Summary
Descreve-se um protocolo para o isolamento e purificação de neutrófilos de medula óssea do rato por centrifugação de gradiente de densidade e de neutrófilos para rotulagem com corantes CellTracker. Isso representa um método simples, rápido, reprodutível e econômica para a obtenção de um grande número de neutrófilos para estudos funcionais a jusante ou de transferência e controle de experimentos adotivos.
Abstract
Os neutrófilos são células efetoras críticos do sistema imune inato. Eles são rapidamente recrutados em locais de inflamação aguda e exercem efeitos protectores ou patogénicos, dependendo do meio inflamatório. No entanto, apesar de o papel indispensável dos neutrófilos na imunidade, a compreensão detalhada dos fatores moleculares que medeiam efeitos efetoras e imunopatogênico 'neutrófilos em diferentes doenças infecciosas e inflamatórias ainda está faltando, em parte por causa de sua meia-vida curta, as dificuldades com a manipulação destes células ea falta de protocolos experimentais confiáveis para a obtenção de um número suficiente de neutrófilos para estudos funcionais jusante e experimentos de transferência adotiva. Portanto, os métodos simples, rápido, econômico e confiável são altamente desejáveis para a colheita de um número suficiente de neutrófilos de rato para avaliar funções, tais como fagocitose, morte, produção de citocinas, degranulação e tráfico. Para esse fim,apresentamos um protocolo de gradiente de densidade reprodutíveis baseado centrifugação, que pode ser adaptada em qualquer laboratório para isolar um grande número de neutrófilos na medula óssea de ratinhos com elevado grau de pureza e viabilidade. Além disso, apresenta-se um protocolo simples, que utiliza tintas, CellTracker para rotular os neutrófilos isolados, que podem então ser transferidos adoptivamente para ratinhos receptores e rastreadas em vários tecidos, pelo menos, quatro horas após a transferência usando citometria de fluxo. Utilizando esta abordagem, a rotulagem diferencial de neutrófilos de ratinhos de tipo selvagem e o gene deficiente, com diferentes corantes CellTracker pode ser empregue com sucesso para realizar estudos de repovoamento competitivo para avaliar o papel directo de genes específicos no tráfico de neutrófilos do sangue para os tecidos alvo in vivo .
Introduction
Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes nos seres humanos. Eles são o principal componente celular do sistema imune inato e agir como uma primeira linha de defesa contra microorganismos invasores. Pacientes com neutropenia adquirida e imunodeficiências primárias que afetam os números de neutrófilos e / ou função desenvolver infecções bacterianas e fúngicas invasoras que ameaçam a vida, destacando a importância dessas células na defesa do hospedeiro 1. O reconhecimento imunológico dos patogénios invasores no local da infecção pelo seu padrão de reconhecimento de receptores de cognato resulta na indução de uma resposta imune inata orquestrada, o que leva à secreção de quimioatractivos que geram um gradiente quimiotáctica capaz de recrutamento de neutrófilos a partir da corrente sanguínea para o tecido inflamado 2 . Depois de introduzir os neutrófilos no local da infecção, eles tornam-se activados, que conduz à produção de citocinas e quimiocinas, absorção de agente patogénico, e me matar através oxidativo e não-oxidativochanisms 3. Além de seu papel bem reconhecida na imunidade inata, os neutrófilos têm também sido mostrado recentemente a desempenhar papéis importantes como iniciadores da resposta imune adaptativa eficaz 4. Por outro lado, para além do seu papel na imunidade de protecção, os neutrófilos podem também mediar lesão tecidual e imunopatologia devido à acumulação excessiva e / ou activação em locais de inflamação, como se mostra em uma variedade de doenças infecciosas e auto-imunes 5-7.
