Summary
Wir beschreiben ein Protokoll für die Isolierung und Reinigung von Neutrophilen aus Maus-Knochenmark durch Dichtegradientenzentrifugation und Neutrophilen-Kennzeichnung mit CellTracker Farbstoffe. Dies stellt eine einfache, schnelle, reproduzierbare und kostengünstige Methode zur Gewinnung einer großen Anzahl von Neutrophilen für nachgeschaltete funktionelle Studien oder Adoptiv-Transfer-und Tracking-Experimenten.
Abstract
Neutrophile sind kritische Effektorzellen des angeborenen Immunsystems. Sie werden sich schnell an den Standorten der akuten Entzündung rekrutiert und üben Schutz-oder pathogenen Wirkungen in Abhängigkeit von der entzündlichen Milieu. Dennoch ist trotz der unverzichtbaren Rolle von Neutrophilen in Immunität, detailliertes Verständnis der molekularen Faktoren, die Neutrophilen 'Effektor-und immunpathogenen Effekte in verschiedenen Infektionskrankheiten und entzündlichen Erkrankungen vermitteln noch fehlt, teils wegen ihrer kurzen Halbwertszeit, die Schwierigkeiten mit der Handhabung dieser Zellen und der Mangel an zuverlässigen experimentelle Protokolle für den Erhalt ausreichender Zahl von Neutrophilen für nachgeschaltete funktionelle Studien und adoptiven Transfer Experimente. Daher sind einfache, schnelle, kostengünstige und zuverlässige Methoden sehr wünschenswert für die Ernte eine ausreichende Zahl von Neutrophilen Maus für die Beurteilung Funktionen wie Phagozytose, Tötung, Zytokin-Produktion, Degranulation und Menschenhandel. Zu diesem ZweckWir stellen eine reproduzierbare Dichtegradientenzentrifugation-basiertes Protokoll, das in jedem Labor eine große Anzahl von Neutrophilen im Knochenmark von Mäusen mit hoher Reinheit und Lebensfähigkeit isolieren angepasst werden kann. Darüber hinaus präsentieren wir ein einfaches Protokoll, das CellTracker Farbstoffe verwendet, um die isolierte Neutrophile, die dann in adoptiv Empfängermäuse übertragen werden können und verfolgt in mehreren Geweben für mindestens 4 Stunden nach der Übertragung mittels Durchflusszytometrie zu beschriften. Mit diesem Ansatz können Differential Kennzeichnung von Neutrophilen von Wildtyp-und Gen-defizienten Mäusen mit verschiedenen CellTracker Farbstoffe erfolgreich eingesetzt werden, um wettbewerbsfähig Wiederbesiedlung Studien zur Bewertung der direkte Rolle von spezifischen Genen in Menschenhandel von Neutrophilen aus dem Blut in Zielgewebe in vivo durchführen .
Introduction
Neutrophile sind die häufigsten Leukozyten in den Menschen. Sie sind die wichtigsten zellulären Bestandteil des angeborenen Immunsystems und als erste Verteidigungslinie gegen eindringende Mikroorganismen. Patienten mit Neutropenie und erworbenen primären Immundefekten, die Neutrophilen Zahlen und / oder Funktion beeinflussen entwickeln lebensbedrohlicher invasiver Bakterien-und Pilzinfektionen, die Bedeutung dieser Zellen in Wirtsabwehr 1. Immune Anerkennung eindringende Pathogene am Ort der Infektion durch ihren verwandten Muster-recognition receptors Ergebnisse in der Induktion einer orchestrierten angeborenen Immunantwort, die Sekretion von Lockstoffe, die eine chemotaktische Gradienten in der Lage Recruiting Neutrophilen aus der Blutbahn in das entzündete Gewebe 2 Leads zu generieren . Nach Neutrophilen Ort der Infektion geben, sie aktiviert werden, führt das zu Zytokin-und Chemokin-Produktion, pathogen-Aufnahme, und die Tötung durch oxidative und nicht-oxidative michchanismen 3. Neben ihrer allgemein anerkannten Rolle in der angeborenen Immunität, haben Neutrophilen auch vor kurzem gezeigt, dass eine wichtige Rolle als Initiatoren der effektiven adaptive Immunantworten 4 spielen. Auf der anderen Seite, abgesehen von ihrer protektiven Immunität in Rollen kann auch Neutrophile vermitteln Gewebeverletzung und Immunpathologie durch übermäßige Akkumulation und / oder Aktivierung an entzündeten Stellen, wie sie in einer Vielzahl von Infektions-und Autoimmunerkrankungen 5-7 gezeigt.
