Summary
Si descrive un protocollo per l'isolamento e la purificazione di neutrofili dal midollo osseo di topo per centrifugazione in gradiente di densità e di etichettatura neutrofili utilizzando coloranti CellTracker. Questo rappresenta un metodo semplice e veloce, riproducibile ed economico per ottenere un gran numero di neutrofili per studi funzionali a valle o di trasferimento ed inseguimento esperimenti adottive.
Abstract
Neutrofili sono cellule critiche effettrici del sistema immunitario innato. Sono rapidamente reclutati ai siti di infiammazione acuta e esercitano effetti protettivi o patogeni seconda del milieu infiammatorio. Tuttavia, nonostante il ruolo indispensabile dei neutrofili nel sistema immunitario, la comprensione dettagliata dei fattori molecolari che mediano gli effetti effettrici e immunopatogenici neutrofili 'in diverse malattie infettive e le condizioni infiammatorie che ancora manca, in parte a causa della loro breve emivita, le difficoltà con la gestione di questi celle e la mancanza di protocolli sperimentali affidabili per ottenere un numero sufficiente di neutrofili per studi funzionali a valle e gli esperimenti di trasferimento adottivo. Pertanto, metodi semplici, veloci, economici e affidabili sono altamente desiderabile per la raccolta di un numero sufficiente di neutrofili del mouse per valutare funzioni quali la fagocitosi, l'uccisione, la produzione di citochine, degranulazione e il traffico. A tal fine,vi presentiamo un protocollo riproducibile gradiente di densità centrifugazione a base, che può essere adattato in qualsiasi laboratorio per isolare un gran numero di neutrofili dal midollo osseo di topi con elevata purezza e vitalità. Inoltre, vi presentiamo un semplice protocollo che utilizza coloranti CellTracker per etichettare i neutrofili isolati, che possono poi essere trasferiti adoptively in topi riceventi e monitorati in diversi tessuti per almeno 4 ore post-trasferimento in citometria a flusso. Usando questo approccio, l'etichettatura differenziale dei neutrofili da topi wild-type e gene-deficienti con diversi coloranti CellTracker può essere impiegato con successo per eseguire studi di ripopolamento della concorrenza per valutare il ruolo diretto di geni specifici nel traffico di neutrofili dal sangue nei tessuti bersaglio in vivo .
Introduction
I neutrofili sono i leucociti più abbondanti nell'uomo. Essi sono la principale componente cellulare del sistema immunitario innato e ad agire come una prima linea di difesa contro l'invasione dei microrganismi. I pazienti con neutropenia acquisita e immunodeficienze primarie che interessano i numeri dei neutrofili e / o funzione di sviluppare infezioni invasive potenzialmente letali batteriche e fungine, mettendo in evidenza l'importanza di queste cellule in serie della difesa 1. Riconoscimento immune di patogeni nel sito dell'infezione dai loro cognate di riconoscimento di recettori risultati nella induzione di una risposta immunitaria innata orchestrato, che porta alla secrezione di fattori chemiotattici che generano un gradiente chemiotattico capace di reclutare neutrofili dal sangue nel tessuto infiammato 2 . Dopo neutrofili entrano nel sito dell'infezione, diventano attivate, che porta a citochine e chemochine, assorbimento patogeno, e uccidendo via ossidativa e non ossidativa mechanisms 3. Oltre al loro ruolo ben riconosciuto nella immunità innata, i neutrofili sono stati anche recentemente dimostrato di svolgere ruoli importanti come iniziatori di efficaci risposte immunitarie adattative 4. D'altra parte, a prescindere dai loro ruoli protettivi nell'immunità, neutrofili possono anche mediare il danno tissutale e immunopatologia causa di un eccessivo accumulo e / o l'attivazione ai siti di infiammazione, come mostrato in una varietà di malattie infettive e autoimmuni 5-7.