Apesar de o papel indispensável de neutrófilos em montagem respostas imune inata eficazes e suas funções efetoras pleiotrópicos em várias doenças infecciosas e inflamatórias, dificuldades técnicas com a manipulação dessas células ea falta de protocolos experimentais de confiança tem dificultado a pesquisa com neutrófilos nas últimas décadas. Portanto, a utilização de ensaios reprodutíveis para o isolamento dos neutrófilos devem facilitar a investigação sobre neutrófilos mediada imunológicasfunções gica ex vivo e in vivo. Até à data, vários métodos têm sido descritos para o isolamento de neutrófilos, tais como a centrifugação do gradiente de densidade de sangue humano e de rato, ou medula óssea 8,9, enriquecimento imunomagnética positiva ou negativa dos neutrófilos do sangue ou da medula óssea do rato 10,11, e colhendo de neutrófilos da cavidade peritoneal de ratinhos a seguir à injecção intraperitoneal de tioglicolato ou outros agentes inflamatórios 12. Apesar de neutrófilos pode ser facilmente isolado em grande número a partir do sangue humano, este método é de qualidade inferior em ratos devido ao volume limitado de sangue de rato que impede o isolamento de neutrófilos suficientes para estudos funcionais ou experimentos de transferência adotivos 13. Além disso, embora o rendimento de tioglicolato-induziu as células da cavidade peritoneal é maior comparada com a de rato no sangue, a pureza dos neutrófilos na lavagem peritoneal inflamatória varia entre60-90%, e os neutrófilos isolados apresentam um fenótipo activado. Assim, as células recolhidas utilizando este método só pode ser utilizado para a realização de estudos funcionais activados, mas não de neutrófilos não estimulados, como a cavidade peritoneal do rato tem alguns neutrófilos no estado estacionário 12. Em vez disso, a medula óssea é um reservatório conveniente para colheita de grandes números de neutrófilos, quer não estimuladas ou ativadas 11,14, que podem então ser utilizadas para estudos funcionais a jusante, tais como fagocitose, matando e desgranulação, ou por transferência adoptiva em ratinhos receptores.
Aqui nós descrevemos um método simples e rápido (~ 2 horas) protocolo, o que proporciona um alto rendimento (~ 6-12 × 10 6 neutrófilos / mouse não infectado, ou até 30-40 × 10 6 neutrófilos / mouse infectados) de puro (80 -95%) neutrófilos com> 95% de viabilidade a partir da medula óssea. Este método utiliza Histopaque disponíveis comercialmente, que são a densidade de célula separada gradientemeios ração consistindo de Ficoll e diatrizoato de sódio, para separar os neutrófilos a partir da medula óssea de ratinhos. Este método produz números significativamente maiores de neutrófilos por ratinho em comparação com o sangue ou da cavidade abdominal, que pode ser utilizado para recolher os neutrófilos a partir de ratos, tanto no estado estacionário, ou após a infecção, e que é mais fácil a camada de comparação com o método de centrifugação em gradiente de densidade descontínuo que utiliza gradientes de Percoll consistem em 55% / 65% / 75% de Percoll em PBS 9. Além disso, o tempo e os recursos necessários para recolher neutrófilos puras são significativamente diminuída comparada com o isolamento dos neutrófilos utilizando separação de células activada por fluorescência. Além disso, porque este método não envolve uma etapa de enriquecimento imunomagnética, é mais rentável, e evita a exposição das células à coluna magnética e anticorpos, diminuindo assim a probabilidade de activação de neutrófilos.
Além de realizar estudos funcionais de neutroph isoladoils ex vivo e transferência adoptiva de células em ratinhos receptores, este protocolo também descreve um método para a marcação de neutrófilos isolados, utilizando diferentes corantes CellTracker. Rotulagem diferencial de neutrófilos de ratos de diferentes origens genéticas pode ser adaptado em estudos de repovoamento competitivos para acompanhar os neutrófilos transferidos em tecidos de camundongos destinatário usando citometria de fluxo, o que pode fornecer uma visão mecanicista sobre o papel direto de genes específicos no tráfico de neutrófilos do sangue em órgãos-alvo inflamadas 6.
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Protocol
1. Isolamento de rato Células da Medula Óssea
- Eutanásia camundongos usando o protocolo cuidados com os animais da instituição comitê-aprovado e pulverizar a superfície animal com etanol 70%.
- Realizar uma incisão da pele, em meados dos abdómen e remover a pele a partir da parte distal do rato, incluindo a pele que cobre as extremidades inferiores.