Trotz der unverzichtbaren Rolle der Neutrophilen bei der Montage wirksam angeborenen Immunantwort und ihre pleiotropen Effektor-Funktionen in mehreren Infektionskrankheiten und Entzündungen, technische Schwierigkeiten mit der Handhabung dieser Zellen und der Mangel an zuverlässigen experimentelle Protokolle hat die Forschung mit neutrophilen Granulozyten in den letzten Jahrzehnten behindert. Daher sollte die Verwendung von reproduzierbaren Tests zur Isolierung von Neutrophilen weitere Forschung auf Neutrophilen-vermittelte Immunologie erleichterngischen Funktionen ex vivo und in vivo. Bisher wurden verschiedene Verfahren zur Isolierung von Neutrophilen wie Dichtegradientenzentrifugation von menschlichem Blut und Maus Blut oder Knochenmark 8,9, positive oder negative immunomagnetische Anreicherung von Neutrophilen Maus Blut oder Knochenmark 10,11 beschrieben wurde, und das Ernten von Neutrophilen aus der Peritonealhöhle von Mäusen nach intraperitonealer Injektion von Thioglycolat oder andere entzündungshemmende Mittel 12. Obwohl Neutrophilen kann leicht in großen Stückzahlen aus menschlichem Blut isoliert werden, ist diese Methode nicht optimal in den Mäusen infolge des geringen Volumens Mäuseblut die Isolierung von Neutrophilen ausreichend für funktionelle Studien oder adoptiven Transfer Experimente 13 ausschließt. Darüber hinaus, obwohl die Ausbeute an Thioglycolat-induzierte Zellen aus der Bauchhöhle größer ist verglichen mit der Maus Blut variiert die Reinheit von Neutrophilen in den entzündlichen Peritoneallavage zwischen60-90%, und die isolierten Neutrophilen zeigen einen aktivierten Phänotyp. Somit erfasst die Zellen unter Verwendung dieses Verfahren nur zur Durchführung funktionelle Untersuchungen aktivierten verwendet werden, nicht aber von nicht stimulierten Neutrophilen, die Maus Bauchhöhle wenigen Neutrophilen im stationären Zustand 12. Stattdessen wird das Knochenmark ein bequemer Reservoir für die Ernte eine große Zahl von entweder stimulierten oder aktivierten Neutrophilen 11,14, die dann stromabwärts funktionellen Studien wie Phagozytose Tötung und Degranulation oder für die adoptive Transfer in Empfänger-Mäuse verwendet werden.
Hier beschreiben wir eine einfache und schnelle (~ 2 Stunden)-Protokoll, das eine hohe Ausbeute liefert (~ 6-12 × 10 6 Neutrophile / infizierten Maus oder bis zu 30-40 × 10 6 Neutrophile / infizierten Maus) reines (80 -95%) Neutrophilen mit> 95% Rentabilität aus dem Knochenmark. Diese Methode verwendet handelsübliche Histopaque, die Dichtegradienten Zelle getrennt sindRation Medien aus Ficoll und Natriumdiatrizoat, an Neutrophile aus dem Knochenmark von Mäusen zu trennen. Dieses Verfahren ergibt wesentlich größere Anzahl von Neutrophilen pro Maus im Vergleich zu Blut oder Bauchhöhle, kann es verwendet werden, um Neutrophile von Mäusen sowohl im stationären Zustand oder nach der Infektion gesammelt werden, und es ist einfacher zu Schicht im Vergleich zu der Dichtegradientenzentrifugation Verfahren die diskontinuierliche verwendet Percoll Gradienten, bestehend aus 55% / 65% / 75% Percoll in PBS 9. Darüber hinaus werden die Zeit und die Ressourcen, die zur reinen Neutrophilen sammeln signifikant im Vergleich zu Neutrophilen Trennung mittels Fluorescence-Activated Cell Sorting verringert. Da auch dieses Verfahren nicht auf einer immunomagnetischen Anreicherungsschritt ist es kostengünstiger und vermeidet die Exposition von Zellen gegenüber der magnetischen Spalte und Antikörper, dh verringert die Wahrscheinlichkeit der Aktivierung von Neutrophilen.
Zusätzlich zur Durchführung funktionelle Studien an isolierten neutrophils ex vivo und adoptiven Transfer von Zellen in Empfängermäuse, dieses Protokoll beschreibt auch ein Verfahren zur Kennzeichnung von isolierten Neutrophilen mit verschiedenen CellTracker Farbstoffe. Differential Kennzeichnung von Neutrophilen von Mäusen verschiedener genetischer Hintergründe können im Leistungssport Wiederbesiedlung Studien für die Verfolgung der übertragenen Neutrophilen im Gewebe des Empfängers Mäusen mittels Durchflusszytometrie, die mechanistischen Einblick in die direkte Rolle bestimmter Gene kann in Menschenhandel von Neutrophilen aus dem Blut angepasst werden Ziel in entzündeten Organen 6.
