Summary
我々は、密度勾配遠心分離によりCellTrackerと染料を用いて好中球標識のマウス骨髄からの好中球の単離および精製のためのプロトコールを述べる。これは、下流の機能研究または養子移入と追跡実験の好中球の多数を取得するための、簡易で、迅速かつ再現性のある経済的な方法を表しています。
Abstract
好中球は、自然免疫系の重要なエフェクター細胞である。彼らは急速に急性炎症のサイトで募集し、炎症環境に応じて、保護や病原性の効果を発揮している。それにもかかわらず、免疫における好中球の不可欠な役割にもかかわらず、別の感染症や炎症性の条件で好中球 'エフェクターとimmunopathogenic効果を媒介分子の要因の詳細な理解は、まだ、一部ため、その短い半減期のために、これらの取り扱いとの難しさを欠いている細胞および下流機能的研究と養子移入実験のために好中球の十分な数を取得するための信頼性のある実験プロトコルの欠如。したがって、簡単、迅速、経済的かつ信頼性のある方法は、食作用、殺、サイトカイン産生、脱顆粒及び売買などの機能を評価するためにマウスの好中球の十分な数を収穫するために非常に望ましい。そのために、我々は、高純度と生存したマウスの骨髄からの好中球の多数を分離する任意の研究室で適応させることができる再現性の密度勾配遠心分離ベースのプロトコルを提示。さらに、我々は、養子レシピエントマウスに移し、フローサイトメトリーを使用して少なくとも4時間後に転写するためのいくつかの組織で追跡することができる単離された好中球を標識するためにCellTracker染料を使用する簡単なプロトコルを提示する。このアプローチを使用して、異なるCellTracker染料、野生型および遺伝子欠損マウスからの好中球の特異的標識が正常にin vivoで標的組織への血液から好中球の輸送における特定の遺伝子の直接的な役割を評価するために競争力の再増殖試験を実行するために使用することができる。
Introduction
好中球は、ヒトにおける最も豊富な白血球です。彼らは、微生物の侵入に対する防御の最初の行としての自然免疫系との行為の主な細胞成分である。好中球の数値および/ または機能に影響を与える買収好中球減少症とプライマリ免疫不全患者では、宿主防御1でこれらの細胞の重要性を強調し、生命を脅かす侵略的な細菌や真菌感染症を開発。炎症組織2への血流から募集の好中球の走化が可能な勾配を発生させる化学誘引物質の分泌につながるオーケスト自然免疫応答の誘導においてそれらの同族パターン認識受容体の結果感染部位における侵入病原体の免疫認識。好中球は、感染部位を入力した後、彼らは、サイトカインやケモカイン産生につながる、病原体の取り込み活性化、及び酸化および非酸化を介して、私を殺してchanisms 3。先天性免疫におけるそれらのよく知られた役割に加えて、好中球はまた、最近効果的な適応免疫応答の開始剤4として重要な役割を果たすことが示されている。 5-7感染性および自己免疫疾患の様に示すように、一方、離間免疫において、保護の役割から、好中球はまた、過剰な蓄積および/ または炎症部位 において活性化に起因する組織損傷および免疫病理を媒介することができる。
いくつかの感染症や炎症状態に効果的な自然免疫応答とその多面的なエフェクター機能を搭載で好中球の不可欠な役割にもかかわらず、これらの細胞は、信頼性の高い実験プロトコルの欠如を取り扱うとの技術的な問題は、過去数十年にわたって好中球との研究を妨げている。したがって、好中球の単離のための再現可能なアッセイの使用は、好中球媒介immunoloに関する更なる研究を促進しなければならないgical機能エクスビボおよびin vivoである 。現在までに、いくつかの方法は、ヒト血液、マウス血液または骨髄8,9の密度勾配遠心分離、正または負の免疫マウスの血液または骨髄10,11から好中球を濃縮し、収穫などの好中球の単離のために記載されているチオグリコール酸または他の炎症剤12の腹腔内注射後のマウスの腹膜腔から好中球。好中球は簡単に人間の血液から大量に単離することができるが、この方法では、機能的な研究や養子移入実験13に十分な好中球の分離を排除マウス血液の限られた量のためにマウスでは次善です。腹膜腔から細胞を誘発チオグリコレートの収率は、マウスの血液に比べて大きくなるが、さらに、炎症性腹腔洗浄液中の好中球の純度の間で変化60から90パーセント、及び単離された好中球が活性化された表現型を示す。マウス腹腔12が定常状態でいくつかの好中球を有するこのように、この方法を用いて回収した細胞のみが、非刺激好中球の活性化ではなく、機能的研究を行うために使用することができる。その代わりに、骨髄は、そのような貪食、殺害や脱顆粒などの下流の機能研究のために、またはレシピエントマウスに養子移入に使用することができますどちらか刺激されていないか、または活性化された好中球11,14、大量の収穫のための便利な貯水池です。
