Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

분리, 정제 및 기능 연구 및 입양 전송 실험 쥐의 골수 호중구의 라벨링

Published: July 10, 2013 doi: 10.3791/50586

Summary

우리는 밀도 기울기 원심 분리하여 및 CellTracker 염료를 사용하여 호중구 라벨링 마우스 골수에서 호중구의 분리 및 정제를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 스트림 기능 연구 또는 입양 전송 및 추적 실험 호중구의 큰 숫자를 얻기위한 간단하고 빠른 재생하고 경제적 인 방법을 나타냅니다.

Abstract

호중구는 타고난 면역 시스템의 중요한 효과기 세포입니다. 그들은 빠르게 급성 염증의 사이트에서 모집하고 염증 환경에 따라 보호 또는 병원성 효과를 발휘합니다. 그럼에도 불구하고, 다른 전염성 질환 및 염증성 조건에서 호중구의 '음향과 immunopathogenic 효과를 중재하는 분자 요인의 면역 자세한 이해 호중구의 필수 불가결 한 역할에도 불구하고 아직도 부분적으로 때문에 그들의 짧은 반감기, 이들의 처리에 어려움, 부족한 세포 및 다운 스트림 기능 연구와 입양 전송 실험 호중구의 충분한 숫자를 얻기위한 신뢰성있는 실험 프로토콜의 부족. 따라서, 간단하고, 빠르고, 경제적이며 신뢰할 수있는 방법은 식균 작용, 살인, 시토 킨 생산, 탈과립 및 인신 매매 등의 기능을 평가하기위한 마우스 호중구 충분한 수의 수확에 매우 바람직하다. 이를 위해,우리는 높은 순도와 가능성과 생쥐의 골수에서 백혈구의 큰 숫자를 분리하는 어떤 실험실에서 적용 할 수있는 재생 밀도 기울기 원심 분리 기반의 프로토콜을 제시한다. 더욱이, 우리는 adoptively 유동 세포 계측법을 사용하여 적어도 4 시간 후 전송받는 생쥐에 옮겨와 여러 조직에서 추적 할 수있는 고립 된 호중구, 레이블 CellTracker 염료를 사용하는 간단한 프로토콜을 제시한다. 이 방법을 사용하면 다른 CellTracker 염료와 야생형 유전자 결핍 생쥐에서 호중구의 차이 라벨이 성공적으로 생체 내 표적 조직에 혈액에서 호중구의 거래에서 특정 유전자의 직접적인 역할을 평가하기위한 경쟁력을 다시 채우기 연구를 수행하기 위해 고용 수 있습니다 .

Introduction

호중구는 인간의 가장 풍부한 백혈구 수 있습니다. 그들은 미생물 침입에 대한 방어의 첫 번째 라인으로 타고난 면역 시스템과 법의 주요 세포 구성 요소입니다. 호중구 수 및 / 또는 기능에 영향을 인수 호중구 감소증 및 기본 면역 부전 환자 호스트 방어 1이 세포의 중요성을 강조 생명을 위협하는 침입 세균 및 곰팡이 감염을 개발할 수 있습니다. 염증 조직 2에 혈류에서 채용 호중구 수있는 화성 그라데이션을 생성 chemoattractants의 분비로 연결 조율 타고난 면역 반응의 유도에 자신의 동족 패턴 인식 수용체 결과에 감염 사이트에서 병원균 침입의 면역 인식 . 호중구는 감염 사이트를 입력 한 후, 그들은 활성화되고, 이는 사이토 카인과 케모카인 생산, 병원균의 이해에 이르게하고, 산화 비 산화 나를 통해 살해chanisms 3. 타고난 면역 자신의 잘 인식 역할 외에, 호중구는 최근 효과적인 적응 면역 반응 4 개시로 중요한 역할을 보여왔다. 5-7 감염 및 면역 질환의 다양한 같이 다른 한편으로는, 떨어져 면역 자신의 보호의 역할에서, 호중구는 또한 과도한 축적 및 / 또는 염증의 사이트에서 활성화로 인한 조직 손상과 면역 병리를 중재 할 수 있습니다.