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Protocol
1. Isolierung von Knochenmarkszellen der Maus
- Euthanize Mäusen unter Verwendung des Organs Tierpflege-Ausschuss genehmigten Protokoll und sprühen das Tier Oberfläche mit 70% Ethanol.
- Einen Einschnitt der Haut in der Mitte des Bauches und entfernen Sie die Haut von dem distalen Teil der Maus, einschließlich der Haut, welche die unteren Extremitäten.
- Schneiden Sie die Muskeln der unteren Extremitäten mit einer Schere und sorgfältig verrücken die Pfanne aus dem Hüftgelenk, bei gleichzeitiger Vermeidung Brechen des Femurkopfes.
- Entfernen Sie die restlichen Muskeln aus dem Oberschenkel und Schienbein mit einem Skalpell und Schere und trennen Sie die Oberschenkelknochen von der Tibia im Kniegelenk Ausübung Sorgfalt nicht brechen die Knochen endet. Legen Sie die Knochen in eine Petrischale mit eiskaltem RPMI 1640 1X mit 10% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin.
- Fahren Sie mit den folgenden Schritten unter einer Gewebekultur Kapuze. Nehmen Sie zusätzliche Vorsichtsmaßnahme strengen sterilen Techniken zu halten, um zu vermeiden neutrophil Aktivierung.
- Spülen Sie jede Knochen mit 70% Ethanol (in einer Petrischale) durch drei nachfolgenden Wäschen in eiskaltem sterilem PBS (in Petrischalen) abzuspülen das Ethanol von der Oberfläche der Knochen gefolgt.
- Innerhalb einer sauberen sterilen Petrischale, schneiden Sie die Epiphysen der Knochen und halten Sie sie beiseite.
- Verwenden Sie eine 25-Gauge-Nadel und eine 12-ml-Spritze mit RPMI mit 10% FBS und 2 mM EDTA ergänzt gefüllt und bündig die Knochenmarkzellen von beiden Enden der Knochen Wellen auf einem 50 ml Falcon-Röhrchen mit Schraubverschluss mit 100 um ausgestattet filtern. Um effizient zu entfernen alle Zellen, kratzen die innere Oberfläche des Knochens unter Verwendung des 25-Gauge-Nadel.
HINWEIS: Blanchieren der Knochen zeigt, dass die Zellen wurden ausreichend abgeschabt.
HINWEIS: Verwenden Sie ca. 10 ml Medium, um einen Oberschenkelknochen / Paar Schienbein zu spülen. Hinzufügen von EDTA zu dem Medium ist wichtig, um zu verhindern Verklumpung der Zellen.
- Schneiden Sie die Knochen Epiphysenin kleinen 0,5-1 mm 3 Stück mit einem Skalpell und zerschlagen sie durch die 100 um-Filter mit dem Back-End einer 2,5 ml Eppendorf Combitip plus Biopur Pipettenspitze.
- Zentrifuge bei 1.400 rpm für 7 min bei 4 ° C.
- Lyse der roten Blutkörperchen durch das Zellpellet in 20 ml 0,2% NaCl für etwa 20 Sekunden, gefolgt von der Zugabe von 20 ml 1,6% NaCl. (Critical: Überschreiten Sie nicht 20-30 sec von hypotonen Lyse Knochenmark Zelltod zu vermeiden Der Einsatz von hypotonen NaCl zur Lyse über ACK Lysepuffer wird empfohlen, da die letzteren hat das Potenzial, um die Neutrophilen zu aktivieren.).
- Zentrifuge für 7 min bei 1.400 rpm bei 4 ° C zu sammeln die Zellen.
- Waschen der Zellen mit RPMI 1640 1x mit 10% FBS und 2 mM EDTA supplementiert und Zentrifuge in Schritt 1.12.
- Die Ausbeute von Knochenmarkzellen mit dieser Methode ist etwa 60 bis 80.000.000 pro infizierten 8-12 Wochen alte C57BL / 6 Maus.
2. Trennung von Neutrophilendurch Dichtegradientenzentrifugation
- Zählen Sie die Knochenmarkszellen und resuspendieren in 1 ml eiskaltem sterilem PBS.
- 3 ml Histopaque 1119 (Dichte, 1.119 g / ml) in einem 15-ml konischen Röhrchen.
- Overlay 3 ml Histopaque 1077 (Dichte 1,077 g / ml) auf die 3 ml Histopaque 1119.
HINWEIS: Histopaque 1119 und 1077 Histopaque sollte auf 18-26 ° C erwärmt werden vor der Verwendung.
Critical Schritt: Bereiten Gradienten unmittelbar vor der Verwendung als Vorbereitung der Gradient im Voraus in Diffusion zwischen den beiden Schichten und suboptimale Neutrophilen Reinheit und Erholung führen.
Critical Schritt: Überlagerung Histopaque 1077 über 1119 muss langsam erfolgen, um zu vermeiden, das Mischen der beiden Dichten, die Trennung von Zellen während der Zentrifugation wird ausgeschlossen.