Nonostante il ruolo indispensabile dei neutrofili nel montaggio efficaci risposte immunitarie innate e le loro funzioni effettrici pleiotropici in diverse malattie infettive e le condizioni infiammatorie, difficoltà tecniche con la gestione di queste cellule e la mancanza di protocolli sperimentali affidabili ha ostacolato la ricerca con neutrofili nel corso degli ultimi decenni. Pertanto, l'uso di test riproducibili per l'isolamento dei neutrofili dovrebbe facilitare ulteriormente la ricerca sui mediato dai neutrofili immunologicigica funzioni ex vivo e in vivo. Ad oggi, diversi metodi sono stati descritti per l'isolamento dei neutrofili come la densità centrifugazione in gradiente di sangue umano e mouse o midollo osseo 8,9, arricchimento immunomagnetico positivo o negativo di neutrofili dal sangue o midollo osseo del mouse 10,11, e raccolta di neutrofili dalla cavità peritoneale di topi dopo iniezione intraperitoneale di tioglicolato o altri agenti infiammatori 12. Sebbene neutrofili possono essere facilmente isolati in gran numero da sangue umano, questo metodo è subottimale nei topi a causa delle ridotte dimensioni di sangue topo che preclude l'isolamento dei neutrofili sufficienti per studi funzionali o esperimenti trasferimento adottivo 13. Inoltre, anche se la resa di tioglicolato-suscitato cellule dalla cavità peritoneale è maggiore rispetto a quella del sangue topo, la purezza dei neutrofili nel lavaggio peritoneale infiammatoria varia tra60-90%, ed i neutrofili isolati esibiscono un fenotipo attivato. Così, le cellule raccolte mediante questo metodo può essere utilizzato solo per l'esecuzione di studi funzionali di attivazione, ma non di neutrofili non stimolati, come la cavità peritoneale del mouse ha pochi neutrofili alla stato stazionario 12. Invece, il midollo osseo è un serbatoio per la raccolta conveniente tantissimi sia non stimolate o attivati neutrofili 11,14, che possono poi essere utilizzati per studi funzionali valle come fagocitosi, uccisione e degranulazione, o per il trasferimento adottivo in topi riceventi.
Qui descriviamo un semplice e veloce (circa 2 ore) il protocollo, che prevede un alto rendimento (~ 6-12 × 10 6 neutrofili / topo infetto, o fino a 30-40 × 10 6 neutrofili / topo infetto) di puro (80 -95%) con neutrofili> 95% della vitalità dal midollo osseo. Questo metodo utilizza commercialmente disponibile Histopaque, che sono cellule gradiente di densità sepasupporti razione composto da Ficoll e diatrizoato sodio, per separare i neutrofili dal midollo osseo di topi. Questo metodo fornisce significativamente più grande numero di neutrofili per topo rispetto al sangue o cavità peritoneale, può essere utilizzata per raccogliere neutrofili da topi sia in stato stazionario o dopo l'infezione, ed è più facile strato rispetto al metodo di centrifugazione in gradiente di densità che utilizza discontinuo gradienti percoll composto da 55% / 65% / 75% Percoll in PBS 9. Inoltre, il tempo e le risorse necessarie per raccogliere i neutrofili puri sono significativamente diminuiti rispetto all'isolamento dei neutrofili mediante Fluorescence-Activated cella Ordinamento. Inoltre, poiché questo metodo non comporta un passaggio di arricchimento immunomagnetico, è più conveniente, ed evita l'esposizione delle cellule a colonna magnetica e anticorpi, diminuendo così la probabilità di attivazione dei neutrofili.
Oltre a eseguire studi funzionali di neutroph isolatoils ex vivo e il trasferimento adottivo di cellule in topi riceventi, questo protocollo descrive anche un metodo per l'etichettatura dei neutrofili isolati utilizzando diversi coloranti CellTracker. Etichettatura differenziale dei neutrofili da topi di vari background genetico può essere adattato in studi ripopolamento competitivi per il monitoraggio dei neutrofili trasferiti nei tessuti di topi riceventi tramite citometria a flusso, che può fornire la comprensione meccanicistica sul ruolo diretto di geni specifici nel traffico di neutrofili dal sangue in bersaglio organi infiammati 6.
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Protocol
1. Isolamento del midollo osseo di topo cellule
- Euthanize topo, utilizzando il protocollo di cura degli animali dell'istituzione comitato-approvato e spruzzare la superficie degli animali con il 70% di etanolo.
- Fare una incisione della pelle nella metà addome e togliere la pelle dalla parte distale del topo compresa la pelle che copre le estremità inferiori.