설치 효과적인 타고난 면역 반응과 여러 전염성 질환 및 염증, 신뢰성 실험 프로토콜이 세포 부족을 취급와 기술적 인 문제에서의다면 발현 이펙터 기능이있는 호중구의 필수 불가결 한 역할에도 불구하고 지난 수십 년 동안 호중구와 연구를 방해하고있다. 따라서 호중구의 분리에 대한 재현성 분석의 사용은 호중구 매​​개 immunolo에 대한 추가 연구를 촉진해야한다gical 기능 전직 생체 내생체있다. 지금까지 여러 가지 방법이 같은 인간의 혈액의 밀도 기울기 원심 분리 및 마우스 혈액이나 골수 8,9, 마우스 혈액이나 골수 10,11에서 호중구의 긍정적이거나 부정적인 면역 자기 농축으로 호중구의 분리에 대해 설명하고, 수확 한 thioglycollate이나 다른 염증성 에이전트 12의 복강 내 주입 후 생쥐의 복강에서 호중구. 호중구는 쉽게 인간의 혈액에서 큰 숫자에서 격리 할 수 있지만,이 방법은 기능 연구 또는 입양 전송 실험 13 충분한 호중구의 분리를 배제 마우스 혈액의 제한된 볼륨에 의한 생쥐에 최적입니다. 의 수율 thioglycollat​​e가-이끌어하지만 또한 복강에서 세포가 쥐의 혈액에 비해 큰 경우 염증 복막 세척에서 호중구의 순도 사이에 차이가중가와 격리 된 호중구가 활성화 표현형을 나타냅니다. 따라서, 세포는 마우스 복강이 정상 상태 12에서 몇 가지 호중구가이 방법 만, 활성화의 기능 연구를 수행하는 데 사용하지만 자극받지 호중구 수 있습니다 사용하여 수집. 대신, 골수 그런 다음 식균 작용, 살인 및 탈과립, 또는받는 마우스로 입양 전송 등의 다운 스트림 기능을 연구에 사용할 수있는 하나 비자극 또는 활성화 된 호중구 11,14, 많은 수확을위한 편리한 저수지이다.

여기에 우리는 높은 수율을 제공하는 간단하고 빠른 (~ 2 시간) 프로토콜을 설명 (~ 6-12 × 10 6 호중구 / 감염 마우스 또는 최대 30-40 × 10 6 호중구 / 감염된 마우스) 순수 (80 -95 %), 골수에서> 95 % 생존율과 호중구. 이 방법은 밀도 기울기 세포 분리되어 있습니다 시중 Histopaque를 사용Ficoll 나트륨 diatrizoate 구성된 배급 매체는, 마우스의 골수에서 백혈구를 분리합니다. 이 방법은 혈액이나 복막 캐비티에 비해 마우스 당 호중구의 상당히 큰 숫자를 얻을, 그것은 정상 상태에서 또는 감염 후 두 생쥐에서 호중구를 수집하는 데 사용, 그것은 불연속을 사용하는 밀도 기울기 원심 분리 방식에 비해 레이어에 쉽게 할 수 있습니다 55 % / 65 % / PBS 9의 75 % Percoll로 구성된 Percoll 기울기. 또한, 시간과 순수한 호중구를 수집하는 데 필요한 자원이 크게 형광 활성화 된 셀 정렬을 사용하여 호중구의 분리에 비해 감소된다. 또한,이 방법은 면역 자기 농축 단계를 포함하지 않기 때문에,보다 비용 효율적이며, 따라서 호중구 활성화의 가능성을 감소, 자기 열에 항체에 세포의 노출을 방지 할 수 있습니다.

고립 neutroph의 기능 연구를 수행하는 이외에ILS 생체 및받는 생쥐에 세포의 입양 전송이 프로토콜은 서로 다른 CellTracker 염료를 사용하여 격리 된 호중구의 레이블하는 방법을 설명합니다. 다양한 유전 적 배경 생쥐에서 호중구의 차이 라벨은 혈액에서 호중구의 인신 매매의 특정 유전자의 직접적인 역할에 대한 기계론의 통찰력을 제공 할 수있는 유동 세포 계측법을 사용하여받는 사람 쥐의 조직에서 전송 된 호중구를 추적하기위한 경쟁 재 증식 연구에 적용 할 수 있습니다 대상 염증 기관 6에.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 마우스 골수 세포의 분리

  1. 기관의 동물 관리위원회의 승인 프로토콜을 사용하여 쥐를 안락사와 70 % 에탄올과 동물의 표면을 스프레이.
  2. 중반 복부 피부의 절개를 확인하고 하반신을 덮고있는 피부를 포함한 마우스의 말초 부분에서 피부를 제거합니다.
  3. 가위를 사용하여 하반신의 근육을 잘라 대퇴골 머리를 깨고 피하면서 조심스럽게 고관절의 비구를 탈구.
  4. 메스와 가위를 사용하여 대퇴골과 경골에 남아있는 근육을 제거하고 뼈 끝을 중단하지 않도록 무릎 관절 운동 치료의 경골에서 대퇴골을 분리합니다. 10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보충 얼음처럼 차가운 RPMI 1640 1X를 포함하는 페트리 접시에 뼈를 놓습니다.
  5. 조직 문화 후드에서 다음 단계를 진행합니다. neutrophi을 방지하기 위해 엄격한 무균 기술을 유지하기 위해 추가 조치를 취L 활성화.
  6. 뼈의 표면에서 에탄올을 씻어하는 얼음처럼 차가운 멸균 PBS 세 이후의 세척 (배양 접시 내에서) 다음에 70 % 에탄올 (페트리 접시 이내) 각 뼈를 씻어.
  7. 깨끗한 멸균 페트리 접시 안에, 뼈의 epiphyses을 차단하고 따로 보관하십시오.
  8. 25 게이지 바늘과 RPMI 10 % FBS, 2 mM의 EDTA가 첨가 가득 12 CC 주사기를 사용하고, 100 μM가 장착 된 50 ML 나사 최고 팔콘 튜브에 뼈 샤프트의 양쪽 끝에서 골수 세포를 세척 필터링합니다. 효율적으로 모든 세포를 제거하기 위해 25 게이지 바늘을 사용하여 뼈의 안쪽 표면을 긁어.

