ml syringes | Kendall monoject | 512878 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 mm cell strainers | BD Falcon | 352360 | |
| Bactericidal Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
| Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
| Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel) | Biomedical Research Instruments | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | Instruments sterilized prior to use |
| Equipment | |||
| Tissue culture hood | The Baker Company | SG403 | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37 °C shaking water bath | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol. |
References
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