- Overlay das Knochenmark Zellsuspension auf der Oberseite des Histopaque 1077.
Critical Schritt: OverlAying das Knochenmark Zellsuspension über Histopaque 1077 muss langsam erfolgen, um zu verhindern, daß die Schnittstelle zwischen den Zellen und Histopaque 1077.
Hinweis: Das Resuspendieren Knochenmarkzellen von einem nicht infizierten Maus in 1 ml PBS ergibt Neutrophilen Reinheit von> 90%. Allerdings Bündelung viele Knochenmarkproben beeinträchtigt Neutrophilen Reinheit, beispielsweise Resuspendieren 300 x 10 6 Zellen in 3 ml PBS verringert die neutrophile Reinheit von> 90% auf ca. 80%. Daher sollten Ermittler führen Pilotversuche, um die idealen Zellzahl / Volumen Bedingungen für ihre spezifische Experimente identifizieren
- Zentrifuge für 30 min bei 2.000 rpm bei 25 ° C ohne Bremse.
Hinweis: Zentrifugation der Gradienten bei Raumtemperatur ist kritisch und notwendig für eine effektive Trennung der Neutrophilen.
- Sammeln der Neutrophilen an der Grenzfläche des Histopaque 1119 und 1077 HISTOPAQUE Schichten. Waschen Sie die gesammelten Neutrophilen zweimal mit RPMI 1640 1X mit 10% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin und Zentrifuge bei 1.400 rpm für 7 min bei 4 ° C ergänzt
- Zählen Sie die Neutrophilen und bestimmen ihre Lebensfähigkeit.
HINWEIS: Neutrophile sind typischerweise> 95% lebensfähig und> 90% rein, wie durch FACS-Analyse bestimmt. Die typische Ausbeute von Neutrophilen aus dem Knochenmark (dh 2 Femur und Tibia 2 Knochen) von einem nicht infizierten 8-12 Wochen alte C57BL / 6 Maus ~ 6-12.000.000 Zellen. Diese Zahl ist wesentlich größer als Neutrophilen aus dem Knochenmark von infizierten Tieren geerntet. Daher wurden ~ 30-40000000 Neutrophilen / Maus erholt, als Candida-infizierten Mäusen für Zellernte 6 verwendet wurden.
3. Markierung von Neutrophilen Mit CellTracker Dyes
- Resuspendieren der Neutrophilen bei 5 x 10 6 Zellen / ml in PBS vorgewärmt auf 37 ° C.
- Fügen Sie einen CellTracker Farbstoff bei einer abschließenden concentration von 5 um.
HINWEIS: CellTracker Green (CMFDA (5-Chlormethylfluorescein Diacetate) und CellTracker Orange (CMTMR (5 - (und-6)-4-Amino Chloromethyl Benzoyl Tetramethylrhodamine) wurde in diesem Protokoll verwendet werden, um unterschiedlich beschriften Neutrophilen von Wildtyp-und Gen-defizienten Mäusen.
HINWEIS: Bereiten Sie eine Stammlösung von 10 mM CellTracker Grüne und CellTracker Orange Aliquot, und bei -80 ° C bis zu dem Tag des Experiments.
- Inkubieren Neutrophilen mit 5 uM des entsprechenden CellTracker Farbstoff für 10 min bei 37 ° C in einem Schüttelwasserbad bei Dunkelheit.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem RPMI 1640 1X mit 10% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin.
HINWEIS: Efficient Waschen der Zellen nach der Markierung mit dem Schritt CellTracker Farbstoff ist wichtig, Farbstoff Kreuzkontamination vor dem Mischen unterschiedlich markierten Neutrophilen für Tiefen vermeidentream wettbewerbsfähig Wiederbesiedlung Studien.
4. Adoptiven Transfer von Neutrophilen in Mice and Analysis der übertragenen Neutrophile mittels Durchflusszytometrie
- Resuspendieren Neutrophilen in eiskaltem PBS in einer Konzentration von 25 x 10 6 Zellen / ml und injizieren 200 ul der Suspension in die laterale Schwanzvene so, dass 5 x 10 6 Neutrophile pro Maus übertragen werden. Aus Wettbewerbsgründen Wiederbesiedlung Neutrophilen Studien, mischen Wildtyp-und Gen-defizienten Neutrophilen im Verhältnis 1:1 und injizieren insgesamt 5 x 10 6 Neutrophile pro Maus wie oben.
HINWEIS: Mindestens bis zu 10 x 10 6 Neutrophilen kann adoptiv pro Maus ohne offensichtliche Toxizität sofort zu den Tieren übertragen.
- Zu verschiedenen Zeiten nach adoptiven Transfer (z. B. 1, 2, 3 oder 4 Stunden nach der Übertragung), einschläfern Mäusen und Ernte Blut und / oder Knochenmark und / oder anderen Zielorgan (e) von Interesse.