참고 : 뼈의 창백은 세포가 충분히 긁어되었음을 나타냅니다.

참고 : 대퇴골 / 경골 쌍을 플러시 미디어의 약 10 ㎖를 사용합니다. 매체에 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 추가하면 세포의 응집 방지하기 위해 필수적이다.

  1. 뼈 epiphyses 컷메스와 2.5 ML Eppendorf의 Combitip 플러스 Biopur 피펫 팁의 뒤쪽 끝 부분을 사용하여 100 μm의 필터를 통해 그들을 부수어 작은 0.5 mm 3 조각합니다.
  2. 4 ℃에서 12 분간 1,400 rpm으로 원심 분리
  3. 약 20 초 동안 염화나트륨 0.2 % 20ml에 세포 펠렛을 현탁하여 적혈구를 용해는 1.6 % 염화나트륨 20 mL를 첨가하여. (중요 : 골수 세포 죽음을 피하기 위해 저장성 용해 20 ~ 30 초를 초과하지 마십시오 후자는 호중구를 활성화 할 수있는 잠재력을 가지고 있기 때문에 용해에 대한 저장성 염화나트륨의 사용은 ACK lysing 버퍼에 좋습니다.).
  4. 4에서 1,400 rpm으로 12 분 동안 원심 분리기 ° C 세포를 수집합니다.
  5. 10 % FBS, 2 mM의 EDTA로 보충 RPMI 1640 1X와 세포를 씻고 단계 1.12에서와 같이 원심 분리기.
  6. 이 방법을 사용하여 골수 세포의 수율은 약 60-80000000 감염 8~12주 된 C57BL / 6 마​​우스의 기준입니다.

2. 호중구의 분리밀도 기울기 원심 분리하여

  1. 골수 세포를 계산하고 얼음처럼 차가운 멸균 PBS 1 ML에 resuspend을.
  2. 15 ML 원뿔 튜브에 Histopaque 1119 3 ㎖ (밀도 1.119 g / ㎖)를 추가합니다.
  3. Histopaque 1119 3 ML에 Histopaque 1077의 오버레이 3 ML (밀도 1.077 g / ㎖).

참고 : Histopaque 1119 및 Histopaque 1077는 18-26로 예열해야 ° C 사용하기 전에.

중요한 단계 : 즉시 미리 그라디언트는 두 레이어와 최적 호중구 순결과 복구 사이에 확산 될 것 준비로 사용하기 전에 그라디언트를 준비합니다.

중요한 단계 : 오버레이하기 원심 분리하는 동안 세포 분리를 배제 할 두 가지 밀도, 혼합 방지하기 위해 천천히 수행 할 1119의 요구에 Histopaque 1077.

  1. Histopaque 1077의 상단에 골수 세포 현탁액을 오버레이.

중요한 단계 : Overl세포와 1077 Histopaque 사이의 인터페이스를 방해 방지하기 위해 천천히 수행 할 수 Histopaque 1077의 요구에 골수 세포 현탁액을 아잉.

참고 : PBS 1 ML에 감염되지 않은 쥐의 골수 세포를 현탁하여> 90 %의 호중구 순도를 얻을 수 있습니다. 그러나 많은 골수 샘플을 풀링하여 호중구 순도를 떨어 뜨리고, 예를 들어, 3 ML PBS가 ~ 80 %> 90 %에서 호중구의 순도를 줄일 수있는 300 X 10 6 세포를 현탁. 따라서 연구자들은 특정 실험에 이상적인 세포 수 / 볼륨 상태를 식별하는 파일럿 실험을 수행해야

  1. 25 2,000 rpm에서 30 분 ° 브레이크없이 C를위한 원심 분리기.

참고 : 상온에서 기울기 원심 분리하여 호중구의 효과적인 분리를위한 중요하고 필수적이다.

  1. Histopaque 1119 인터페이스에서 호중구를 수집하고 1077 레이어를 Histopaque. RPMI 두 번 수집 된 호중구를 씻어 1640 1X 10 % FBS, 4시 7 분을위한 1,400 rpm에서 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 원심 분리기 ° C.로 보충
  2. 호중구를 계산하고 자신의 생존을 결정합니다.

참고 : 호중구는 전형적으로> FACS 분석에 의해 결정된 95 %의 생존과> 90 % 순수. 감염 8~12주 된 C57BL / 6 마우스의 골수에서 호중구의 전형적인 수익률 (즉, 2 대퇴골 2 경골 뼈) ~ 6-12000000 세포이다. 백혈구는 감염 동물의 골수에서 수확 할 때이 숫자는 상당히 큽니다. 칸디다 균에 감염된 생쥐 세포 수확 6에 사용되었을 때 따라서, ~ 30-40000000 호중구 / 마우스를 회수 하였다.