ここで我々は、高収率を提供していますシンプルで高速な（〜2時間）プロトコルを記述（〜6-12×10 6好中球/非感染マウス、または最大30〜40×10 6好中球/感染したマウス）純粋な（80の-95％）骨髄から> 95％の生存率で好中球。この方法は、密度勾配セルSEPAある市販のHISTOPAQUEを使用配給メディアはマウスの骨髄からの好中球を分離するために、フィコールナトリウムジアトリゾエートから成る。この方法は血液または腹膜腔に比べてマウス当たりの好中球のかなり大きな数字をもたらす、それは定常状態でのまたは感染後の両方のマウスから好中球を収集するために使用することができ、それは不連続使用して密度勾配遠心法と比較して、層に容易である55％/ 65％/ PBS 9で75％パーコール成るパーコール勾配。また、純粋な好中球を収集するのに必要な時間とリソースを大幅に蛍光活性化細胞ソーティングを用いた好中球の分離に比べて減少する。また、この方法は免疫濃縮工程を必要としないので、それはより費用対効果であり、したがって、好中球活性化の可能性を減少させる、磁気カラムおよび抗体への細胞の曝露を回避する。
単離されたneutrophの機能的研究を行うことに加えてILS のex vivoとレシピエントマウスへの細胞の養子移入は、このプロトコルは異なるCellTracker染料を使用して隔離された好中球を標識するための方法についても説明します。種々の遺伝的背景のマウスからの好中球の特異的標識は、血液から好中球の輸送における特定の遺伝子の直接的な役割に機械的な洞察を提供することができ、フローサイトメトリーを使用して、レシピエントマウスの組織において転送された好中球を追跡するために競争力の再増殖試験に適合させることができるターゲットに炎症臓器6。
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Protocol
1。マウス骨髄細胞の単離
- 機関の動物ケア委員会が承認したプロトコルを使用して、マウスを安楽死させると70％エタノールで動物の表面にスプレーします。
- 半ば腹部の皮膚の切開を行い、下肢をカバーする皮膚を含むマウスの遠位部から皮膚を除去。
- はさみを使って下肢から筋肉を切断して大腿骨頭を壊す避けながら慎重に、股関節から寛骨臼を脱臼。
- メスやハサミを使用して大腿骨と脛骨から残りの筋肉を取り出し、骨端を壊さないために膝関節運動のケアで脛骨から大腿骨を分離する。氷冷RPMI 10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した1640 1Xを含むペトリ皿に骨を置きます。
- 組織培養フードの下には、次の手順に進んでください。 neutrophiを避けるために、厳格な無菌技術を維持するために余分な予防措置を取るLの活性化。
- 骨の表面からエタノールを洗い流すための氷冷滅菌PBS（ペトリ皿内）で3回洗浄し、その後の70％エタノール（シャーレ内）で各ボーンをすすぐ。
- 清潔な滅菌ペトリ皿の中では、骨の骨端を切断し、それらを脇に保つ。
- 25ゲージ針とRPMI、10％FBSおよび2mM EDTAを補充し、100μmのを取り付けた50mlスクリュートップファルコンチューブに骨軸の両端から骨髄細胞をフラッシュで満たされた12 ccの注射器を使用してフィルタ。効率的に全ての細胞を除去するために、25ゲージ針を用いて骨の内側表面をこすり。
注：骨のブランチングは、細胞が十分に削られていることを示しています。
注：大腿骨/脛骨ペアをフラッシュするために、メディアの約10ミリリットルを使用してください。媒体へのEDTAを添加すると、細胞の凝集を防ぐことが不可欠である。
- 骨骨端をカットメスで小0.5〜1ミリメートル3個および2.5ミリリットルエッペンドルフCombitipプラスBiopurピペットチップのバックエンドを使用して100μmのフィルターを介してそれらを破る。
- 4℃で7分間1,400 rpmで遠心
- 約20秒間のNaCl 0.2％20mlに細胞ペレットを再懸濁することにより、赤血球を溶解、1.6％のNaClを20ml加えた。 （クリティカル：骨髄細胞死を回避するために低張溶解の20〜30秒を超えないように、後者は好中球を活性化する可能性を秘めているので、溶解のために低張塩化ナトリウムの使用はACK溶解バッファーに推奨されます。）