- Tagliare i muscoli delle estremità inferiori con le forbici e dislocare attentamente dell'acetabolo dall'articolazione dell'anca, evitando di rompere la testa del femore.
- Togliere i muscoli rimanenti dal femore e tibia con un bisturi e forbici e separare il femore dalla tibia al ginocchio cura esercizio congiunto per non rompere le estremità delle ossa. Posizionare le ossa in una capsula di Petri contenente ghiacciata RPMI 1640 supplementato con 1X 10% FBS e 1% di penicillina / streptomicina.
- Procedere con i seguenti passi sotto una cappa di coltura di tessuti. Prendere precauzioni extra per mantenere severe tecniche sterili per evitare neutrophil attivazione.
- Lavare ogni osso con etanolo al 70% (entro una capsula Petri) seguito da tre successivi lavaggi in ghiacciata PBS sterile (entro piastre Petri) per risciacquare l'etanolo dalla superficie delle ossa.
- All'interno di un piatto pulito sterile Petri, tagliare le epifisi delle ossa e tenerli da parte.
- Utilizzare un ago calibro 25 e una siringa 12 cc riempito con RPMI supplementato con 10% FBS e 2 mM EDTA, e lavare le cellule del midollo osseo da entrambe le estremità degli alberi su un osso ml vite tubo superiore 50 Falcon equipaggiato di 100 pm filtrare. Al fine di rimuovere efficacemente tutte le cellule, raschiare la superficie interna delle ossa utilizzando l'ago calibro 25.
NOTA: imbiancamento delle ossa indica che le cellule sono state sufficientemente raschiate.
Nota: utilizzare circa 10 ml di mezzi per irrigare un femore / tibia coppia. Aggiunta di EDTA al mezzo è essenziale per evitare grumi delle cellule.
- Tagliare le epifisi delle ossain piccoli 0,5-1 mm 3 pezzi con un bisturi e sfondare il filtro 100 micron con il back-end di un 2,5 ml Eppendorf Biopur Combitip plus punta della pipetta.
- Centrifugare a 1400 rpm per 7 minuti a 4 ° C.
- Lisare i globuli rossi da risospendere il pellet cellulare in 20 ml di NaCl 0,2% per circa 20 secondi, seguita da aggiunta di 20 ml di 1,6% NaCl. (Critico: non superare il 20-30 sec di lisi ipotonica per evitare la morte delle cellule del midollo osseo si raccomanda l'uso di ipotonica di NaCl per lisi più buffer di lisi ACK perché quest'ultimo ha la possibilità di attivare i neutrofili.).
- Centrifugare per 7 min a 1400 rpm a 4 ° C per raccogliere le cellule.
- Lavare le cellule con 1X RPMI 1640 supplementato con 10% FBS e 2 mM EDTA e centrifugare come al punto 1.12.
- La resa di cellule del midollo osseo che utilizzano questo metodo è circa 60-80 milioni di euro non infetto 8-12 settimane di età C57BL / 6 del mouse.
2. Separazione dei neutrofilidalla centrifugazione in gradiente di densità
- Contare le cellule del midollo osseo e risospendere in 1 ml di ghiacciata PBS sterile.
- Aggiungere 3 ml di Histopaque 1119 (densità 1,119 g / ml) in una provetta conica da 15 ml.
- Sovrapposizione 3 ml di Histopaque 1077 (densità, 1,077 g / ml) sulla 3 ml di Histopaque 1119.
NOTA: Histopaque il 1119 e il 1077 Histopaque deve essere portata a 18-26 ° C prima dell'uso.
Fase critica: Preparare gradienti immediatamente prima dell'uso come preparare il gradiente in anticipo comporterà diffusione tra i due strati e non ottimale purezza neutrofili e recupero.
Critical Passo: Sovrapposizione Histopaque 1077 oltre 1119 deve essere fatto lentamente in modo da evitare di mescolare le due densità, che impedisca la separazione delle cellule durante la centrifugazione.
- Sovrapporre il midollo osseo sospensione cellulare in cima alla Histopaque 1077.
Critical Passo: OVERLaying midollo osseo sospensione cellulare sopra Histopaque 1077 deve essere fatto lentamente per evitare di disturbare l'interfaccia tra le cellule e HISTOPAQUE 1077.