3. CellTracker 염료를 사용하여 호중구의 레이블

  1. 5시에 호중구를 resuspend을 X 10 6 세포 / PBS에 ML 37에 prewarmed ° C.
  2. 최종 concent에서 CellTracker 염료를 추가5 μM의 식량.

참고 : CellTracker 그린 (CMFDA (5 Chloromethylfluorescein의 디아) 및 CellTracker 오렌지 (CMTMR (5 - (및-6)-4-클로로 벤조일 아미노 테트라 메틸)는 차동 야생형 유전자 결핍에서 호중구의 레이블이 프로토콜에서 사용 된 마우스.

참고 : 실험 당일까지 -80에서 10 CellTracker 녹색의 mm와 CellTracker 오렌지, 나누어지는 및 매장의 재고 솔루션 ° C를 준비합니다.

  1. 어둠 속에서 떨고 물 목욕 37 ° C에서 10 분에 해당하는 CellTracker 염료의 5 μM로 호중구를 품어.
  2. 10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보충 얼음처럼 차가운 RPMI 1640 1X로 두 번 세포를 씻으십시오.

참고 : 세포의 효율적인 세정 CellTracker 염료와 라벨링 단계는 다운을 위해 차동 - 라벨 호중구 인구를 혼합하기 전에 염색 교차 오염을 방지하는 것이 필수적입니다 후tream 경쟁력을 다시 채우기 연구.

4. 마우스 및 유동 세포 계측법을 사용하여 전송 호중구의 분석에서 호중구의 입양 전송

  1. 25 X 10 6 세포 / ㎖, 5 × 10 6 호중구는 마우스 당 전송되도록 측면 꼬리 정맥에 현탁액 200 μl를 주입 농도에 얼음처럼 차가운 PBS에서 호중구를 Resuspend. 경쟁력을 다시 채우기의 호중구 연구의 경우, 1:1의 비율로 야생형 유전자가 결핍 된 호중구를 혼합하고 상기와 같이 마우스 당 5 × 10 6 호중구의 총을 주입.

참고 : 적어도 최대 10 X 10 6 호중구가 adoptively 동물에 명백한 즉시 독성없이 마우스 당 전송할 수 있습니다.

  1. 입양 전송 (예 : 1, 2, 3 또는 4 시간 후 전송)에 따라 서로 다른 시간에, 마우스 및 수확 혈액을 안락사 및 / 또는 그 골수 및 / 또는 기타 표적 장기 (들).
  2. SI 준비게시 된 프로토콜 6,15를 사용하여 adoptively 전송 표시 호중구의 양적 및 질적 분석을 위해 이러한 조직에서 ngle 세포 현탁액.
  3. 죽은 / 라이브 생존 염색 구단 봉쇄, CD45 (클론 30-F11)의 라벨 세포 Ly6G (복제 1A8)와 CD11b (복제 M1/70) 및 게이트 라이브 CD45 + Ly6G + CD11b + 호중구합니다. 다음 이 게이트 호중구 FITC + (CellTracker 녹색으로 표시하는 경우) 또는 PE + (셀 추적기 주황색으로 표시하는 경우)은 수신자 마우스의 기본 호중구뿐만 아니라 adoptively 전송 표시 호중구를 포함합니다.

참고 : 호중구 적어도 4 시간 후 전송 칸디다 균에 감염된 생쥐의 혈액, 골수 및 신장에서 추적 할 수 있습니다.

참고 : PBS의 2 % 파라 포름 알데히드로 고정 나쁜 CellTracker의 할머니로 표시된 호중구의 평균 형광 강도에 영향을 미치지 않습니다최소 48 시간 동안 een과 나 CellTracker 오렌지.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

이 프로토콜은 쥐의 골수 세포와 시중 Histopaque 세포 분리 매체를 사용하여 밀도 기울기 원심 분리하여 이들 세포에서 호중구의 연속적인 분리의 수확에 최적화되어 있습니다. 호중구는이 방법을 사용하는 것은 다운 스트림 기능 연구 전직 생체의 다양한 사람과받는 사람의 생쥐의 입양 전송 실험에 사용할 수입니다.

감염 8-12주 된 C57BL / 6 마​​우스 당 대퇴골과 경골 모두에서 골수 세포의 컬렉션의 전형적인 수율은 ~ 94~98%의 생존과 ~ 60-80000000 세포이다. 이러한 세포의 하류 밀도 기울기 원심 분리 Histopaque 밀도 분리 매체를 사용하여 일반적으로 감염 마우스 당 ~ 6-12000000 호중구를 얻을 수 있습니다. 호중구 80-95 % 순수하고> 95 % 가능한, 등 유동 세포 계측법 (그림 1)에 의해 확인. 그것은 밀도 전에 여러 동물에서 풀 골수 세포 수는 있지만기울기 원심 분리 단계 풀링 세포가 약간 고립 된 호중구의 순도가 감소합니다. PBS 생산량의 1-3 ML의 한 감염 마우스를 통해 60-80000000 골수 세포를 오버레이하는 동안> 90 % 순수 호중구 예를 들어, 세포의 순도 ~ 3 억 골수 세포가 3에 함께 풀링 할 때 ~ 80 % 감소 PBS 및 오버레이의 ML.