- 4で1,400 rpmで7分間遠心℃で細胞を収集する。
- 10％FBSおよび2mM EDTAを添加したRPMI 1640 1Xで細胞を洗浄し、ステップ1.12のように遠心分離。
- この方法を用いて骨髄細胞の収率は約60から80000000まで非感染8-12週齢のC57BL / 6マウス当たりである。
2。好中球の分離密度勾配遠心分離によって
- 骨髄細胞をカウントし、氷冷滅菌1mlのPBSに再懸濁する。
- 15 mlコニカルチューブにHISTOPAQUE 1119 3mlの（密度、1.119グラム/ ml）を追加します。
- HISTOPAQUE 1119 3mlの上HISTOPAQUE 1077のオーバーレイ3ミリリットル（密度、1.077グラム/ ml）を。
注：1119年と1077 HISTOPAQUE HISTOPAQUE℃を使用する前に18-26に温めなければならない。
重要なステップ：事前に勾配の準備として使用直前に勾配を準備するには、2つの層と、次善の好中球の純度と回収の間の拡散になります。
重要なステップ：遠心分離中の細胞分離を排除する2つの密度を混合することを避けるために徐々に行われるように1119年のニーズ以上のオーバーレイHISTOPAQUE 1077、。
- HISTOPAQUE 1077の上に骨髄細胞懸濁液を重ねる。
重要なステップ：Overl細胞および1077 HISTOPAQUEの間の界面を乱すことを避けるためにゆっくりと行わなければならHISTOPAQUE 1077ニーズ上で骨髄細胞懸濁液をアイイング。
注：1mlのPBSで非感染マウスからの骨髄細胞を再懸濁することが> 90％の純度好中球が得られる。しかし、多くの骨髄サンプルをプールすると好中球純度が損なわれ、例えば、3で300×10 6個の細胞を再懸濁mlのPBSは、> 90％〜80％好中球純度を低減します。したがって、研究者は彼らの特定の実験のために理想的な細胞数/ボリュームの条件を識別するためのパイロット実験を行う必要があります
- 25℃で2,000 rpmで30分間、°ブレーキなしC遠心。
注：室温で勾配の遠心分離は、クリティカルおよび好中球の効果的な分離のために不可欠です。
- 1119 HISTOPAQUEとHISTOPAQUE 1077層の界面に好中球を収集します。 4で7分間1,400 rpmで10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび遠心℃までで補充1640 1X RPMIで二回収集した好中球を洗う
- 好中球をカウントし、その実行可能性を決定する。
注：好中球は、典型的には> FACS分析により測定した95％の生存及び> 90％純粋。感染していない8-12週齢のC57BL / 6マウスの骨髄からの好中球の典型的な収量（ すなわち 2大腿骨と2脛骨の骨）〜6から12000000細胞です。好中球は、感染した動物の骨髄から採取されている場合、この番号は、実質的に大きい。 カンジダ感染マウスの細胞採取6のために使用されたときしたがって、〜30から40000000好中球/マウスを回収した。
3。 CellTracker染料を使用した好中球のラベル
- 37℃で温め℃のPBSで5×10 6細胞/ mlで好中球を再懸濁し
- 最後のコンセントでCellTracker染料を追加5μMの配給。
注：CellTrackerグリーン（CMFDA（5 - Chloromethylfluoresceinジアセテート）およびCellTrackerオレンジ（CMTMR（5 - （および-6） - 4 - クロロベンゾイルアミノテトラメチルローダミン）は、示差野生型および遺伝子欠損から好中球を標識するために、このプロトコルで使用されたマウス。
注：実験の日まで、-80℃で10 CellTrackerグリーンのMMとCellTrackerオレンジ、アリコート、店舗の原液°Cを準備します。
- 暗闇の中で振盪水浴中で37℃で10分間対応CellTracker色素の5μMと好中球をインキュベートする。
- 氷冷RPMI 10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した1640 1Xで細胞を2回洗浄します。
注：細胞の効率的な洗浄CellTracker色素で標識のステップはダウンのために差動で標識した好中球集団を混合する前に染料交差汚染を回避することが不可欠である後TREAM競争再増殖研究。
4。フローサイトメトリーを使用して転送好中球のマウスおよび分析における好中球の養子移入