NOTA: La risospensione cellule di midollo osseo da un mouse non infetti in 1 ml di PBS produce purezza neutrofili> 90%. Tuttavia, pool molti campioni di midollo osseo compromette purezza neutrofili, per esempio, risospendere 300 x 10 6 cellule in 3 ml di PBS riduce purezza neutrofili da> 90% a ~ 80%. Pertanto, gli investigatori dovrebbero eseguire esperimenti pilota per identificare il conteggio / volume delle cellule condizioni ideali per le loro specifiche esperienze
- Centrifugare per 30 min a 2000 rpm a 25 ° C senza freno.
NOTA: La centrifugazione del gradiente a temperatura ambiente è fondamentale ed essenziale per una efficace separazione dei neutrofili.
- Raccogliere i neutrofili a livello di interfaccia del Histopaque il 1119 e il 1077 Histopaque strati. Lavare i neutrofili raccolti due volte con RPMI 1640 supplementato con 10 1X% FBS e 1% di penicillina / streptomicina e centrifugare a 1400 rpm per 7 minuti a 4 ° C.
- Contare i neutrofili e determinare la loro vitalità.
NOTA: I neutrofili sono tipicamente> 95% vitali e> 90% puro, come determinato mediante analisi FACS. La resa tipica di neutrofili dal midollo osseo (cioè 2 femore e tibia ossa 2) di una non infetta 8-12 settimane di età C57BL / 6 mouse è ~ 6-12.000.000 cellule. Questo numero è notevolmente maggiore quando i neutrofili sono raccolte dal midollo osseo di animali infetti. Quindi, ~ 30-40 milioni di neutrofili / topo sono stati recuperati quando i topi con infezione da Candida sono stati utilizzati per la raccolta di cellule 6.
3. Etichettatura dei neutrofili utilizzando coloranti CellTracker
- Risospendere le neutrofili a 5 x 10 6 cellule / ml in PBS preriscaldato a 37 ° C.
- Aggiungi un colorante CellTracker ad un concent finalerazione di 5 micron.
NOTA: CellTracker Verde (CMFDA (5 Chloromethylfluorescein Diacetato) e CellTracker Orange (CMTMR (5 - (e-6)-4-Chloromethyl benzoile Tetramethylrhodamine Amino) è stato utilizzato in questo protocollo per etichettare in modo differenziale neutrofili da wild-type e gene-carente topi.
NOTA: Preparare una soluzione stock di 10 mM di CellTracker Verde e CellTracker Arancione, aliquota, e conservare a -80 ° C fino a quando il giorno dell'esperimento.
- Incubare neutrofili con 5 pM del colorante CellTracker corrispondente per 10 min a 37 ° C in un bagno d'acqua nel buio.
- Lavare le cellule due volte con ghiacciata RPMI 1640 supplementato con 1X 10% FBS e 1% di penicillina / streptomicina.
NOTA: Un lavaggio efficace delle cellule dopo il passo di etichettatura con il colorante CellTracker è essenziale per evitare la contaminazione incrociata colorante prima della miscelazione popolazioni neutrofili differenzialmente etichettati per bassitream studi ripopolamento competitivi.
4. Trasferimento adottivo di neutrofili in Mouse e analisi dei neutrofili trasferiti mediante citometria a flusso
- Neutrofili Risospendere in PBS freddo ad una concentrazione di 25 x 10 6 cellule / ml e iniettare 200 microlitri della sospensione nella vena caudale laterale in modo che 5 x 10 6 neutrofili sono trasferiti per topo. Per gli studi di neutrofili ripopolamento competitivi, mescolare neutrofili wild-type e gene-carente in un rapporto di 1:1 e iniettare un totale di 5 x 10 6 neutrofili per topo come sopra.
NOTA: almeno fino a 10 x 10 6 neutrofili possono essere adoptively trasferiti per il mouse senza evidente tossicità immediate agli animali.
- In tempi diversi dopo trasferimento adottivo (ad esempio 1, 2, 3 o 4 ore post-transfer), eutanasia topi e sangue raccolto, e / o midollo osseo e / o di altro organo bersaglio (s) di interesse.