또한,이 프로토콜은 유동 세포 계측법을 사용하여받는 생쥐에 adoptively 전송 세포 추적 할 수 있습니다 CellTracker 염료와 호중구의 후속 표시하는 단계를 설명합니다. 표시 호중구가 남아 CMFDA 또는 CMTMR 5 μM과 호중구의 레이블은 호중구의 생존에 영향을 나타나지 않는다> 95 % 가능한 (데이터 표시되지 않음). 레이블이있는 호중구는 라이브 CD45에 게이팅에 의해 유동 세포 계측법을 사용하여 입양 전송 후 최소 4 시간 동안 다양한 마우스 조직으로 추적 할 수 있습니다 + Ly6G + CD11b + 세포 (그림 2).경쟁력을 다시 채우기 연구에서 야생형 대 유전자가 결핍 된 호중구에서 차동 라벨 염료의 사용은 특정 표적 장기에 혈액에서 호중구의 인신 매매에 특정 유전자 (예 : 화학 주성 물질 (chemoattractant) 수용체 6)의 직접적인 역할을 평가 할 수 있습니다.

그림 1
그림 1. 밀도 기울기 원심 분리 프로토콜을 사용하여 감염되지 않은 C57BL / 6 마우스의 골수 세포에서 분리 된 호중구의 대표 FACS 줄거리. 왼쪽 패널은 앞으로 사용하여 Histopaque 1119 및 Histopaque 1077의 인터페이스에서 수집 된 골수 세포에 사용되는 초기 게이팅을 보여줍니다 측면 산란 (FSC / SSC). 그림과 같이 인터페이스에서 수집 된 호중구> 90 % 순수 (가운데 패널) 및> 95 % 가능한 (오른쪽 패널)입니다.

<IMG 고도 = "그림 2"SRC = "/ files/ftp_upload/50586/50586fig2.jpg"/>
그림 2. 의 대표 FACS의 플롯은 adoptively 전송 CMTMR - 라벨 혈액, 골수받는 사람 칸디다 균에 감염된 C57BL / 6 마우스 4 시간 뒤에 세포 이동의 신장에서 수확 호중구. adoptively 전송 CMTMR - 라벨 호중구는 PE 양성과 차별화 할 수 있습니다 PE-부정적인받는 마우스의 기본 호중구. CD11b의 발현은 혈액과 골수에서 수확 호중구에 비해 신장에서 수확 호중구에서 더되어 있습니다. 신장 호중구에서 CD11b 표현의 증가는 이전의 결과를 15 일치와 가능성 전신 칸디다증의 마우스 모델의 주요 표적 장기 인 신장에있는 항목에 따라 세포의 활성화를 반영합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

여기에 우리는 밀도 기울기 원심 분리 방식을 사용하여 고순도 생존과 생쥐의 골수에서 호중구의 큰 숫자의 절연을위한 신뢰성, 빠르고 간단하고 경제적 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜이 올바르게 수행 될 때, ~ 6-12 × 10 6 백혈구는 감염 마우스에서 복구 할 수 있으며, 많은 ~으로 30 ~ 40 × 10 6 백혈구는 감염 후 6 마우스에서 분리 할 수 있습니다. 격리 된 호중구 80-95 % 순수와> 95 % 가능한입니다.

골수 스트림 기능 연구와 입양 전송 실험 쥐 호중구를 얻기위한 적절한 저수지이다. 첫째, 이전에 두 구획의 세포가 유사한 산화 버스트와 탈과립 16 전시로 골수 호중구 쥐에서 혈액 호중구 기능적으로 유사하다는 것을 보였다. 둘째, 마우스 골수 호중구는 protr 살아 남기 위해 표시되었습니다문화 시간의 행동 기간이 상당히 오래 마우스 혈액 호중구 16에 비해. 따라서 혈액 호중구를 통해 골수의 수확은 기능 분석 전직 생체에 대한 처리 세포의 큰 수익률을 허용 할 수 있습니다. 골수에서 호중구의 셋째, 격리는 정상 상태에서 감염 이후에 스트림 입양 전송 실험에 대한 충분한 호중구의 상당히 큰 숫자를 복구의 이점을 제공합니다. 대신, 훨씬 적은 수의 호중구가도 감염 후, 마우스의 혈액에서 발견, 그리고 많은 호중구는 복강에서 정상 상태로 존재 할 수 있습니다. 따라서, thioglycollat​​e 또는 다른 에이전트는 일반적으로 복막에 활성화 된 호중구의 채용을 촉진하는 데 사용됩니다,이 방법은 복막 급성 염증성 삼출물 (게시되지 않은 데이터가 표시되지 않음) 및 활성화 된 호중구 phenotyp의 유도에서 호중구의 변수 순도에 의해 방해된다unmanipulated 생쥐에서 발견 자극받지 호중구의 다른 전자.