- Bereiten single Zellsuspensionen aus diesen Geweben für die quantitative und qualitative Analyse der adoptiv übertragen markierten Neutrophilen mit veröffentlichten Protokollen 6,15.
- Nach Live / Dead-Färbung und Lebensfähigkeit Fc Blockade, Label-Zellen mit CD45 (Klon 30-F11), Ly6G (Klon 1A8) und CD11b (Klon M1/70) und Tor auf Live-CD45 + CD11b + + Ly6G Neutrophilen. Neutrophile in diesem Tor umfassen nativen neutrophilen Granulozyten des Empfängers Maus sowie die adoptiv übertragen markierten Neutrophilen, die FITC + (wenn mit CellTracker Grün markiert) oder PE + (wenn mit den Cell Tracker orange markiert) sind.
HINWEIS: Neutrophile können in Blut, Knochenmark und Nieren von Candida-infizierten Mäusen für mindestens 4 Stunden nach der Übertragung verfolgt werden.
Hinweis: Befestigung mit 2% Paraformaldehyd in PBS nicht nachteilig auf die mittlere Fluoreszenzintensität der Neutrophilen mit CellTracker Gr markierteneen oder CellTracker orange für mindestens 48 Stunden.
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Representative Results
Dieses Protokoll ist für die Ernte von Knochenmarkszellen von Mäusen und die anschließende Trennung von Neutrophilen aus diesen Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation mit handelsüblichen Histopaque Zellseparation Medien optimiert. Neutrophile isoliert mit dieser Methode kann für eine Vielzahl von nachgelagerten funktionelle Studien ex vivo und für adoptiven Transfer Experimente in Mäusen Empfänger verwendet werden.
Die typische Ausbeute der Sammlung von Knochenmarkzellen aus beiden Oberschenkelknochen und Schienbein pro infizierten 8-12 Wochen alte C57BL / 6 Maus ist ~ 60-80000000 Zellen mit einer Tragfähigkeit von ca. 94-98%. Downstream Dichtegradientenzentrifugation dieser Zellen mit den Histopaque Dichte Trennmedien ergibt typischerweise ~ 6-12.000.000 Neutrophilen pro infizierten Maus. Neutrophile sind 80-95% rein und> 95% lebensfähig, wie mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 1) bestätigt. Obwohl es möglich ist, zu bündeln Knochenmarkzellen von mehreren Tieren vor der DichteGradientenzentrifugation Schritt Pooling Zellen leicht verringert die Reinheit der isolierten Neutrophilen. Zum Beispiel, während die Überlagerung 60-80.000.000 Knochenmarkzellen von einem infizierten Maus in 1-3 ml PBS Ausbeuten> 90% rein Neutrophilen, verringert sich die Zelle Reinheit ~ 80% bei ~ 300 Millionen Knochenmarkzellen zusammen sind in 3 zusammengefasst ml PBS und überlagert.
Darüber hinaus ist dieses Protokoll auch beschreibt die Schritte zur nachträglichen Beschriftung von Neutrophilen mit CellTracker Farbstoffe, die für die Verfolgung der adoptiv transferierten Zellen in Empfängermäuse mittels Durchflusszytometrie erlaubt. Markierung von Neutrophilen mit 5 uM CMFDA oder CMTMR scheint nicht Neutrophilen Überleben beeinflussen wie beschriftet Neutrophilen bleiben> 95% lebensfähig (Daten nicht gezeigt). Beschriftet Neutrophilen kann in verschiedenen Geweben der Maus für mindestens 4 Stunden nach adoptiven Transfer mittels Durchflusszytometrie durch Gating auf live verfolgt werden CD45 + CD11b + + Ly6G Zellen (Abbildung 2).Der Einsatz von Differential Markierungsfarbstoffe in Wildtyp-Gen-defizienten gegenüber Neutrophilen im Leistungssport Wiederbesiedlung Studien ermöglicht die Beurteilung der direkte Rolle eines bestimmten Gens (zB chemoattractant receptor 6) in den Handel von Neutrophilen aus dem Blut in einem bestimmten Organ.
Abbildung 1. Repräsentative FACS Grundstück von isolierten Neutrophilen aus dem Knochenmark Zellen eines infizierten C57BL / 6 Maus mit Hilfe der Dichtegradientenzentrifugation Protokoll. Die linke Tafel zeigt die anfängliche Gating für die Knochenmark-Zellen aus der Schnittstelle von Histopaque 1119 und 1077 gesammelt Histopaque verwendet mit Vorwärts-und Seitwärtsstreuung (FSC / SSC). Wie gezeigt, sind Neutrophile aus dem Interface gesammelt> 90% (Mitte) und> 95% lebensfähig (rechtes Bild).