- Cortar os músculos dos membros inferiores usando tesoura e deslocar cuidadosamente o acetábulo do quadril, evitando quebrar a cabeça do fêmur.
- Remova os músculos remanescentes do fêmur e da tíbia utilizando um bisturi e tesoura e separar o fêmur da tíbia no joelho cuidado exercitar para não quebrar as extremidades ósseas. Colocar os ossos numa placa de Petri contendo gelada 1X RPMI 1640 suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina / estreptomicina.
- Prossiga com as seguintes etapas sob uma capa de cultura de tecidos. Tome precauções extras para manter técnicas estéreis rigorosas para evitar neutrophiativação l.
- Lavar cada osso com etanol a 70% (dentro de uma placa de Petri), seguido de três lavagens subsequentes em PBS gelado (estéril dentro de placas de Petri) para enxaguar o etanol a partir da superfície dos ossos.
- Dentro de uma placa de Petri estéril limpo, cortar as epífises dos ossos e mantê-los de lado.
- Utilize uma agulha de calibre 25 e uma seringa de 12 cc cheio com meio RPMI suplementado com 10% de FBS e 2 mM de EDTA, e lave as células da medula óssea a partir de ambas as extremidades dos veios de osso em um ml de tampa de rosca tubo Falcon de 50 equipado com um 100 um filtrar. De modo a remover de forma eficiente todas as células, raspar a superfície interior dos ossos utilizando a agulha de calibre 25.
NOTA: O branqueamento dos ossos indica que as células tenham sido suficientemente raspada.
NOTA: Use aproximadamente 10 ml de mídia para liberar um fêmur / par tíbia. Adição de EDTA para o meio é essencial para prevenir a aglutinação das células.
- Corte as epífises ósseasem pequenos 0,5-1 mm 3 peças com um bisturi e esmagá-los através do filtro 100 mM utilizando o back-end de um 2,5 ml Eppendorf Combitip Além disso Biopur ponteira.
- Centrifugar a 1400 rpm durante 7 minutos a 4 ° C.
- Lisar as células vermelhas do sangue por ressuspensão do sedimento celular em 20 ml de 0,2% de NaCl por aproximadamente 20 seg, seguido pela adição de 20 ml de 1,6% de NaCl. (Crítica: Não exceda 20-30 seg de lise hipotônica para evitar a morte de células de medula óssea O uso de NaCl para a lise hipotônica é recomendado em tampão de lise ACK porque este último tem o potencial de ativar os neutrófilos.).
- Centrifugar durante 7 min a 1400 rpm a 4 ° C para recolher as células.
- Lavar as células com meio RPMI 1640 suplementado com 1X SBF a 10% e EDTA 2 mM e centrifugar tal como no passo 1.12.
- O rendimento de células da medula óssea, utilizando este método é cerca de 60-80 milhões por não infectado 8-12 semanas de idade C57BL / 6 mouse.
2. Separação de Neutrófilospor Gradiente de Densidade Centrifugação
- Contar as células da medula óssea e ressuspender em 1 ml de PBS gelado estéril.
- Adiciona-se 3 ml de Histopaque 1119 (densidade 1,119 g / ml) num tubo cónico de 15 ml.
- Sobreposição de 3 ml de Histopaque 1077 (densidade 1,077 g / ml), em 3 ml de Histopaque 1119.
NOTA: Histopaque Histopaque 1119 e 1077 deve ser aquecida até 18-26 ° C antes da utilização.
Passo Crítica: Preparar gradientes imediatamente antes da utilização como preparação do gradiente com antecedência irá resultar em difusão entre as duas camadas e de pureza e recuperação de neutrófilos subóptima.
Passo Crítica: Sobreposição sobre Histopaque 1077 1119 precisa ser feito lentamente, a fim de evitar a mistura dos dois densidades, que não permita a separação de células, durante a centrifugação.
- Sobrepor a suspensão de células de medula óssea no topo do Histopaque 1077.
Passo Crítico: Sobrecargaaying a suspensão de células de medula óssea sobre Histopaque 1077 precisa ser feito lentamente, a fim de evitar perturbar a interface entre as células e Histopaque 1077.
NOTA: Ressuspender as células da medula óssea de um rato infectado em 1 ml de PBS produz pureza dos neutrófilos de> 90%. No entanto, reunindo muitas amostras de medula óssea compromete a pureza dos neutrófilos, por exemplo, ressuspensão 300 x 10 6 células em 3 ml de PBS, reduz a pureza dos neutrófilos a partir de> 90% para ~ 80%. Portanto, os investigadores devem realizar experiências-piloto para identificar a contagem / volume condições celulares ideais para seus experimentos específicos
- Centrifugar durante 30 minutos a 2000 rpm a 25 ° C sem travagem.
NOTA: A centrifugação do gradiente à temperatura ambiente é fundamental e essencial para uma separação efectiva das neutrófilos.
- Recolher os neutrófilos na interface do Histopaque 1119 e 1077 Histopaque camadas. Lavar os neutrófilos colhidos duas vezes com RPMI 1640 suplementado com 1X SBF a 10% e 1% de penicilina / estreptomicina e centrifugar a 1400 rpm durante 7 minutos a 4 ° C.
- Conte os neutrófilos e determinar sua viabilidade.
NOTA: Os neutrófilos são tipicamente> 95% viáveis e> 90% de pureza tal como determinado por análise FACS. O rendimento típico de neutrófilos na medula óssea (isto é, 2 fémur e os ossos da tíbia 2) de uma não infectada 8-12 semanas de idade C57BL / 6 de rato é de ~ 6-12 milhões de células. Este número é substancialmente maior quando os neutrófilos são colhidas a partir da medula óssea de animais infectados. Assim, ~ 30-40000000 neutrófilos / mouse foram recuperados quando os ratos Candida infectados foram utilizados para a colheita de 6 células.
3. Rotulagem de neutrófilos utilizando corantes CellTracker
- Ressuspender as neutrófilos a 5 x 10 6 células / ml em PBS pré-aquecido a 37 ° C.
- Adicionar um corante CellTracker numa concent definitivoração de 5 mM.
NOTA: CellTracker Verde (CMFDA (diacetato de 5-Chloromethylfluorescein) e CellTracker laranja (CMTMR (5 - (e-6)-4-clorometil tetrametilrodamina Amino benzoíla) foi utilizado neste protocolo para rotular diferencialmente os neutrófilos a partir de tipo selvagem e o gene deficiente ratinhos.
NOTA: Prepare uma solução estoque de 10 mM de Green CellTracker e CellTracker Orange, alíquotas e armazenar a -80 ° C até o dia do experimento.
- Incubar neutrófilos com 5 uM do corante CellTracker correspondente durante 10 min a 37 ° C num banho de água com agitação no escuro.
- Lave as células duas vezes com meio RPMI gelado 1X 1640 suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina / estreptomicina.
NOTA: lavagem eficiente das células após o passo de marcação com o corante CellTracker é essencial para evitar a contaminação cruzada de corante antes de misturar populações de neutrófilos diferencialmente etiquetadas para Downstream estudos repovoamento competitivos.
4. Transferência adotiva de neutrófilos em camundongos e análise de neutrófilos transferidos por citometria de fluxo
- Neutrófilos Ressuspender em PBS arrefecido com gelo, a uma concentração de 25 x 10 6 células / ml e injectar 200 ul da suspensão para dentro da veia lateral da cauda de modo que 5 x 10 6 neutrófilos são transferidos por ratinho. Para os estudos de neutrófilos de repovoamento competitivo, mistura neutrófilos de tipo selvagem e o gene deficiente em uma proporção de 1:1 e injectar um total de 5 x 10 6 por ratinho neutrófilos como acima.
NOTA: pelo menos até 10 x 10 6 de neutrófilos podem ser adoptivamente transferidos por ratinho sem toxicidade imediatamente óbvio para os animais.
- Em diferentes momentos após a transferência adoptiva (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4 horas após a transferência), eutanásia ratos e colheita de sangue e / ou medula óssea e / ou outros órgãos alvo (s) de interesse.
- Prepare siAs suspensões de células ngle destes tecidos para análise quantitativa e qualitativa dos neutrófilos marcados adoptivamente transferidos utilizando protocolos publicados 6,15.
- Após vivo / morto a coloração de viabilidade e bloqueio Fc, as células de etiqueta com CD45 (clone 30-F11), Ly6G (clone 1A8) e CD11b (clone M1/70) e portão vivo na CD45 + + CD11b + Ly6G neutrófilos. Os neutrófilos neste portão incluem neutrófilos nativas do ratinho receptor, bem como os neutrófilos marcados transferidas adoptivamente, que são + FITC (se marcado com CellTracker verde) ou PE + (se marcado com células Rastreio de laranja).
NOTA: Os neutrófilos podem ser rastreadas no sangue, medula óssea e do rim de ratinhos infectados com Cândida por pelo menos 4 horas após a transferência.
NOTA: A fixação com paraformaldeído a 2% em PBS, não afecta negativamente a intensidade de fluorescência média dos neutrófilos marcados com Gr CellTrackereen ou CellTracker laranja por pelo menos 48 horas.
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Representative Results
Este protocolo é otimizado para a colheita de células da medula óssea de camundongos e posterior separação de neutrófilos a partir dessas células por centrifugação em gradiente de densidade, utilizando meios de separação Histopaque celulares disponíveis no mercado. Os neutrófilos isolados utilizando este método pode ser usado para uma variedade de estudos funcionais a jusante ex vivo e para experiências de transferência adoptiva em ratinhos receptores.
O rendimento típico da recolha de células de medula óssea a partir de fémures e tíbias, tanto por não infectado 8-12 semanas de idade C57BL / 6 mouse está ~ 60-80000000 células com uma viabilidade de ~ 94-98%. Centrifugação em gradiente de densidade a jusante dessas células utilizando os meios de separação de densidade Histopaque normalmente produz ~ 6-12.000.000 neutrófilos por rato não infectado. Os neutrófilos são 80-95% puro e> 95% viáveis, tal como verificado através de citometria de fluxo (Figura 1). Embora seja possível para as células da medula óssea a partir de vários animais piscina antes de a densidadepasso de centrifugação em gradiente, as células de agrupamento diminui ligeiramente a pureza dos neutrófilos isolados. Por exemplo, enquanto sobreposta 60-80000000 células da medula óssea a partir de um rato infectado em 1-3 ml de PBS rendimentos> 90% de neutrófilos puro, a pureza celular diminui para 80% quando a ~ ~ 300 milhões de células de medula óssea são agrupados em três ml de PBS e sobreposto.
Além disso, este protocolo também descreve os passos para a rotulagem subsequente dos neutrófilos com corantes CellTracker, o que permite o rastreio de células transferidas adoptivamente para ratinhos receptores, utilizando citometria de fluxo. Rotulagem dos neutrófilos com 5 uM de CMFDA ou CMTMR não parecem afectar a sobrevivência dos neutrófilos como os neutrófilos marcados permanecerem> 95% viáveis (dados não apresentados). Neutrófilos marcada pode ser rastreado em vários tecidos de rato durante pelo menos 4 horas após a transferência adoptiva utilizando citometria de fluxo por gating em vivo Ly6G + CD45 + CD11b + células (Figura 2).O uso de tinturas de rotulagem diferenciais dos neutrófilos do tipo selvagem contra gene deficiente em estudos de repovoamento competitivos permite a avaliação do papel direto de um gene específico (por exemplo, receptor chemoattractant 6) no tráfico de neutrófilos do sangue para um determinado órgão-alvo.
Figura 1. Representativas FACS trama de neutrófilos isolados a partir de células da medula óssea de um C57BL não infectados / 6 rato utilizando o protocolo de centrifugação em gradiente de densidade. O painel da esquerda mostra a propagação inicial utilizada para as células da medula óssea colhidas a partir da interface de Histopaque 1119 e 1077 usando Histopaque frente e dispersão lateral (FSC / SSC). Como mostrado, os neutrófilos coletados a partir da interface são> 90% puro (painel do meio) e> 95% viáveis (painel direito).
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Figura 2. Representativas FACS trama adoptivamente transferidos CMTMR-neutrófilos marcados colhidos a partir de sangue, medula óssea e os rins de um destinatário C57BL Cândida infectado / 6 rato 4 horas após a transferência de células. CMTMR Os neutrófilos marcados com adoptivamente transferidos são PE-positiva e podem ser diferenciados a partir de os neutrófilos nativas do rato recipiente, PE-negativos. Note-se que a expressão de CD11b é maior em neutrófilos colhidos a partir do rim em comparação com os neutrófilos colhidos a partir de sangue e de medula óssea. O aumento na expressão de CD11b em neutrófilos nos rins é consistente com os resultados anteriores 15 e provavelmente reflecte a activação das células após a sua entrada no rim, que é o principal órgão alvo no modelo do rato de candidíase sistémica.
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Discussion
Apresentamos aqui um protocolo seguro, simples, rápido e económico para o isolamento de grandes números de neutrófilos na medula óssea de ratinhos com elevado grau de pureza e viabilidade usando uma abordagem de centrifugação em gradiente de densidade. Quando este protocolo é realizado correctamente, ~ 6-12 x 10 6 neutrófilos pode ser recuperado a partir de um rato não infectado e tantos como ~ 30-40 x 10 6 neutrófilos podem ser isolados a partir de um rato após a infecção, 6. Os neutrófilos são isolados de 80-95% puro e> 95% viáveis.
A medula óssea é um reservatório apropriado para a obtenção de neutrófilos de rato para os estudos funcionais a jusante e as experiências de transferência adoptiva. Em primeiro lugar, tem-se mostrado previamente que os neutrófilos de medula óssea são funcionalmente semelhantes aos neutrófilos no sangue em ratos, tal como as células de ambos os compartimentos apresentam burst oxidativo semelhante e desgranulação 16. Em segundo lugar, os neutrófilos de medula óssea de ratinho foram mostrados para sobreviver protractuado períodos de tempo em cultura, significativamente maior em comparação com os neutrófilos no sangue de rato 16. Portanto, a colheita de medula óssea sobre neutrófilos no sangue poderia permitir uma maior produção de células quando processados por funcional ensaios ex vivo. Em terceiro lugar, o isolamento de neutrófilos da medula óssea oferece a vantagem de recuperação números significativamente maiores de neutrófilos, os quais são suficientes para as experiências de transferência adoptiva a jusante, tanto no estado de equilíbrio e depois da infecção. Em vez disso, um número consideravelmente menor de neutrófilos podem ser recuperados a partir do sangue do rato, mesmo após a infecção, e não muitos neutrófilos estão presentes no estado estacionário no interior da cavidade peritoneal. Assim, tioglicolato ou outros agentes são normalmente usados para promover o recrutamento dos neutrófilos activados no peritoneu; esta metodologia é dificultada pela pureza variável de neutrófilos no exsudado inflamatório agudo peritoneal (dados não publicados, não representada) e a indução de um neutrófilo activada phenotype, que é diferente da dos neutrófilos não estimulados recuperadas a partir de ratinhos não manipuladas.
Vários métodos estão disponíveis para o isolamento dos neutrófilos da medula óssea de ratinhos. Estas incluem: (a) centrifugação em gradiente de densidade de abordagens, como o que aqui apresentamos um que utiliza meios de separação de densidade Histopaque, e uma metodologia semelhante que utiliza gradientes descontínuos de Percoll 17, (b) abordagens de selecção positivos imunomagnéticas, durante o qual as células de medula óssea são marcadas com um anticorpo específico de neutrófilos, tais como Ly6G, e, em seguida, os neutrófilos são enriquecidos por ligação das células Ly6G-positivos sobre uma coluna magnética 18, (c) se aproxima imunomagnéticas selecção negativa, na qual as células de medula óssea são marcadas com um cocktail de anticorpos que se ligam em que os neutrófilos outros (isto é, CD5 para linfócitos T, linfócitos B para CD45R/B220, CD49b/DX5 para células NK, CD117 de mastócitos e células estaminais hematopoiéticas, para células F4/80macrófagos e eritrócitos para Ter119 11), e, em seguida, os neutrófilos são enriquecidas por eluição como a fracção de anticorpo-negativa de células que não se ligam à coluna magnética, e (d) separação de células activada de fluorescência, durante o qual as células de medula óssea são marcadas com anticorpos que se ligam sobre os neutrófilos e de outras células, e os neutrófilos são então separadas usando um classificador de células activadas por fluorescência que as células que são positivas para os marcadores de neutrófilos, tais como a combinação de Ly6G e CD11b.
Embora ambas as abordagens de selecção positivas e imuno fluorescência selecção de células activadas proporcionam elevados rendimentos e purezas dos neutrófilos de rato, estes métodos têm a desvantagem em relação ao nosso protocolo que se ligam agentes de marcação sobre a superfície dos neutrófilos, o que poderia potencialmente alterar a sua função. Positivo abordagens de selecção imunomagnéticas têm a limitação adicional de que o anticorpo marcado com neutrófilos ligam numa coluna magnética para separation, o que também pode afetar a função celular. Selecção de células activadas de fluorescência tem a desvantagem adicional de que é necessário significativamente mais tempo para recolha das células utilizando um classificador de células activadas por fluorescência numa instalação central de laboratório, o que pode afectar adversamente a sobrevivência de neutrófilos devido à sua curta semi-vida. O método é semelhante ao método de centrifugação em gradiente de densidade que utiliza gradientes descontínuos de Percoll, mas as camadas de separação de dois meios de densidade Histopaque é tecnicamente muito menos difícil em comparação com as camadas constituídas por gradientes de Percoll 55%, 65% e 75% v / v em PBS , que muitas vezes resulta em mistura entre as interfaces de Percoll, devido às pequenas diferenças de densidade entre as três camadas. Com relação aos métodos de selecção imunomagnéticas negativas, elas também tem sido relatado para ser fiável para o isolamento de grandes números de neutrófilos funcionalmente competentes, com elevado grau de pureza e viabilidade da medula óssea de ratinhos 11
Neutrófilos isolado utilizando o método de centrifugação em gradiente de densidade descrito pode ser usado para uma variedade de jusante funcional estudos ex vivo, tais como fagocitose, o abate, a quimiotaxia, a produção de citocinas, o burst oxidativo e ensaios de degranulação, utilizando protocolos publicados 6. Além disso, os neutrófilos podem ser isoladosadoptivamente transferidos para ratinhos infectados por receptores a avaliar o papel de transferência de neutrófilos na sobrevivência do rato e os efeitos de neutrófilos transferidas para correlaciona imunológicas, tais como a produção de citoquinas em locais de infecção em ratinhos receptores. Para esse fim, Tosello Boari e colegas adoptivamente transferidos neutrófilos osso derivadas de medula em ratos receptores Trypasonoma-infectadas, que regulada para baixo IFN-γ produção no baço e no fígado infectado e resultou na melhoria da sobrevivência de uma forma dependente da IL-10 19.
Além disso, a capacidade de rotular neutrófilos com o CellTracker corantes CMFDA e CMTMR sem aparente diminuição corante induzida da viabilidade celular oferece a oportunidade de rotular diferencialmente neutrófilos de ratos de diferentes origens genéticas e acompanhar as células marcadas adotivamente transferidos em diferentes órgãos-alvo mouse usando fluxo citometria ou microscopia intravital. Os corantes são retidos na CellTracker viablde e neutrófilos e não difundir para as células adjacentes. Em nossos estudos, utilizamos uma concentração de 5 mM para marcação celular e que são capazes de controlar com sucesso neutrófilos marcados em sangue, medula óssea e rins de ratos destinatário Candida infectados por pelo menos 4 horas após a transferência de neutrófilos 6. Além Verde CellTracker e CellTracker Laranja, outros corantes, incluindo Violet CellTracker, CFSE e SNARF-1 também têm sido usados com sucesso para rótulo rato osso neutrófilos derivadas da medula para experimentos de transferência adotiva 11,19,20. Além disso, o verde e CellTracker CellTracker corantes alaranjados têm sido eficazmente utilizado numa concentração semelhante de 5 uM para a marcação das células T do baço do rato para a transferência adoptiva e rastreamento experiências 21. A capacidade para marcar diferencialmente neutrófilos com vários corantes CellTracker permite a concepção de experiências de repovoamento competitivos, nos quais uma proporção de neutrófilos marcados diferencialmente a partir de ratinhos de 1:1 com diferentesfundos genéticos podem ser adoptivamente transferidos para ratinhos receptores com o objectivo de determinar o papel directo de genes específicos no tráfico de neutrófilos do sangue para os tecidos inflamados. Recentemente, relatou que o receptor de quimiocina CCR1 medeia o tráfico de neutrófilos do sangue para os rins infectados com Cândida tarde no decurso da infecção, o que resulta na acumulação excessiva de neutrófilos no rim, lesões teciduais e diminuiu a sobrevivência 6.
Tal como acontece com qualquer protocolo, o nosso método também tem limitações. Por exemplo, apesar das vantagens da colheita de neutrófilos de sangue de medula óssea sobre citados, existem diferenças notáveis entre os neutrófilos obtidos a partir destes dois compartimentos, que, dependendo da aplicação de pesquisa jusante das células colhidas pode ter um impacto sobre os resultados experimentais. Especificamente, os neutrófilos do sangue são as células maduras, enquanto que os neutrófilos a partir de medula óssea, as desvantagensist de três diferentes subpopulações, que vão desde promielócitos / mielócitos imaturos para metamielócitos menos imaturos / formulários banda para neutrófilos maduros, como descrito anteriormente 22. Assim, a diferença na maturação celular entre medula óssea e neutrófilos no sangue pode resultar numa alteração de certas características funcionais de células, uma vez que foi anteriormente relatado para as respostas dos neutrófilos para fMLF (N-formylmethionyl-leucil-fenilalanina) e ingestão de partículas 23. Além disso, porque qualquer neutrófilos manipulação ex vivo pode resultar na activação celular e apoptose, precaução é indispensável ao manipular as células durante a centrifugação de gradiente. Além disso, porque os corantes CellTracker em concentrações superiores a 5 uM poderia afectar adversamente a sobrevivência de neutrófilos, esta possibilidade deve ser testado em experiências piloto por investigadores individuais, dependendo do ensaio funcional, a jusante que vai ser testada.
Em resumo, nós préenviado um método fiável e reprodutível, que pode ser empregue em qualquer laboratório para recolher e rotular um grande número de neutrófilos de rato a partir da medula óssea. Esta abordagem pode ser usada para uma variedade de estudos funcionais dos neutrófilos, incluindo na transferência adoptiva in vivo e as experiências de controle por citometria de fluxo e microscopia intravital. O uso deste e de outros protocolos confiáveis para rato neutrófilos purificação, isolamento, marcação e transferência adotiva downstream e estudos de rastreamento deve aprofundar nossa compreensão da fisiologia dos neutrófilos no nível molecular.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Divisão de Investigação intramuros do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID), Instituto Nacional de Saúde (NIH), EUA.
Todos os animais foram mantidos em uma associação americana para a Acreditação de Laboratório Animal Care credenciados biotério do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID) e alojados em conformidade com os procedimentos descritos no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório sob os auspícios de um protocolo aprovado pelo Animal Care e do Comitê de Uso do NIAID.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | GemCell | 100500 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Quality Biological Inc | 351-027-101 | |
| 0.2% and 1.6% sodium chloride | JT Baker | 3624 | Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C-7025 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) | Invitrogen | C-2927 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
| Anti-mouse CD11b (Clone M1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | Use at 1:100 dilution |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Molecular Probes | L-23105 | Use at 1:1000 dilution |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils. | |||
| Materials | |||
| C57BL/6 mice | Taconic | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes (3 ml) | BD Falcon | 357575 | |
| 12 ml syringes | Kendall monoject | 512878 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 mm cell strainers | BD Falcon | 352360 | |
| Bactericidal Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
| Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
| Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel) | Biomedical Research Instruments | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | Instruments sterilized prior to use |
| Equipment | |||
| Tissue culture hood | The Baker Company | SG403 | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37 °C shaking water bath | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol. |
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