여러 가지 방법이 생쥐의 골수에서 호중구의 분리에 사용할 수 있습니다. 이 (a)는 밀도 기울기 원심 분리 등의 Histopaque 밀도 분리 매체를 사용하여 우리가 여기에서 제시 한, 불연속 Percoll 그라디언트에게 17를 사용하는 유사한 방법론, (B) 골수 세포가 표시되는 동안 긍정적 인 면역 자기 선택 방법과 마찬가지로 접근 포함 같은 Ly6G 및 호중구 등 호중구 항체는 다음 (C) 골수 세포는 항체의 칵테일을 표시하는 동안 부정적인 선택을 면역 자기 방식이 결합하는 자기 열 18 일에 Ly6G-양성 세포의 결합에 의해 충실 (T 림프구에 대한 즉, CD5, B 림프구에 대한 CD45R/B220, NK 세포 CD49b/DX5, 마스트 세포와 조혈 줄기 세포 CD117, F4/80에 대한 호중구가 아닌 다른 세포대식 세포와 적혈구에 대한 Ter119) 11 일 후 호중구는 자기 열에 바인딩하지 않습니다 세포의 항체 음성 인 분수로 용출하여 농축하고, (d) 형광 셀 정렬을 활성화하는 동안 골수 세포는 항체로 표시되어 있습니다 호중구와 다른 세포와 호중구에서 해당 바인딩은 다음과 같은 Ly6G와 CD11b의 조합으로 호중구 마커에 대한 긍정적 인 세포로 형광 활성 세포 분류기를 사용하여 구분됩니다.

긍정적 인 면역 자기 선택 방법과 형광 활성화 된 셀 정렬이 모두 매우 높은 수율 및 마우스 호중구의 순도를 할 수 있지만,이 방법은 라벨 에이전트가 잠재적으로 그들의 기능을 변경할 수있는 호중구의 표면에 바인딩 할 우리의 프로토콜에 비해 단점이 있습니다. 긍정적 인 면역 자기 선택 방법은 항체라는 호중구의에 대한 자기 열을 바인딩하는 추가 제한이또한 세포의 기능에 영향을 미칠 수 eparation. 형광 활성화 된 셀 정렬은 상당히 긴 시간에 악영향을 반감기 자신의 짧은에 의한 호중구의 생존에 영향을 미칠 수있는 실험실의 핵심 시설에 형광 활성 세포 분류기를 사용하여 세포의 수집을 위해 요구되는 추가 단점이있다. 우리의 방법은 불연속 Percoll 기울기를 사용하여 밀도 기울기 원심 분리 방식에 비해이지만, 레이어 두 Histopaque 밀도 분리 미디어 계층화 55 %, 65 % 및 75 %로 구성된 Percoll 기울기를 비교하여 기술적으로 훨씬 더 도전 PBS의 권 / 권 , 이는 종종 세 계층 사이의 작은 밀도 차이로 인해 Percoll 인터페이스의 혼용에 발생합니다. 부정적인 면역 자기 선택 방법에 관해서는, 그들은 또한 쥐 11의 골수에서 고순도 생존과 기능적 능력 호중구의 큰 숫자의 격리를 위해 신뢰할 수있는 것으로보고되었다

설명 밀도 기울기 원심 분리 방법을 사용하여 격리 된 호중구는 등의 식균 작용, 살인, 화성, 시토 킨 생산, 산화 버스트 및 출판 프로토콜 6을 사용 탈과립의 분석과 같은 다운 스트림 기능을 연구 전직 생체의 다양한 사용할 수 있습니다. 또한, 고립 된 호중구 수 있습니다adoptively 호중구 마우스의 생존에 전송하고받는 생쥐에 감염의 사이트에서 사이토 카인 생산과 같은 면역 학적 상관 관계에 전송 호중구의 효과의 역할을 평가하기 위해받는 사람에 감염된 생쥐로 전송. 이를 위해 Tosello Boari와 동료 adoptively Trypasonoma에 감염된받는 마우스, 아래로 조절 IFN-γ에 감염된 비장과 간에서 생산 및 IL-10 의존적으로 19에서 향상된 생존 결과.에 골수 파생 된 호중구 뼈 전송