- 25×10 6細胞/ mlと5×10 6好中球がマウスごとに転送されるように、横方向の尾静脈に懸濁液を200μlを注入の濃度で氷冷PBSで再懸濁し好中球。競争力の再増殖の好中球の研究のために、1:1の比率で、野生型および遺伝子欠損好中球を混ぜて、上記のようにマウス当たり5×10 6の好中球の合計を注入。
注：少なくとも、最大10×10 6好中球が養子動物に明らかな即時の毒性なしマウスごとに転送することもできる。
- 養子移入（ 例えば、1、2、3又は4時間後の転写）後異なる時間で、マウスおよび収穫血を安楽死させる、および/ またはその他の骨髄および/ または他の標的器官（単数または複数）。
- SIを準備公開プロトコル6,15を使用して養子移入ラベル好中球の定量的および定性的な分析のために、これらの組織からngle細胞懸濁液。
- LIVE / DEAD生存染色およびFcの封鎖、CD45（クローン30-F11）とラベル細胞Ly6G（クローン1A8）とのCD11b（M1/70クローン）とゲートライブCD45 + Ly6G +のCD11b +好中球上の次のこのゲートで好中球はFITC +（CellTrackerグリーンで標識されている場合）またはPE +（セルトラッカーオレンジで標識されている場合）であるレシピエントマウスのネイティブ好中球と同様、養子移入ラベル好中球を含む。
注：好中球は、少なくとも4時間後に転送するためにカンジダ感染マウスの血液、骨髄、腎臓で追跡することができる。
注：PBS中2％パラホルムアルデヒドで固定が悪影響CellTracker Grので標識された好中球の平均蛍光強度には影響を与えません少なくとも48時間EENまたはCellTrackerオレンジ。
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Representative Results
このプロトコルは、マウスからの骨髄細胞と市販のHISTOPAQUE細胞分離媒体を用いた密度勾配遠心分離によりこれらの細胞から好中球のその後の分離を収穫するために最適化される。この方法を用いて単離された好中球は、下流の機能研究のex vivoでの様々なレシピエントマウスにおける養子移入実験のために使用することができる。
感染していない8-12週齢のC57BL / 6マウス当たり大腿骨と脛骨の両方から骨髄細胞の集合体の典型的な収率は〜94から98パーセントの生存で〜60から80000000細胞です。これらの細胞の下流の密度勾配遠心分離HISTOPAQUE密度分離媒体を使用して、典型的には感染していないマウス当たり約6から12000000好中球が得られる。フローサイトメトリー（ 図1）によって確認として好中球は80〜95％の純度であり、> 95％の生存。それは密度の前に、いくつかの動物からプール骨髄細胞には可能ですが勾配遠心分離工程、プーリング細胞はわずかに単離された好中球の純度を低下させる。 PBS収率> 90％純粋好中球の1-3 mlの1非感染マウス由来の60から80000000骨髄細胞を重ねながら〜3億骨髄細胞を3に一緒にプールされている場合、例えば、セルの純度は約80％まで低下PBSと重ねmlの。
さらに、このプロトコルは、フローサイトメトリーを使用して、レシピエントマウスへの養子移入細胞の追跡を可能にするCellTracker染料と好中球のその後の標識のための手順が記載されている。 CMFDAまたはCMTMRの5μMと好中球の標識は、標識された好中球は、（データは示されていない）> 95％生存したままとして好中球の生存に影響を与えるようには見えない。ラベルされた好中球は、ライブCD45にゲーでフローサイトメトリーを用いた養子移入後少なくとも4時間のために、さまざまなマウス組織に追跡することができる+ Ly6G +のCD11b +細胞（ 図2）。競争力の再増殖の研究で、野生型と比較し遺伝子欠損好中球差ラベリング染料の使用は、特定の標的臓器への血液からの好中球の人身売買の特定の遺伝子（ 例えば化学誘引物質受容体6）の直接的な役割の評価を可能にします。
図1。密度勾配遠心分離プロトコルを使用して、感染していないC57BL / 6マウスの骨髄細胞から単離された好中球の描写FACSプロットは、左側のパネルには、前方に使用しHISTOPAQUE 1119とHISTOPAQUE 1077インタフェースから収集された骨髄細胞のために使用される初期ゲーティングを示す側方散乱（FSC / SSC）。図示のように、インターフェースから集めた好中球は、> 90％純粋（中央のパネル）と> 95％の実行可能（右パネル）です。
<IMG ALT = "図2" SRC = "/ files/ftp_upload/50586/50586fig2.jpg" />
図2。受信者カンジダ感染C57BL / 6マウス4時間以下の細胞移動の血液、骨髄、腎臓から採取養子移入CMTMR標識された好中球の描写FACSプロット。養子移入CMTMR標識された好中球PE-陽性であると区別することができるPE-陰性であるレシピエントマウスのネイティブ好中球、。のCD11bの発現は、血液や骨髄から採取した好中球に比べて腎臓から採取した好中球の方が大きいことに注意してください。腎臓好中球のCD11b発現の増加は、前の結果15と一致しており、おそらく全身性カンジダ症のマウスモデルにおける主な標的器官である腎臓のエントリ時の細胞の活性化を反映している。
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Discussion
本明細書で我々は、密度勾配遠心分離法を用いて高純度及び生存したマウスの骨髄からの好中球、多数の単離のための信頼できる、簡単、迅速かつ経済的なプロトコルを提示する。このプロトコルが正しく実行された場合、〜6-12×10 6の好中球は、感染マウスから回収することができ、などの多く〜として30〜40×10 6好中球は、感染後6マウスから単離することができる。隔離された好中球は、80から95までパーセント純粋で> 95％で生存可能である。
骨髄は、下流の機能的研究と養子移入実験用マウスの好中球を得るのに適したリザーバである。まず、予め両区画からの細胞が同様の酸化的破壊及び脱顆粒16を呈するように骨髄好中球は、マウスの血中好中球と機能的に類似していることが示されている。第二に、マウス骨髄好中球protrに耐えることが示されているマウス血好中球16に比べてかなり長い、文化の中での時間の期間を務めた。したがって、血中好中球上の骨髄を採取する機能アッセイを ex vivoでのために処理された細胞のより利回りのため可能性があります。骨髄からの好中球の第三に、アイソレーションは定常状態で、感染後の両方下流養子移入実験のために十分である好中球、有意に大きい数字を回復することの利点を提供しています。その代わり、かなり少なく好中球であっても感染後、マウスの血液から回収され、多くはない好中球は、腹腔内に安定した状態で存在することができます。したがって、チオグリコール酸又は他の薬剤は、典型的には腹膜内に活性化好中球の動員を促進するために使用され、この方法は、腹腔急性炎症性滲出液（未発表、データは示さず）および好中球活性化された表現型の誘導内の好中球の可変純度によって妨げられているunmanipulatedマウスから回収した未刺激好中球とは異なる電子、。
いくつかの方法は、マウスの骨髄からの好中球の単離のために利用可能です。これらは、（）密度勾配遠心分離は、例えばHISTOPAQUE密度分離媒体を使用して、我々はここに提示一つであり、不連続パーコール勾配17、骨髄細胞を標識している間、（b）は、正の免疫選択アプローチを使用して同様の方法論として近づくなどLy6G、および好中球などの好中球特異的抗体は、その後、（c）は、骨髄細胞が抗体のカクテルで標識されている間に負の選択免疫アプローチは、結合することを磁気カラム18、上Ly6G陽性細胞の結合によって濃縮される好中球（Tリンパ球すなわち CD5、Bリンパ球のためCD45R/B220、NK細胞についてCD49b/DX5、肥満細胞と造血幹細胞のためにCD117、F4/80用以外の細胞でマクロファージおよび赤血球TER119）11、次いで好中球を磁気カラムに結合しない細胞の抗体陰性画分として溶出することにより濃縮され、骨髄細胞は、抗体で標識されている間、（d）は、蛍光活性化細胞選別、好中球および他の細胞、および好中球上の結合は、その後、Ly6GのCD11bとの組み合わせとして好中球のマーカーに対して陽性である細胞として蛍光活性化セルソーターを用いて分離される。
ポジティブ免疫選択アプローチや蛍光活性化細胞選別の両方がマウスの好中球の非常に高い収率と純度を提供しますが、これらの方法は、欠点は、標識剤は、潜在的にその機能を変えることができる好中球の表面に結合することが我々のプロトコルに比べて持っている。ポジティブ免疫選択的アプローチは、抗体標識好中球がS用の磁気カラムにバインドするという追加の制限がありまた、細胞機能に影響を与える可能性がeparation。蛍光活性化細胞選別はかなり長い時間が悪影響半減期が短いによる好中球の生存に影響を与える可能性が実験室コア施設で蛍光活性化セルソーターを用いて細胞を収集するために必要とされるというさらなる欠点を有している。本手法は、不連続パーコール勾配を使用して密度勾配遠心法と同等であるが、積層2 HISTOPAQUE密度分離媒体は、積層に比べてPBSで体積/体積55％、65％、75％からなるパーコール勾配技術的にそれほど困難である、これは、しばしば、三層の間に小さな密度差によるパーコールインタフェースの混合をもたらす。ネガティブセレクション免疫アプローチに関して、彼らはまた、マウス11の骨髄から高純度及び生存と機能的に有能な好中球の多数の単離のために信頼性があることが報告されている
記載密度勾配遠心分離法を用いて単離された好中球は、食作用、殺、走化性、サイトカイン産生、酸化バースト、公開プロトコル6を用いて脱顆粒アッセイなどの下流の機能的研究のex vivoでのさまざまな目的で使用することができる。さらに、単離された好中球であってもよい養子好中球マウスの生存上の転送や、レシピエントマウスに感染部位におけるサイトカイン産生などの免疫学的相関に転送好中球の効果の役割を評価するために、レシピエント感染マウスに移す。そのために、Tosello Boariらは養子Trypasonoma感染レシピエントマウスに骨髄由来好中球を譲渡し、そのダウンレギュレーションIFN-γ産生感染脾臓、肝臓およびIL-10依存的に19で生存率の改善をもたらした。
さらに、細胞の生存率の明らかな色素誘発低下させることなくCellTracker染料CMFDAとCMTMRと好中にラベルを付ける能力は差動で、様々な遺伝的背景のマウスから好中球をラベルし、フローを使用して別のマウスの標的臓器に養子移入標識細胞を追跡する機会を提供サイトメトリーまたは生体顕微鏡。 CellTracker染料はviablに保持される電子好中球および隣接する細胞に拡散していない。我々の研究では、細胞標識のために5μMの濃度を使用して、我々は成功した好中球の転送6後、少なくとも4時間カンジダ感染レシピエントマウスの血液、骨髄、腎臓中の標識好中球を追跡することができます。 CellTrackerグリーンとCellTrackerバイオレット、CFSEとSNARF-1を含むCellTrackerオレンジ、他の染料のほかにも、養子移入実験11,19,20のラベルマウス骨髄由来好中に正常に使用されている。また、CellTrackerグリーン及びオレンジCellTracker染料を効果的に養子移入および追跡実験21、マウス脾臓T細胞を標識し、5μMの同様の濃度で使用されている。差動で、様々なCellTracker染料と好中球をラベルする能力は異なるとマウスから差別的ラベルの好中球の中で1:1の比率競争再増殖実験を設計するためのことができ遺伝的背景は、養子炎症組織への血液から好中球の輸送に特定の遺伝子の直接的な役割を決定する目的で、レシピエントマウスに転送することができる。我々は最近、組織損傷、腎臓における好中球の過剰な蓄積をもたらす感染症の後期にカンジダ感染腎臓への血液からの好中球のケモカイン受容体CCR1仲介売買ことを報告し、生存6を減少させた。
任意のプロトコルと同様に、我々の手法はまた、制限があります。例えば、血液上で骨髄から好中球を採取するの前述の利点にもかかわらず、採取された細胞の下流の研究用途に応じて、実験結果に影響を及ぼす可能性があり、これら二つの区画から得られた好中球の間の顕著な違いが存在する。具体的には、血中好中球は骨髄短所から好中球のに対し、成熟した細胞である未熟な前骨髄球/骨髄球から成熟好中球が少ない未熟metamyelocytes /バンドフォームへの範囲は、前述の22に記載した3つの異なる集団のイスト。それが以前fMLF（N-ホルミルメ-ロイシル-フェニルアラニン）と粒子23の摂取に好中球応答を報告されたとして、そのため、骨髄や血液の好中球の間に細胞の成熟度の違いは、特定の細胞の機能特性のばらつきにつながる可能性があります。どんな好操作ex vivoでは、細胞活性化およびアポトーシスを引き起こす可能性があるため、勾配遠心分離の際、細胞を取り扱う際さらに、注意が不可欠です。 5μmより大きい濃度でCellTracker染料に悪影響好中球の生存に影響を及ぼす可能性があるため、また、この可能性がテストされる下流の機能アッセイに応じて、個々の研究者によってパイロット実験でテストする必要があります。
要約すると、我々は、事前骨髄からマウスの好中球の多数を収集し、ラベル付けする任意室で使用することができる信頼性と再現性のある方法を送った。このアプローチは、フローサイトメトリーおよび生体顕微鏡による生体養子移入し、追跡実験に含めた好中球の機能研究のさまざまな目的で使用することができる。これとマウスの好中球の浄化、分離、ラベリングと下流の養子移入と追跡研究のための他の信頼できるプロトコルの使用は、分子レベルでの好中球生理学の理解を深める必要があります。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する利害関係を持たないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、アレルギーと国立感染症研究所（NIAID）、国立衛生研究所（NIH）、米国の学内研究部門によってサポートされていました。
すべてのマウスは、アレルギーと国立感染症研究所（NIAID）での実験動物ケア認定の動物施設の認定のためのアメリカ連合に維持され、実験動物のケアと使用のためのガイドで説明する手順に従い、収容されたNIAIDの動物のケアと使用委員会によって承認されたプロトコルの後援の下に。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | GemCell | 100500 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Quality Biological Inc | 351-027-101 | |
| 0.2% and 1.6% sodium chloride | JT Baker | 3624 | Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C-7025 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) | Invitrogen | C-2927 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
| Anti-mouse CD11b (Clone M1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | Use at 1:100 dilution |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Molecular Probes | L-23105 | Use at 1:1000 dilution |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils. | |||
| Materials | |||
| C57BL/6 mice | Taconic | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes (3 ml) | BD Falcon | 357575 | |
| 12 ml syringes | Kendall monoject | 512878 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 mm cell strainers | BD Falcon | 352360 | |
| Bactericidal Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
| Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
| Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel) | Biomedical Research Instruments | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | Instruments sterilized prior to use |
| Equipment | |||
| Tissue culture hood | The Baker Company | SG403 | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37 °C shaking water bath | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol. |
References
- Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22, 891-928 (2004).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu. Rev. Immunol. 30, 459-489 (2012).
- Blomgran, R., Ernst, J. D. Lung neutrophils facilitate activation of naive antigen-specific CD4+ T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. J. Immunol. 186 (12), 7110-7119 (2011).
- Narasaraju, T., Yang, E., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am. J. Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
- Lionakis, M. S., Fischer, B. G., et al. Chemokine receptor Ccr1 drives neutrophil-mediated kidney immunopathology and mortality in invasive candidiasis. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
- Cascão, R., Rosário, H. S., Souto-Carneiro, M. M., Fonseca, J. E. Neutrophils in rheumatoid arthritis: More than simple final effectors. Autoimmun. Rev. 9 (8), 531-535 (2010).
- Denny, M. F., Yalavarthi, S., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J. Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
- Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am. J. Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
- Hasenberg, M., Köhler, A., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).
- Gao, J. L., Lee, E. J., Murphy, P. M. Impaired antibacterial host defense in mice lacking the N-formylpeptide receptor. J. Exp. Med. 189 (4), 657-662 (1999).
- Pruijt, J. F., Verzaal, P., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (9), 6228-6233 (2002).
- Eash, K. J., Greenbaum, A. M., Gopalan, P. K., Link, D. C. CXCR2 and CXCR4 antagonistically regulate neutrophil trafficking from murine bone marrow. J. Clin. Invest. 120 (7), 2423-2431 (2010).
- Lionakis, M. S., Lim, J. K., Lee, C. C., Murphy, P. M. Organ-specific innate immune responses in a mouse model of invasive candidiasis. J. Innate. Immun. 3 (2), 180-199 (2011).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourié, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nüsse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J. Leukoc. Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
- Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J. Immunol. Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).
- Tosello Boari, J., Amezcua Vesely, M. C., et al. IL-17RA signaling reduces inflammation and mortality during Trypanosoma cruzi infection by recruiting suppressive IL-10-producing neutrophils. PLoS Pathog. 8 (4), e1002658 (2012).
- Hattori, H., Subramanian, K. K., et al. Small-molecule screen identifies reactive oxygen species as key regulators of neutrophil chemotaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (8), 3546-3351 (2010).
- Wan, W., Lionakis, M. S., Liu, Q., Roffê, E., Murphy, P. M. Genetic Deletion of Chemokine Receptor Ccr7 Exacerbates Atherogenesis in ApoE-deficient Mice. Cardiovasc. Res. 97 (3), 580-588 (2013).
- Ueda, Y., Kondo, M., Kelsoe, G. Inflammation and the reciprocal production of granulocytes and lymphocytes in bone marrow. J. Exp. Med. 201 (11), 1771-1780 (2005).
- Berkow, R. L., Dodson, R. W. Purification and functional evaluation of mature neutrophils from human bone marrow. Blood. 68 (4), 853-860 (1986).