- Preparare SIsospensioni cellulari NGLE di questi tessuti per l'analisi quantitativa e qualitativa dei neutrofili etichettati adoptively trasferiti utilizzando pubblicato protocolli 6,15.
- Seguendo vivo / morto colorazione viabilità e blocco Fc, etichettare le cellule con CD45 (clone 30-F11), Ly6G (clone 1A8) e CD11b (M1/70 clone) e porta sul vivo CD45 + Ly6G + CD11b + neutrofili. I neutrofili in questo cancello includono neutrofili nativi del mouse destinatario, nonché i neutrofili etichettati adoptively trasferiti, che sono + FITC (se etichettato con CellTracker verde) o PE + (se etichettato con Cell Tracker arancione).
NOTA: I neutrofili possono essere rintracciati nel sangue, midollo osseo e rene di topi Candida-infettati per almeno 4 ore post-trasferimento.
NOTA: Fissaggio con 2% paraformaldeide in PBS non alterino la media intensità di fluorescenza dei neutrofili etichettati con CellTracker Green o CellTracker Arancione per almeno 48 ore.
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Representative Results
Questo protocollo è ottimizzato per la raccolta di cellule di midollo osseo di topo e la successiva separazione di neutrofili dal queste cellule mediante centrifugazione in gradiente di densità utilizzando commercialmente disponibili mezzi di separazione cellulare HISTOPAQUE. Neutrofili isolati usando questo metodo può essere utilizzato per una varietà di valle studi ex vivo e funzionale per esperimenti trasferimento adottivo in topi riceventi.
La resa tipica di raccolta delle cellule del midollo osseo da entrambi i femori e tibia per non infetto 8-12 settimane di età C57BL / 6 del mouse è ~ 60-80.000.000 cellule con una vitalità di ~ 94-98%. A valle centrifugazione in gradiente di densità di queste cellule utilizzando la densità mezzi di separazione Histopaque tipicamente produce ~ 6-12.000.000 neutrofili per topo infetto. I neutrofili sono 80-95% puro e> 95% praticabile, come verificato mediante citometria di flusso (Figura 1). Sebbene sia possibile piscina cellule di midollo osseo di diversi animali prima la densitàfase di centrifugazione gradiente, cellule pooling diminuisce leggermente la purezza dei neutrofili isolati. Per esempio, mentre sovrapponendo 60-80.000.000 cellule di midollo osseo da un topo non infetti in 1-3 ml di PBS rese> 90% di neutrofili puri, la purezza cella diminuisce al ~ 80% quando ~ 300 milioni di cellule di midollo osseo sono raggruppate in tre ml di PBS e sovrapposti.
Inoltre, questo protocollo descrive anche la procedura per la successiva etichettatura dei neutrofili con coloranti CellTracker, che consente il monitoraggio delle cellule adoptively trasferite in topi riceventi in citometria a flusso. Etichettatura dei neutrofili con 5 micron di CMFDA o CMTMR non sembra influenzare la sopravvivenza dei neutrofili come rimangono neutrofili etichettati> 95% vitali (dati non riportati). Neutrofili etichettati, possono essere rintracciati in vari tessuti del mouse per almeno 4 ore dopo il trasferimento adottivo in citometria a flusso con gating su live CD45 + cellule (Figura 2) + Ly6G + CD11b.L'uso di differenziali coloranti etichettatura dei neutrofili wild-type rispetto gene-carente negli studi di ripopolamento competitivi consente la valutazione del ruolo diretto di un gene specifico (ad esempio recettore chemiotattico 6) nel traffico di neutrofili dal sangue in un dato organo bersaglio.
Figura 1. Rappresentante FACS trama di neutrofili isolati da cellule di midollo osseo di un C57BL non infetto / 6 mouse utilizzando il protocollo di centrifugazione in gradiente di densità. Il pannello di sinistra mostra il gating iniziale usato per le cellule di midollo osseo raccolte dall'interfaccia di Histopaque 1119 e il 1077 usando Histopaque avanti e side scatter (FSC / SSC). Come mostrato, neutrofili raccolte dall'interfaccia sono> 90% (pannello centrale) e> 95% vitali (pannello destro).
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Figura 2. Rappresentante FACS appezzamento di adoptively trasferito CMTMR-etichettati neutrofili raccolte da sangue, midollo e reni di un destinatario Candida infezione da C57BL / 6 del mouse 4 ore dopo il trasferimento delle cellule. I neutrofili CMTMR-etichettati adoptively trasferite sono in PE-positivi e possono essere differenziati da i neutrofili nativi del topo ricevente, che sono PE-negativi. Si noti che l'espressione di CD11b è maggiore nei neutrofili raccolte dal rene rispetto ai neutrofili raccolte da sangue e midollo osseo. L'aumento dell'espressione CD11b nei neutrofili renali è coerente con i risultati precedenti 15 e probabilmente riflette attivazione delle cellule al momento dell'ingresso nel rene, che è il principale organo bersaglio nel modello murino di candidosi sistemica.
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Discussion
Qui vi presentiamo un semplice protocollo affidabile, veloce ed economico per l'isolamento di un gran numero di neutrofili dal midollo osseo di topi con elevata purezza e vitalità utilizzando un approccio di centrifugazione in gradiente di densità. Quando questo protocollo è eseguita correttamente, ~ 6-12 × 10 6 neutrofili possono essere recuperati da un mouse non infetto e fino a ~ 30-40 × 10 6 neutrofili possono essere isolati da un topo dopo l'infezione 6. I neutrofili isolati sono 80-95% puro e> 95% valida.
Il midollo osseo è un serbatoio adatto per ottenere i neutrofili del mouse per studi funzionali a valle ed esperimenti trasferimento adottivo. Prima, è stato precedentemente dimostrato che i neutrofili midollo osseo sono funzionalmente simili a neutrofili nel sangue dei topi come cellule da entrambi i vani esibiscono simile burst ossidativo e degranulazione 16. Secondo, neutrofili midollo osseo del topo hanno dimostrato di sopravvivere protrperiodi agito di tempo nella cultura, significativamente più lungo rispetto al topo neutrofili nel sangue 16. Pertanto, la raccolta di midollo osseo nel corso dei neutrofili nel sangue potrebbe consentire una maggiore resa di cellule, quando trattati per funzionale test ex vivo. Terzo, isolamento di neutrofili dal midollo osseo offre il vantaggio di recuperare notevolmente più grandi numeri di neutrofili, che sono sufficienti per il downstream esperimenti di trasferimento adottivo, sia in regime stazionario e dopo l'infezione. Invece, notevolmente inferiore neutrofili possono essere recuperati dal sangue topo, anche dopo l'infezione, e non molte neutrofili sono presenti allo stato stazionario nella cavità peritoneale. Così, thioglycollate o altri agenti sono tipicamente utilizzati per promuovere il reclutamento di neutrofili attivati del peritoneo; questa metodologia è ostacolata dalla purezza variabile di neutrofili nel essudato infiammatorio acuto peritoneale (non pubblicati, dati non mostrati) e l'induzione di un neutrofili phenotyp attivatoE, che è diversa da quella dei neutrofili non stimolati recuperati da topi non manipolata.
Sono disponibili diversi metodi per l'isolamento dei neutrofili dal midollo osseo di topo. Questi includono (a) centrifugazione in gradiente di densità avvicina come quello che presentiamo che utilizza densità Histopaque mezzi di separazione, ed una metodologia simile che utilizza gradienti Percoll discontinuo 17, (b) approcci selezione immunomagnetiche positivi, durante il quale le cellule del midollo osseo vengono etichettate con un anticorpo neutrofili-specifico come Ly6G, e neutrofili sono poi arricchiti dal legame delle cellule Ly6G-positivi su una colonna magnetica 18, (c) Selezione approcci immunomagnetiche negativi, durante il quale le cellule del midollo osseo sono etichettati con un cocktail di anticorpi che si legano su cellule diverse da neutrofili (ie CD5 per i linfociti T, CD45R/B220 per linfociti B, CD49b/DX5 per le cellule NK, CD117 per i mastociti e le cellule staminali ematopoietiche, F4/80 permacrofagi e Ter119 per eritrociti) 11, e poi i neutrofili sono arricchiti da eluizione come frazione anticorpo-negativo di cellule che non si legano sulla colonna magnetica, e (d) Fluorescence Activated separazione delle cellule, durante il quale le cellule del midollo osseo sono etichettati con anticorpi che si legano sui neutrofili e di altre cellule, e neutrofili sono poi separati tramite un Fluorescence Activated Classificatore celle come le cellule che sono positivi per i marcatori dei neutrofili, come la combinazione di Ly6G e CD11b.
Sebbene entrambi gli approcci selezione immunomagnetiche positivi e Fluorescence Activated cellula ordinamento forniscono altissime rese e purezze di neutrofili topo, questi metodi hanno lo svantaggio rispetto al nostro protocollo che gli agenti etichettatura legano sulla superficie dei neutrofili, che potrebbe alterare la loro funzione. Approcci selezione immunomagnetiche positivi hanno la limitazione aggiuntiva che anticorpi marcati neutrofili legano su una colonna magnetica per separation, che può influenzare anche la funzione delle cellule. Fluorescence Activated ordinamento cellulare ha lo svantaggio aggiuntivo che è richiesto un tempo significativamente più lungo per la raccolta delle cellule utilizzando un Fluorescence Activated Classificatore celle in una struttura di base di laboratorio, che possono influenzare negativamente la sopravvivenza dei neutrofili a causa della loro breve emivita. Il nostro metodo è paragonabile al metodo centrifugazione in gradiente di densità che utilizza discontinue gradienti Percoll, ma i due stratificazione di densità Histopaque mezzi di separazione è tecnicamente molto meno impegnativo rispetto a stratificazione i gradienti Percoll costituiti da 55%, 65% e 75% vol / vol in PBS , che si traduce spesso in mescolanza delle interfacce percoll a causa delle piccole differenze di densità tra i tre strati. Rispetto agli approcci selezione immunomagnetiche negativi, sono stati segnalati essere affidabile per l'isolamento di un gran numero di neutrofili competenti funzionalmente con elevata purezza e vitalità da midollo osseo di topi 11
Neutrofili isolati con il metodo di centrifugazione su gradiente di densità descritti possono essere utilizzati per una varietà di valle studi funzionali ex vivo come fagocitosi, uccisione, chemiotassi, la produzione di citochine, burst ossidativo e saggi degranulazione utilizzando protocolli pubblicato 6. Inoltre, i neutrofili isolati possono essereadoptively trasferite in topi infettati riceventi per valutare il ruolo di trasferimento neutrofili sulla sopravvivenza mouse e gli effetti dei neutrofili trasferiti sul correlati immunologici, quali la produzione di citochine nei siti di infezione nei topi riceventi. A tal fine, Tosello Boari e colleghi adoptively trasferiti neutrofili midollo osseo derivate da topi riceventi in Trypasonoma-infettati che down-regolato IFN-γ produzione nel fegato e milza infetto e comportato un miglioramento della sopravvivenza in maniera IL-10 dipendente 19.
Inoltre, la possibilità di etichettare neutrofili con il CellTracker coloranti CMFDA e CMTMR senza apparente diminuzione colorante indotta vitalità cellulare offre la possibilità di etichettare in modo differenziale neutrofili da topi di vari background genetici e monitorare le cellule marcate adoptively trasferiti in diversi organi bersaglio del mouse utilizzando il flusso citometria o microscopia intravitale. I coloranti CellTracker vengono conservati nella viablposta neutrofili e non si diffondono alle celle adiacenti. Nei nostri studi si usa una concentrazione di 5 mM per l'etichettatura delle cellule e siamo in grado di monitorare con successo neutrofili etichettati nel sangue, nel midollo osseo e nei reni di topi riceventi con infezione da Candida per almeno 4 ore dopo il trasferimento dei neutrofili 6. Oltre CellTracker Verde e CellTracker Orange, altri coloranti compresi CellTracker Violet, CFSE e SNARF-1 sono anche stati utilizzati con successo per l'etichetta del mouse neutrofili midollo osseo derivate per esperimenti di trasferimento adottivo 11,19,20. Inoltre, il Green CellTracker e CellTracker coloranti arancioni sono stati effettivamente utilizzati in una simile concentrazione di 5 mM per etichettare le cellule T spleniche del mouse per il trasferimento adottivo e gli esperimenti di monitoraggio 21. La possibilità di etichettare in modo differenziale neutrofili con vari coloranti CellTracker consente per la progettazione di esperimenti di ripopolamento competitivo in cui un rapporto di neutrofili differenziale etichettati da topi 1:1 con diversabackground genetici possono essere adoptively trasferite in topi riceventi con l'obiettivo di determinare il ruolo diretto di geni specifici nel traffico di neutrofili dal sangue nei tessuti infiammati. Abbiamo recentemente riportato che la chemochina recettore CCR1 media il traffico di neutrofili dal sangue nei reni Candida-infettati durante il decorso dell'infezione, che si traduce in un eccessivo accumulo di neutrofili nel rene, lesioni dei tessuti e ridotta sopravvivenza 6.
Come con qualsiasi protocollo, il nostro metodo ha anche dei limiti. Ad esempio, nonostante i suddetti vantaggi della raccolta neutrofili dal midollo osseo nel sangue, esistono notevoli differenze tra neutrofili ottenuti da questi due compartimenti, che a seconda dell'applicazione di ricerca a valle delle cellule raccolte potrebbe avere un impatto sui risultati sperimentali. In particolare, i neutrofili sono cellule mature del sangue, mentre i neutrofili dal cons midollo osseoist di tre diverse sottopopolazioni che vanno dalla promyelocytes / mielociti immaturi per metamielociti meno immaturi / Forme band neutrofili maturi, come descritto in precedenza 22. Quindi, la differenza di maturità cella tra midollo osseo e neutrofili potrebbe tradursi in una modifica certe caratteristiche funzionali delle cellule come è stato precedentemente riportato per le risposte neutrofili verso fMLF (N-formylmethionyl-leucil-fenilalanina) e l'ingestione di particelle 23. Inoltre, poiché ogni neutrofili manipolazione ex vivo può provocare l'attivazione delle cellule e l'apoptosi, la cautela è indispensabile durante la manipolazione delle cellule durante la centrifugazione in gradiente. Inoltre, poiché i coloranti CellTracker a concentrazioni superiori a 5 pM potrebbero influenzare negativamente la sopravvivenza dei neutrofili, questa possibilità dovrebbe essere testato in esperimenti pilota da singoli ricercatori, a seconda del saggio funzionale a valle che sarà testato.
In sintesi, abbiamo preinviato un metodo affidabile e riproducibile che può essere impiegato da qualsiasi laboratorio per raccogliere e etichettare grandi numeri di topo neutrofili dal midollo osseo. Questo approccio può essere utilizzato per una varietà di studi funzionali neutrofili compreso nel trasferimento adottivo vivo ed esperimenti di tracciamento mediante citometria a flusso e microscopia intravitale. L'uso di questo e di altri protocolli affidabili per il mouse neutrofili purificazione, l'isolamento, l'etichettatura e la valle trasferimento adottivo e studi di monitoraggio dovrebbe approfondire la nostra comprensione della fisiologia dei neutrofili a livello molecolare.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Divisione di ricerca intramurale del Istituto Nazionale di allergie e malattie infettive (NIAID), National Institute of Health (NIH), Stati Uniti d'America.
Tutti i topi sono stati mantenuti ad una Associazione americana per l'accreditamento del Laboratorio stabulario accreditato cura degli animali presso l'Istituto Nazionale di allergie e malattie infettive (NIAID) e alloggiati in conformità con le procedure descritte nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio sotto gli auspici di un protocollo approvato dalla cura degli animali e del Comitato utilizzo del NIAID.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | GemCell | 100500 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Quality Biological Inc | 351-027-101 | |
| 0.2% and 1.6% sodium chloride | JT Baker | 3624 | Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C-7025 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) | Invitrogen | C-2927 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
| Anti-mouse CD11b (Clone M1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | Use at 1:100 dilution |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Molecular Probes | L-23105 | Use at 1:1000 dilution |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils. | |||
| Materials | |||
| C57BL/6 mice | Taconic | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes (3 ml) | BD Falcon | 357575 | |
| 12 ml syringes | Kendall monoject | 512878 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 mm cell strainers | BD Falcon | 352360 | |
| Bactericidal Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
| Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
| Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel) | Biomedical Research Instruments | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | Instruments sterilized prior to use |
| Equipment | |||
| Tissue culture hood | The Baker Company | SG403 | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37 °C shaking water bath | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol. |
References
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