또한, 세포 생존 능력의 명백한 염료에 의한 감소하지 않고 CellTracker 염료 CMFDA 및 CMTMR와 호중구의 레이블을 할 수있는 능력 차동 다양한 유전 적 배경 생쥐에서 호중구 레이블 및 흐름을 사용하여 다른 마우스 대상 기관에 adoptively 전송 레이블 세포를 추적 할 수있는 기회를 제공 세포 계측법 또는 intravital 현미경. CellTracker 염료는 viabl에 보관됩니다전자 호중구와 인접한 세포에 확산되지 않습니다. 우리의 연구에서 우리는 셀 라벨에 대한 5 μM의 농도를 사용하고 우리는 성공적으로 호중구의 이동 6 후 최소 4 시간 동안 혈액, 골수 및 칸디다 균에 감염된받는 생쥐의 신장에 표시된 호중구를 추적 할 수 있습니다. CellTracker 녹색 및 CellTracker 바이올렛, CFSE와 SNARF-1 등 CellTracker 오렌지, 다른 염료 외에 또한 입양 전송 실험 11,19,20를위한 레이블을 마우스 골수에서 파생 된 호중구에 성공적으로 사용되어왔다. 또한, CellTracker 녹색 및 CellTracker 오렌지 염료를 효과적으로 입양 전송을 위해 마우스 비장 T 세포를 라벨 및 실험하기 21 추적 10 μM의 유사한 농도로 사용되었습니다. 차동 다양한 CellTracker 염료와 호중구의 레이블을 할 수있는 능력이있는 쥐에서 서로 다르게 표시 호중구의 비율이 1:1 다른 경쟁력을 다시 채우기 실험을 설계 할 수 있습니다유전 적 배경이 adoptively 염증 조직으로 혈액에서 호중구의 인신 매매의 특정 유전자의 직접적인 역할을 결정하는 목적으로받는 생쥐에 전송할 수 있습니다. 우리는 최근 칸디다 균에 감염된 신장에 혈액에서 호중구의 케모카인 수용체 CCR1 중개 매매는 감염의 과정에서 늦게 이는 신장 조직 손상에서 호중구의 과도한 축적 결과보고 및 생존을 6 감소했다.

모든 프로토콜과 마찬가지로, 우리의 방법에는 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, 혈액을 통해 골수에서 호중구를 수확 앞서 언급 한 장점에도 불구하고, 수확 세포의 하류 연구 프로그램에 따라서 실험 결과에 영향을 미칠 수있는 두 구획에서 얻은 백혈구 사이에 주목할만한 차이가 있습니다. 특히, 혈액 호중구는 골수 죄수 호중구 반면, 성숙한 세포입니다미숙 promyelocytes / myelocytes에서 성숙 호중구에 덜 성숙 metamyelocytes / 밴드 형태의 범위는, 앞에서 22 설명한 세 가지 모집단의 표준시. 그것은 이전에 호중구 fMLF에 대한 응답 (N-formylmethionyl-leucyl-페닐알라닌) 입자 23의 섭취에 대해보고 된대로, 따라서 골수와 혈액 호중구 사이의 세포 성숙의 차이는 특정 세포 기능 특성의 변화가 발생할 수 있습니다. 모든 호중구 조작 전직 생체 세포 활성화 및 세포 사멸을 초래할 수 있으므로 기울기 원심 분리하는 동안 세포를 처리 할 때 또한주의가 필수적이다. 5 μM보다 큰 농도 CellTracker 염료에 악영향 호중구의 생존에 영향을 미칠 수 있기 때문에,이 가능성을 테스트 할 스트림 기능 분석에 따라, 개별 연구자에 의해 파일럿 실험에서 테스트해야합니다.

요약하면, 우리는 사전에골수에서 마우스 호중구의 큰 숫자를 수집하고 레이블을 어떤 기관에 의해 고용 될 수있는 신뢰성과 재현성 방법을 보냈습니다. 이 방법은 유동 세포 계측법 및 intravital 현미경으로 생체 입양 전송 및 추적 실험 등의 호중구 기능 연구의 다양한 사용할 수 있습니다. 이것의 마우스 호중구 정화, 분리, 라벨링 및 다운 스트림 입양 전송 및 추적 연구를위한 신뢰할 수있는 다른 프로토콜의 사용은 분자 수준에서 호중구 생리학에 대한 우리의 이해를 깊게해야한다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 그들이 더 경쟁 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgments

이 작품은 알레르기 및 전염병 국립 연구소 (NIAID), 국립 보건 연구소 (NIH), 미국의 교내 연구 부문에 의해 지원되었다.