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Abbildung 2. Repräsentative FACS Grundstück von adoptiv übertragen CMTMR-markierten Neutrophilen aus Blut, Knochenmark und Nieren von einem Empfänger Candida-infizierten C57BL / 6 Maus 4 hr folgende Zelltransfer geerntet. Die adoptiv übertragen CMTMR-markierten Neutrophilen sind PE-positive und kann von unterschieden werden die einheimischen Neutrophilen des Empfängers Maus, die PE-negativ sind. Beachten Sie, dass die Expression von CD11b größer in Neutrophilen aus der Niere im Vergleich zu Neutrophilen aus dem Blut und Knochenmark geerntet ist. Der Anstieg der CD11b-Expression in Niere Neutrophilen steht im Einklang mit früheren Ergebnissen 15 und spiegelt wahrscheinlich die Aktivierung der Zellen bei der Einreise in die Niere, die das wichtigste Organ im Mausmodell der systemischen Candidiasis ist.
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Discussion
Hier präsentieren wir eine zuverlässige, einfach, schnell und wirtschaftlich-Protokoll für die Isolierung einer großen Zahl von Neutrophilen aus dem Knochenmark von Mäusen mit hoher Reinheit und Lebensfähigkeit mit einer Dichtegradientenzentrifugation Ansatz. Wenn dieses Protokoll korrekt durchgeführt wird, kann ~ 6-12 × 10 6 Neutrophile von einer nicht infizierten Maus gewonnen werden und bis zu ~ 30-40 × 10 6 Neutrophilen kann aus einer Maus nach der Infektion 6 isoliert werden. Die isolierten Neutrophilen sind 80-95% rein und> 95% lebensfähig.
Das Knochenmark ist ein geeignetes Reservoir für den Erhalt von Neutrophilen Maus für nachgeschaltete funktionelle Studien und adoptiven Transfer Experimente. Zuerst wurde zuvor gezeigt, dass Knochenmark Neutrophilen funktionell ähnlich Neutrophilen bei Mäusen als Zellen von beiden Kammern ähnlich oxidativen Burst und Degranulation 16 aufweisen. Zweitens haben Mausknochenmark Neutrophilen gezeigt worden, um zu überleben protrgehandelt Zeiträume in Kultur, deutlich mehr auf Maus-Neutrophilen 16 verglichen. Daher könnte die Ernte von Knochenmark über Blut Neutrophilen für größere Ausbeute an Zellen, wenn sie für funktionelle Assays ex vivo verarbeitet zu ermöglichen. Drittens Isolierung von Neutrophilen aus dem Knochenmark bietet den Vorteil der Rückgewinnung erheblich größere Anzahl von Neutrophilen, die ausreicht, um stromabwärts adoptiven Transfer Versuchen sowohl im stationären Zustand und nach der Infektion sind. Stattdessen können wesentlich weniger Neutrophile aus Maus-Blut gewonnen werden, auch nach der Infektion, und nicht viele Neutrophile vorhanden sind in einem stabilen Zustand in der Bauchhöhle. Somit werden Thioglycolat oder andere Mittel üblicherweise verwendet, um Rekrutierung von aktivierten neutrophilen Granulozyten in das Peritoneum zu fördern, diese Methode durch die Variable Reinheit von Neutrophilen im peritonealen Exsudat akuten entzündlichen (unveröffentlichte Daten nicht gezeigt) und die Induktion einer aktivierten Neutrophilen Phänotyp behinderte, die sich von derjenigen der nicht stimulierten Neutrophilen manipulierte Mäuse gewonnen wird.
Mehrere Methoden stehen zur Verfügung für die Isolierung von Neutrophilen aus dem Knochenmark von Mäusen. Dazu gehören (a) Dichtegradientenzentrifugation wie die, die wir hier präsentieren, die Histopaque Dichtetrennung Medien nutzt, und eine ähnliche Methode, die diskontinuierliche Percoll Gradienten verwendet 17, (b) positive immunomagnetische Auswahl Ansätze, bei denen Knochenmarkzellen sind beschriftet mit nähert Neutrophilen-spezifischen Antikörper wie Ly6G und Neutrophilen werden dann durch Bindung der Ly6G-positiven Zellen auf einer magnetischen Spalte 18, angereichert (c) negative Selektion immunomagnetischen Ansätze, bei denen Knochenmarkzellen mit einem Cocktail von Antikörpern markiert sind, die binden auf andere Zellen als Neutrophilen (dh CD5 für T-Lymphozyten, B-Lymphozyten für CD45R/B220, CD49b/DX5 für NK-Zellen, CD117 für Mastzellen und hämatopoetischen Stammzellen für F4/80Makrophagen und Ter119 für Erythrozyten) 11, und Neutrophile werden durch Elution wie der Antikörper-negativen Fraktion von Zellen, die nicht auf die magnetische Säule bindet angereichert ist, und (d) Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung, bei der Knochenmark-Zellen mit Antikörpern markiert dass bind auf Neutrophilen und anderen Zellen, Neutrophilen und werden dann getrennt mit einem Fluorescence Activated Cell Sorter wie die Zellen, die positiv für Neutrophilen Marker wie die Kombination von Ly6G und CD11b sind.
Obwohl beide positive Ansätze und immunomagnetische Auswahl Fluorescence Activated Cell Sorting sehr hohen Ausbeuten und Reinheiten der Maus Neutrophilen zu bieten, haben diese Verfahren den Nachteil im Vergleich zu unserem Protokoll, dass die Kennzeichnung Agenten auf der Oberfläche von Neutrophilen, die potenziell verändern könnten ihre Funktion zu binden. Positive immunomagnetische Auswahl Ansätze haben die zusätzliche Einschränkung, dass Antikörper-markierten Neutrophilen auf einem magnetischen Spalte für s bindeneparation, die auch beeinflussen können Zellfunktion. Fluorescence Activated Cell Sorting hat den zusätzlichen Nachteil, dass deutlich mehr Zeit für die Sammlung der Zellen mit einem Fluorescence Activated Cell Sorter in einem Labor Core Facility, die sich nachteilig auf das Überleben von Neutrophilen aufgrund ihrer kurzen Halbwertszeit ist erforderlich. Unsere Methode ist vergleichbar mit der Dichtegradientenzentrifugation Methode, die diskontinuierliche Percoll Gradienten verwendet, aber die beiden Schichtung Histopaque Dichte Trennmedien ist technisch viel weniger anspruchsvoll im Vergleich zu der Schichtung Percoll Gradienten, bestehend aus 55%, 65% und 75% vol / vol in PBS , was häufig Durchmischung der Percoll Schnittstellen aufgrund der geringen Dichteunterschiede zwischen den drei Schichten. Im Hinblick auf negative immunomagnetische Selektion Ansätze, haben sie auch berichtet worden, dass für die Isolierung einer großen Anzahl von funktionell zuständigen Neutrophilen mit hoher Reinheit und Lebensfähigkeit von Knochenmark von Mäusen 11 zuverlässig
Isoliert Neutrophilen unter Verwendung der beschriebenen Dichtegradientenzentrifugation Verfahren kann für eine Vielzahl von stromabwärtigen funktionelle Studien ex vivo wie Phagozytose, töten, Chemotaxis, Zytokinproduktion, oxidative Burst und Degranulation Assays unter Verwendung von veröffentlichten Protokollen 6 verwendet werden. Darüber hinaus kann isoliert sein Neutrophilenadoptiv in infizierten Mäusen Empfänger übertragen, um die Rolle der neutrophilen Übertragung auf Maus Überleben und die Auswirkungen der Neutrophilen übertragen auf das immunologische Korrelate wie Zytokin-Produktion an den Standorten der Infektion in Empfängermäuse bewerten. Zu diesem Zweck Tosello Boari und Kollegen adoptiv Knochenmark abgeleiteten Neutrophilen in Trypasonoma-infizierten Mäusen Empfänger, die nach unten reguliert IFN-γ Produktion in infizierten Milz und Leber und zu einer verbesserten Überlebensrate in einer IL-10-abhängigen Weise 19. Übertragen
Darüber hinaus bietet die Fähigkeit, mit der Neutrophilen CellTracker Farbstoffe CMFDA und CMTMR ohne ersichtlichen Farbstoff-induzierte Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen kennzeichnen die Möglichkeit, unterschiedlich beschriften Neutrophilen von Mäusen verschiedener genetischen Hintergründen und verfolgen die adoptiv übertragen markierten Zellen in verschiedenen Maus Zielorganen mittels Durchflusszytometrie Durchflusszytometrie oder Intravitalmikroskopie. Die Farbstoffe werden in CellTracker viabl beibehaltene Neutrophilen und nicht auf benachbarte Zellen diffundieren. In unseren Untersuchungen verwenden wir eine Konzentration von 5 pM für Zellmarkierung und wir sind in der Lage, erfolgreich zu verfolgen markierten Neutrophilen im Blut, Knochenmark und Nieren von Candida-infizierten Mäusen Empfänger für mindestens 4 Stunden nach der Neutrophilen Transfer 6. Neben CellTracker Grüne und CellTracker Orange andere Farbstoffe einschließlich CellTracker Violet, CFSE und SNARF-1 wurden ebenfalls erfolgreich zur Markierung Maus Knochenmark abgeleiteten Neutrophilen für adoptiven Transfer Experimente 11,19,20 verwendet. Darüber hinaus haben die CellTracker Grün und CellTracker orange Farbstoffe wirksam in einer ähnlichen Konzentration von 5 nM für die Kennzeichnung Maus Milz-T-Zellen für die adoptive Transfer-und Tracking-Experimente 21 verwendet. Die Möglichkeit, unterschiedlich beschriftet Neutrophilen mit verschiedenen CellTracker Farbstoffe können für die Gestaltung wettbewerbsfähig repopulation Experimenten, bei denen ein Verhältnis von 1:1 von unterschiedlich markierten Neutrophilen von Mäusen mit unterschiedlichengenetischen Hintergründen können adoptiv in Empfängermäuse werden mit dem Ziel, die direkte Rolle von spezifischen Genen in Menschenhandel von Neutrophilen aus dem Blut in entzündetes Gewebe bestimmen übertragen. Vor kurzem berichteten wir, dass der Chemokin-Rezeptor vermittelt Ccr1 Menschenhandel von Neutrophilen aus dem Blut in Candida-infizierten Nieren spät im Verlauf der Infektion, die in eine übermäßige Ansammlung von Neutrophilen in der Niere, Gewebeschäden führt und verringerte Überlebensrate 6.
Wie bei jedem Protokoll, unsere Methode hat auch Grenzen. Zum Beispiel, trotz der genannten Vorteile der Ernte Neutrophilen aus dem Knochenmark in Blut, gibt es beträchtliche Unterschiede zwischen Neutrophilen aus diesen zwei Kammern, die je auf der stromabwärtigen Forschung Anwendung der geernteten Zellen einen Einfluss auf die experimentellen Ergebnisse haben könnten erhalten. Insbesondere sind Blut Neutrophilen reifen Zellen, während aus den Neutrophilen Knochenmark NachteileIST von drei verschiedenen Bevölkerungsgruppen, die von unreifen Promyelozyten / Myelozyten weniger unreifen Metamyelozyten / Band Formen zu reifen Neutrophilen, wie zuvor beschrieben 22. Daher könnte der Unterschied in der Zelle Laufzeit zwischen Knochenmark und Blut Neutrophilen in Variation in bestimmten Zelle funktionellen Eigenschaften führen, wie es zuvor für Neutrophilen Antworten auf fMLF (N-Formylmethionyl-leucyl-Phenylalanin) und Verschlucken von Partikeln 23 gemeldet. Darüber hinaus, weil jede Neutrophilen Manipulation ex vivo in Zell-Aktivierung und Apoptose führen kann, ist Vorsicht wichtig beim Umgang mit den Zellen während der Zentrifugation. Darüber hinaus, weil die CellTracker Farbstoffe in Konzentrationen von über 5 uM beeinträchtigen könnten Neutrophilen Überleben soll diese Möglichkeit in Modellversuchen von einzelnen Wissenschaftlern getestet werden, in Abhängigkeit von der stromabwärts funktionellen Assay, getestet werden.
Zusammenfassend vorab wirschickte eine zuverlässige und reproduzierbare Methode, die von jedem Labor eingesetzt werden kann, um zu sammeln und beschriften Sie eine große Anzahl von Maus-Neutrophilen aus dem Knochenmark. Dieser Ansatz kann für eine Vielzahl von Neutrophilen funktionelle Studien einschließlich in vivo adoptiven Transfer-und Tracking-Experimenten mittels Durchflusszytometrie und Intravitalmikroskopie verwendet werden. Die Verwendung dieser und anderer zuverlässiger Protokolle für Maus Neutrophilen Reinigung, Isolierung, Kennzeichnung und nachgelagerten adoptiven Transfer und Tracking-Studien sollte unser Verständnis der neutrophilen Physiologie auf molekularer Ebene zu vertiefen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Abteilung für Interne Forschung des National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), National Institute of Health (NIH), USA unterstützt.
Alle Mäuse wurden an einer amerikanischen Vereinigung für die Akkreditierung von Laboratory Animal Care-akkreditierten Tierhaus am National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) gepflegt und untergebracht in Übereinstimmung mit den Verfahren in den Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren skizzierten unter der Schirmherrschaft eines Protokolls von der Animal Care und Use Committee des NIAID genehmigt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | GemCell | 100500 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Quality Biological Inc | 351-027-101 | |
| 0.2% and 1.6% sodium chloride | JT Baker | 3624 | Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C-7025 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) | Invitrogen | C-2927 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
| Anti-mouse CD11b (Clone M1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | Use at 1:100 dilution |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Molecular Probes | L-23105 | Use at 1:1000 dilution |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils. | |||
| Materials | |||
| C57BL/6 mice | Taconic | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes (3 ml) | BD Falcon | 357575 | |
| 12 ml syringes | Kendall monoject | 512878 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 mm cell strainers | BD Falcon | 352360 | |
| Bactericidal Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
| Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
| Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel) | Biomedical Research Instruments | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | Instruments sterilized prior to use |
| Equipment | |||
| Tissue culture hood | The Baker Company | SG403 | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37 °C shaking water bath | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol. |
References
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