모든 마우스는 알레르기 및 전염병 국립 연구소 (NIAID)에서 실험 동물 관리 공인 동물 시설의 인증을위한 미국 협회에서 관리 및 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서에 설명 된 절차에 따라 보관 하였다 NIAID의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜의 후원하에.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  Reagents
RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES Cellgro 10-041-CV  
Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) GemCell 100500  
Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) GIBCO 15140  
0.5 M EDTA Quality Biological Inc 351-027-101  
0.2% and 1.6% sodium chloride JT Baker 3624 Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered
Sterile filtered Histopaque 1077 Sigma 10771 Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use
Sterile filtered Histopaque 1119 Sigma 11191 Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium Cellgro 210-40-CV  
Ethyl Alcohol (200 proof) The Warner Graham Company 64-17-5  
CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) Invitrogen C-7025 Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) Invitrogen C-2927 Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) eBioscience 170451-82  
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) BD Pharmingen 551461  
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) BD Pharmingen 560599  
Anti-mouse CD11b (Clone M1/70) eBioscience 47-0112-82  
Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) BD Pharmingen 553141 Use at 1:100 dilution
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit Molecular Probes L-23105 Use at 1:1000 dilution
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma 67-68-5  
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS USB Corporation 19943  
  Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils.
  Materials
C57BL/6 mice Taconic  
15 ml centrifuge tubes Corning 430053  
50 ml centrifuge tubes BD Falcon 352070  
25 ml serological pipettes Celltreat 229225B  
10 ml serological pipettes Celltreat 229210B  
5 ml serological pipettes Celltreat 229205B  
Pasteur pipettes (3 ml) BD Falcon 357575  
12 ml syringes Kendall monoject 512878  
25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) BD 305122  
100 mm cell strainers BD Falcon 352360  
Bactericidal Petri dishes BD Falcon 351029  
Combitips Plus Biopur Eppendorf 2249608-5  
Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel) Biomedical Research Instruments 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 Instruments sterilized prior to use
  Equipment
Tissue culture hood The Baker Company SG403  
Refrigerated centrifuge Thermo Fischer Scientific 75004521  
37 °C shaking water bath Thermo Fischer Scientific 3166721  
  Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
  2. Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22, 891-928 (2004).
  3. Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu. Rev. Immunol. 30, 459-489 (2012).
  4. Blomgran, R., Ernst, J. D. Lung neutrophils facilitate activation of naive antigen-specific CD4+ T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. J. Immunol. 186 (12), 7110-7119 (2011).
  5. Narasaraju, T., Yang, E., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am. J. Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
  6. Lionakis, M. S., Fischer, B. G., et al. Chemokine receptor Ccr1 drives neutrophil-mediated kidney immunopathology and mortality in invasive candidiasis. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
  7. Cascão, R., Rosário, H. S., Souto-Carneiro, M. M., Fonseca, J. E. Neutrophils in rheumatoid arthritis: More than simple final effectors. Autoimmun. Rev. 9 (8), 531-535 (2010).
  8. Denny, M. F., Yalavarthi, S., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J. Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
  9. Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
  10. Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am. J. Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
  11. Hasenberg, M., Köhler, A., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).
  12. Gao, J. L., Lee, E. J., Murphy, P. M. Impaired antibacterial host defense in mice lacking the N-formylpeptide receptor. J. Exp. Med. 189 (4), 657-662 (1999).
  13. Pruijt, J. F., Verzaal, P., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (9), 6228-6233 (2002).
  14. Eash, K. J., Greenbaum, A. M., Gopalan, P. K., Link, D. C. CXCR2 and CXCR4 antagonistically regulate neutrophil trafficking from murine bone marrow. J. Clin. Invest. 120 (7), 2423-2431 (2010).
  15. Lionakis, M. S., Lim, J. K., Lee, C. C., Murphy, P. M. Organ-specific innate immune responses in a mouse model of invasive candidiasis. J. Innate. Immun. 3 (2), 180-199 (2011).
  16. Boxio, R., Bossenmeyer-Pourié, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nüsse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J. Leukoc. Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
  17. Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
  18. Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J. Immunol. Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).
  19. Tosello Boari, J., Amezcua Vesely, M. C., et al. IL-17RA signaling reduces inflammation and mortality during Trypanosoma cruzi infection by recruiting suppressive IL-10-producing neutrophils. PLoS Pathog. 8 (4), e1002658 (2012).
  20. Hattori, H., Subramanian, K. K., et al. Small-molecule screen identifies reactive oxygen species as key regulators of neutrophil chemotaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (8), 3546-3351 (2010).
  21. Wan, W., Lionakis, M. S., Liu, Q., Roffê, E., Murphy, P. M. Genetic Deletion of Chemokine Receptor Ccr7 Exacerbates Atherogenesis in ApoE-deficient Mice. Cardiovasc. Res. 97 (3), 580-588 (2013).
  22. Ueda, Y., Kondo, M., Kelsoe, G. Inflammation and the reciprocal production of granulocytes and lymphocytes in bone marrow. J. Exp. Med. 201 (11), 1771-1780 (2005).
  23. Berkow, R. L., Dodson, R. W. Purification and functional evaluation of mature neutrophils from human bone marrow. Blood. 68 (4), 853-860 (1986).

Tags

면역학 제 77 세포 생물학 감염 전염병 분자 생물학 의학 생명 공학 생명 공학 호중구 입양 전송 면역학 호중구 마우스 골수 입양 전송 밀도 기울기 라벨 CellTracker 세포 절연 유동 세포 계측법 동물 모델
분리, 정제 및 기능 연구 및 입양 전송 실험 쥐의 골수 호중구의 라벨링
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Swamydas, M., Lionakis, M. S.More

Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J. Vis. Exp. (77), e50586, doi:10.3791/50586 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter