Robuuste 3D DNA FISH behulp direct gemerkt Probes

Summary

We beschrijven een robuuste en veelzijdige protocol voor de analyse nucleaire architectuur door 3D DNA FISH met direct gelabelde fluorescerende probes.

Abstract

3D DNA FISH is uitgegroeid tot een belangrijk instrument voor het analyseren van de driedimensionale organisatie van de kern, en de verschillende varianten van de techniek zijn gepubliceerd. In dit artikel wordt een protocol dat is geoptimaliseerd voor robuustheid, reproduceerbaarheid, en gebruiksgemak beschrijven we. Fel fluorescerend direct gelabelde probes worden gegenereerd door nick-translatie met amino-allyldUTP gevolgd door chemische koppeling van de kleurstof. 3D DNA FISH wordt uitgevoerd met een vries-dooi stap cel permeabilisatie en een verwarmingsstap voor gelijktijdige denaturatie van probe en nucleair DNA. Het protocol is voor diverse celtypes en verschillende probes (BACs, plasmiden, fosmids of Whole chromosoom Paints) en maakt hoge-doorvoer geautomatiseerde beeldvorming. Met deze methode hebben we routinematig nucleaire lokalisatie van maximaal onderzoeken tot drie chromosomale gebieden.

Introduction

DNA fluorescentie in situ hybridisatie (FISH DNA) kan de driedimensionale visualisatie van afzonderlijke loci, subchromosomale gebieden en zelfs hele chromosomen gedurende alle fasen van de celcyclus. 2D FISH wordt gebruikt metafase studies terwijl 3D FISH is uitgebreid gebruikt om de relatie tussen de ruimtelijke organisatie van het genoom en functionaliteit tijdens interfase ^(1,2 en referenties daarin) probe. Historisch gezien werden co-associatie studies door onderzoek tientallen tot honderden afzonderlijke loci door FISH. Recenter krachtige high throughput 3C-gebaseerde technieken zoals 4C en Hi-C ontwikkeld ^3, waarbij het ​​onderzoek van de moleculaire interactie tussen vele duizenden verschillende loci. Terwijl 3C-gebaseerde technieken en DNA FISH kan complementair zijn methoden, doen ze niet per se dezelfde vragen te beantwoorden. 3C gebaseerde methoden een ensemble uitlezen van gemengde celpopulaties, resulterend in een probabilheid voor co-verenigingen. Daarentegen, terwijl weinig doorvoer FISH gebaseerde technieken bieden de mogelijkheid om ruimtelijke schikking van loci of chromosomen in individuele cellen te analyseren op basis van hun ontwikkeling of mobiele fasen. Daarom zal FISH blijven een belangrijk instrument voor het sonderen van de nucleaire structuur-functie relaties zijn.

Er zijn twee belangrijke overwegingen bij het succesvolle 3D-FISH experimenten uitvoeren. Deze zijn: 1. verkrijgen van optimaal gemerkte probes en 2. keuze van cellulaire behandelingen, zoals fixatie, pre-en post-hybridisatie stappen nucleaire morfologie zoveel mogelijk te behouden terwijl het DNA voldoende toegankelijk voor probe hybridisatie. Efficiënte sonde etikettering is van cruciaal belang voor FISH. Traditioneel is nick-translatie is gebruikt in te voeren ofwel hapten of fluorofoor-geconjugeerde nucleotiden ^4. Ook commerciële nick-translatie kits zijn beschikbaar voor directe hapten of fluorofoor incorporatie, BUt ook voor tweefasige labeling met aminoallyl nucleotiden en amine-reactieve kleurstoffen. Levert deze laatste kleurstof incorporatie efficiënter door het geven van DNA-polymerase een minder omvangrijk molecuul om mee te werken. Meer recent zijn kits voor de niet-enzymatische labeling van DNA ontwikkeld die coördinatieve binding van platina nucleïnezuren benutten. FISH probes kunnen ook gekocht worden al bestempeld ^5. Terwijl kits en commercieel vervaardigd sondes geen twijfel geven gebruiksgemak, ze zijn aanzienlijk duurder dan het kopen van de afzonderlijke componenten en het produceren van sondes in-house. We geoptimaliseerd een low cost nicktranslatie protocol om direct labelen veel verschillende BAC probes in meerdere kleuren. We ontdekten dat het verkrijgen van zeer zuivere BAC DNA is kritisch en leidt dat slechts 10-20 ng probe per FISH slide, vergeleken met 10 - 20-maal als onzuiver DNA template wordt gebruikt, die weer belangrijke kosten-en tijd- besparingen. Het gebruik van amino-allyldUTP een flexibele etiketteringsondes met beschikbare amine-reactieve kleurstoffen (bv. Alexa Fluor of Cy-kleurstoffen) of haptenen (bv biotine, digoxigenine). Hapteen-gelabelde probes worden gedetecteerd door fluorofoor-geconjugeerde antilichamen of streptavidine aan te vullen en visualiseren signaal. Bright direct gelabelde probes vertonen doorgaans minder achtergrondkleuring en voorkomen dat over-amplificatie van signalen, dus resulterend in een nauwkeurigere representatie van nucleaire lokalisatie en morfologie locus.

Er zijn verschillende FISH technieken die gebruik maken van verschillende fixatieven, pre-behandelingen, en post-hybridisatiewassingen maar deze algemeen vallen in de volgende categorieën: glutaaraldehyde fixatie met NaOH denaturatie, formaldehyde fixatie met HCl denaturatie, en formaldehyde fixatie met warmte denaturatie ^6-9 . Elk van deze heeft voordelen en nadelen. Glutaaraldehyde fixatie resulteert in goede nucleaire structurele conservering, maar vereist een behandeling met reducerende middelen tot een minimum te beperkende resulterende autofluorescentie en NaOH behandeling moet zorgvuldig worden gecontroleerd om voldoende DNA denaturatie en mogelijke schade aan de kernstructuur ⁶ evenwicht. Formaldehyde fixatie minder sterk, hetgeen een verhoogde kans op storingen van nucleaire architectuur, maar ook typisch geven sterker en betrouwbaarder signalen en lage autofluorescentie ^9. HCl behandeling depurinates DNA en strips uit eiwitten, biedt goede toegang tot het DNA van de sondes, maar kunnen ook tot DNA-breuken. Verwarming fysiek scheidt de twee DNA-strengen resulteert in goed doelwit hybridisatie en sterke signalen, maar kan enige verstoring van de nucleaire structuur ⁸ veroorzaken. De mate waarin elk van deze technieken beïnvloedt eiwitepitopen ^6,9 varieert sterk, waardoor het vereiste om experimenteel te bepalen voor elk eiwit de optimale protocol te gebruiken in immuno-FISH experimenten.

Hoewel er geen 'perfecte' DNA FISH technique, ze kunnen allemaal nuttig zijn als goed gecontroleerd. Ons doel was om een protocol voor robuuste en reproduceerbare DNA FISH optimaliseren ruimtelijke positie van meerdere loci onderzocht in verschillende celtypes ^10, gericht op de verwarmingsmethode voor de meest betrouwbare signalen. Met deze en het gebruik van een geautomatiseerd imaging systeem dat we het verhogen van de doorvoer voor single cell analyse van nucleaire regelingen.

Protocol

1. Het genereren van direct gemerkt DNA Probes door Nick Translation

Opmerking: Direct gelabelde probes gemaakt van BAC's (100-250 kb) consequent te produceren heldere signalen. Als kleinere probes nodig zijn, gebruik maken fosmids (40-50 kb) of zelfs plasmiden die 5-10 kb inserts. Identificeer BAC of fosmid klonen die overeenkomen met specifieke genen met behulp van Ensemble of UCSC genoom browsers. Bereid hoge kwaliteit BAC DNA door herhaalde neerslag of in de handel verkrijgbare kits. Hoe minder het preparaat vervuild met bacteriële genomische DNA, wordt de probe minder nodig per slide. Voer etikettering in twee stappen: nicktranslatie invoering aminoallyl-dUTP en chemische koppeling van een amine-reactieve kleurstof.

1.1. Nick Vertaling

Tijdens nicktranslatie, wordt DNase I gebruikt om single-strand breaks te creëren. DNA Polymerase I verlengt de 3 'einden van deze "nicks", vervanging van bestaande nucleotiden door nieuwe, t hierbij 'vertalen' de nick en aldus de mogelijkheid om gelabelde nucleotiden nemen. Aminoallyl-dUTP is gekozen vanwege efficiënte inbouw van DNA polymerase I en bij het latere chemische koppeling aan amine-reactieve kleurstoffen of haptenen. Het is cruciaal om de juiste balans tussen DNase I knikken en DNA-polymerase I vertaling bereiken; teveel DNase I zal resulteren in een overmatige DNA spijsvertering geven lage opbrengst en korte fragment maten, te weinig zal niet genoeg nicks voor het polymerase om vertaling te starten produceren, het geven van groot fragment grootte en slechte opname van aminoallyl-dUTP. Het volgende protocol werkt goed maar moet de DNAse I titreren van verschillende batches of verschillende fabrikanten zijn.

1. Stel labeling reactiemengsel op ijs en incubeer gedurende 2 uur bij 16 ° C. Dit moet produceren 0,5-1 ug nick-vertaalde DNA en kan worden opgeschaald. Verdun 1:30 DNase I in DNase I buffer (bijvoorbeeld 0,3 U / pl).

1 "> Bestanddeel Concentratie van voorraad Volume of de hoeveelheid BAC DNA 5-10 ug NTB buffer 10x 5 pi DTT 0.1 M 5 pi dNTP mix 10x 5 pi Aminoallyl-dUTP 0,5 mM 6 pl DNA Polymerase I 10 U / gl 1 ui DNase I 10 U / gl 1 pl (van 1:30 verdunning) _H2O 50 gl

2. Run 1 ul op een 2% agarose gel om de grootte van de gelabelde fragmenten controleren. Terwijl je de gel loopt, houdt de reactie op het ijs. Succesvolle nick translatiop resulteert in een uitstrijk met de massa van de fragmenten die tussen 150 bp en 700 bp met wat grotere fragmenten op ~ 1 kb (Kritische stap: zie Representatieve resultaten). Indien nodig, voeg nog 1 ul van een verse verdunning 1:30 DNase I en incubeer bij 16 ° C gedurende 15-30 minuten. Incubatietijd afhankelijk van de hoeveelheid en kwaliteit van BAC DNA.
3. Inactiveren DNase I door verhitting tot 75 ° C gedurende 10 minuten.
4. Clean-up amine-gemodificeerd DNA met behulp van een PCR zuivering kit. Elueer in 100 ui _H2O
5. Ethanol DNA precipitaat door toevoeging van 10 pl 3 M NaOAc (pH 5,2) en 275 ui ethanol. Voeg bij -20 ° C gedurende ten minste 1 uur of overnacht. Spin bij maximale snelheid gedurende 30 min bij 4 ° C. Was de pellet met 500 ul 70% ethanol en laat aan de lucht drogen. Deze stap verwijdert trace amines die interfereren met de labelingsreactie. Resuspendeer pellet in 6 pi H ₂ O per 1x eerste reactie.
6. Met 1 pl tot de concentratie van de amine-gemodificeerde DNA bepalenmicrovolume door UV-spectroscopie.

1.2. Koppeling van de fluorescerende kleurstof

Fluorescentielabelling van de probe wordt bereikt door chemische koppeling van de kleurstof. Alexa Fluor succinimidyl ester kleurstoffen reageren met de amines van de amino-gemodificeerde DNA allyldUTP een covalente binding te vormen, waardoor direct gemerkte probes produceren. Alexa Fluor 488, 555 en 647 kleurstoffen succesvol voor dit proces.

1. Regel 4 ug amino-allyl gemodificeerd DNA tot een volume van 5 pl, warmte tot 95 ° C gedurende 5 min, snap koel op ijs en voeg 3 pl 0,2 M _NaHCO3.
2. Los een aliquot van amine reactieve kleurstof in 2 pl watervrije DMSO bij kamertemperatuur. Voeg 8 pi gemodificeerd DNA met _NaHCO3, vortex, pulse spin en incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 1 uur.

Opmerking: Het amine reactieve kleurstoffen kunnen worden gebruikt voor het merken meer dan een probe op basis van het volgende schema. Sinds olleen 10-20 ng sonde wordt gebruikt per slide etikettering, 1 ug geeft genoeg probe voor 50-100 glijbanen. Het is ook mogelijk om amine-gemodificeerde DNA slaan voor toekomstig labelingsreacties bij -20 ° C.

DNA bedrag	Volume DNA	0,2 M NaHCO3	Volume van de kleurstof	Totaal	Genoeg voor
4 x 1 ug	1.25 pi elk	0.75 pi elk	0.5 pi elk	2,5 pl (1/4)	50-100 dia elke
3 x 1.35 pg	1.67 pi elk	1 pi elk	0,67 pi elk	3.34 pl (1/3)	65-130 slide elke
2 x 2 ug	2.5 ul elke	1.5 ul elke	1 pi elk	5 pl (1/2)	100-200schuift elke
1 x 4 ug	5 pi	3 ui	2 pi	10 pl (full)	200-400 dia's

3. Voeg 90 ul _H2O en zuiveren gemerkte probe met een PCR zuivering kit. Elueer in 100 pi 10 mMTris-Cl (pH 8,5).
4. Bepaal probeconcentratie en etikettering efficiëntie door microvolume volledige spectrum spectroscopie (zie figuur 2) met behulp van Beer-Lambert vergelijkingen (Instructies worden gegeven in de datasheet bij de Alexa Fluor reactieve kleurstoffen of kan online worden gevonden). Sondes met 3-6 kleurstoffen per 100 bp werken goed. Sondes met lagere graden van oprichting kan zwakke FISH signalen geven. Als alternatief, lopen 5 pi op een 2% agarosegel zonder DNA vlekken en controleer de opname van de fluorescente kleurstof met behulp van een fosfoimager. Post-vlekken op de gel met ethidiumbromide of DNA kleuring alternatieven en vergelijken gelabelde DNA aan totale DNA.

Via de volgende stappen worden de cellen van belang zijn bevestigd aan dia's en gepermeabiliseerd. Cellulaire DNA en direct gelabelde probes worden vervolgens samen gedenatureerd op een hete plaat en overnacht gehybridiseerd in een lichtdichte vochtige kamer.

2.1. Dag 1

1. Probe Neerslag
   Opmerking: Precipitate sondes op een bepaald punt tijdens de dag 1. Dit kan gemakkelijk worden uitgevoerd parallel aan de behandeling van de cellen en niet hoeft te worden gedaan aan het begin van de dag.
   1. Meng 10-20 ng direct gelabelde probe, 6 pi C ₀ t-1 DNA (6 pg), 1 ui enkelstrengs DNA uit zalmtestes (9,7 pg) en het volume aan te passen aan 100 pl met water.
   2. Voeg 10 ul 3 M NaOAc en 275 ul EtOH, en door vortexen gemengd. Precipiteren ten minste 1 uur bij -20 ° C.
   3. Draai in microfuge bij maximale snelheid gedurende 30 min bij 4 ° C. Was de pellet met 70% EtOH en draaien weer. Droge pelleten resuspendeer in 5 pl gedeioniseerd formamide. Opnieuw in suspensie gedurende 30 minuten bij 37 ° C onder schudden bij 1000 rpm beschermd tegen licht (plaats folie over de thermomixer).
   4. Voeg 5 ul van dextransulfaat mix en schud nog eens 10 min bij 37 ° C weer beschermd tegen licht. Pipet op en neer net voor pipetteren op dekglaasje.
      Opmerking: Voor chromosoom schilderen gecombineerd met BAC probes, heel chromosoom kleurende probes die worden geleverd in kant-en-klare hybridisatie mix is een handige optie. Resuspendeer geprecipiteerd BAC probe (met C ₀ t1 DNA en enkelstrengs DNA van zalmtestes) in 10 pl chromosoom verfmengeling op en neer te pipetteren. Incubeer bij 37 ° C onder schudden bij 300-500 rpm gedurende 10 minuten. Gebruik 10 ul van chromosoom verf / BAC probe mix per spot.
2. Bevestigen Cellen aan dia
   Opmerking: De cellen neiging zich te houden aan dia's varieert met het type cel. Voor elk celtype, bepalen deoptimale afwikkeling van de tijd en de celdichtheid empirisch. Om consistente resultaten moeten de cellen in een enkele celsuspensie.
   Voor gebruiksgemak cirkel de stippellijn de cellen worden gespot op een hydrofobe pen, hoewel voor de cellen opnieuw gesuspendeerd in PBS dit is niet strikt noodzakelijk. Een hydrofobe barrière voorkomt de suspensie zich verspreidt op de dia, houdt drie monsters per slide goed gescheiden en maakt het gebruik van zeer kleine hoeveelheden antilichaam oplossing in immuno-FISH. Ook kan het spotten gebied worden geminimaliseerd als cel aantallen laag.
3. Muis foetale levercellen
   1. Verzamel elk E13.5 foetale lever muis in ongeveer 1,5 ml PBS en resuspendeer door en neer te pipetteren. Draai in microfuge bij 3000 rpm gedurende 2 minuten. Herhaal wast driemaal. Bij de laatste wasbeurt, stam cellen door een 70 um zeef. Resuspendeer cellen van de ene lever in 160 pi PBS en gebruik 50 μ per spot. Leave cellen te regelen voor 2 minuten bij kamertemperatuur.
4. Mouse ES cellen
   1. Muis ES-cellen zal niet gemakkelijk vasthouden aan de dia. Op een dia, cirkel het gebied van de cellen zullen worden gespot op met een hydrofobe pen. Maak een suspensie van 20,000-50,000 cellen per 80-100 pi in normale kweekmedium, pipet in cirkel en laat te hechten gedurende ongeveer 3 uur in een bevochtigde incubator. Opmerking: Als alternatief kunnen ES-cellen worden gekweekt op dia's, maar maken dan kolonies die geautomatiseerde beeldvorming zou kunnen belemmeren.
5. Vaste Cellen
   1. Sommige experimenten vereisen het gebruik van vaste cellen die hechten aan dia zelf. Gentle spinnen bij 300 rpm gedurende 3 minuten met een cytocentrifuge behoudt de driedimensionale structuur van de cellen en zorgt ervoor dat cellen niet vallen.

Celtype	Suspensie in	Insteltijd	Commentaar
Muisfoetale lever	PBS	2 min	Op de bank
MuisS	DMEM met supplementen	4 hr	37 ° C in bevochtigde incubator
Muis lymfocyten	PBS	2 min	Op de bank
Muis P20 kiemcellen	Fix in oplossing	Cytospin	Op de bank

3. Om cellen, zachtjes onderdompelen dia in 4% PFA (LET OP: presteren in zuurkast) vast te stellen voor 10 minuten. Bevestig cellen met de schuif in een platte bak voor de beste retentie van cellen (bijv. 50 ml 4% PFA in het deksel van een doos tip). Opmerking: Deze stap is niet voor voorafgaand bevestigd aan bevestiging aan dia cellen.

Voor alle volgende stappen, gebruik dan 50 ml of 100 ml Coplin potten. Take care cellen niet af te schrapen bij het verplaatsen dia tussen potten.

4. Quench in 0,1 M Tris-Cl, pH 7,4 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
5. Permeabilize cellen in 0,1% saponin/0.1% Triton X-100 in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
6. Was tweemaal in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
7. Incubeer gedurende ten minste 20 min in 20% glycerol / PBS bij kamertemperatuur. Opmerking: Op dit punt kan slides worden opgeslagen in 50% glycerol / PBS bij -20 ° C gedurende ten minste enkele weken. Er is waargenomen dat de opslag ten minste een dag tot een toename in signaalsterkte ^9. Herijken op kamertemperatuur 20% glycerol / PBS alvorens Opmerking:. Dit is een ideale plaats om te beginnen neerslaan van de sondes (zie 2.1.1).
8. 3x bevriezen / ontdooien in vloeibare stikstof. Dompel een dia tegelijk in vloeibare stikstof met behulp van een kleine dewarvat. Terugtrekken na een paar seconden en een karakteristiek knallend geluid, en leg ze op keukenpapier om te ontdooien. Wacht tot ondoorzichtige bevroren glycerol te verdwijnen dan weer bevriezen. Maximaal 15 dia's kan gemakkelijk worden gedaan bij toerbeurt gedurende drie vries / dooi cycli.
9. Wash tweemaal in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
10. Incubeer in 0,1 M HCl gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
11. Wassen in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
12. Permeabilize in 0,5% saponin/0.5% Triton X-100/PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
13. Was tweemaal in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
14. Equilibreren 50% formamide/2x SSC gedurende ten minste 10 minuten bij kamertemperatuur.
15. Pipet probe op een dekglaasje. Verwijder dia uit de pot en drogen overtollige vloeistof rond de cel spot (s) met een papieren handdoek. Zoals de formamide droogt snel, let er dan op uitdrogen cellen. Bij dia's met twee of drie mobiele spots, breng 10 pl van probe per spot op een 22 mm x 50 mm dekglaasje overeenkomen met op de dia plek. Dekglaasje omkeren op schuif dan spot (s). Verzegelen met rubber cement en laat dit goed drogen. Bescherming tegen licht in alle volgende fasen.
16. Warmte dia's tot 78 ° C gedurende precies 2 minuten op een hete plaat (bijv. een omgekeerde verwarming blok, Kritische stap: zie Discussie). Plaats een deksel (kartonnen doos of sim ilar) over de hete plaat ter bescherming tegen licht tijdens denaturatie.
17. Incubeer overnacht bij 37 ° C in een lichtdichte vochtige kamer. Te bevochtigen, plaatst papieren handdoeken in een lichtdichte doos en bevochtigen met water.

2.2 Dag 2

1. Bereid Coplin potten met oplossingen op de juiste temperatuur voor de volgende wasbeurt stappen. Bescherm tegen licht slides zoveel mogelijk in alle daaropvolgende stappen. Een koffie kan maakt een goede lichtdichte dekking voor Coplin potten.
2. Schil van rubber cement en plaats glijbaan in 2x SSC tot coverslips los en glijden.
3. Wassen in 50% formamide/2x SSC gedurende 15 min bij 45 ° C. Plaats het deksel op waterbad ter bescherming tegen licht.
4. Wassen in 0,2 x SSC gedurende 15 minuten bij 63 ° C.
5. Wassen in 2x SSC gedurende 5 minuten bij 45 ° C.
6. Wassen in 2x SSC gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
7. Wassen in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
8. Vlek met DAPI (5 ug / ml in 2x SSC) gedurende 2 min in een Coplin jar bij kamertemperatuur.

gehalte "> NB: DAPI oplossing kan worden bewaard bij 4 ° C in het donker gedurende 2 maanden.

9. Destain in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
10. Om het dekglaasje monteren, pipet montage medium op een dekglaasje. Gebruik 10 pi per cel vlek, met 22 mm x 22 mm dekglaasjes gedurende een spot en 22 mm x 50 mm dekglaasjes 2-3 plaatsen. Droog PBS rond de cel ter plaatse zo veel mogelijk, maar zorg niet om uitdrogen van de cellen. Dekglaasje op glijbaan, en afdichting met nagellak omkeren.

Representative Results

De hier beschreven protocol (Figuur 1 voor overzicht) is gebruikt om groot effect op DNA FISH gecombineerd met high-throughput beeldopname voor analyse van genomische organisatie. Het genereren van goede kwaliteit sondes is cruciaal voor het succes (zie Discussie). Figuur 2 toont twee belangrijke kwaliteitscontroles voor FISH probes. Na nick-translatie, moeten een uitstrijkje van DNA zichtbaar met de massa van de fragmenten die tussen 150 en 700 bp (Figuur 2A) zijn. Na chemische koppeling kan opname van de fluorescente kleurstof worden gemeten door spectroscopische analyse van de probe (Figuur 2B).

Bij het gebruik van goede sondes, naar aanleiding van de DNA FISH protocol resulteert meestal in felle DNA FISH signalen op lage achtergrond. We hebben met succes gebruik gemaakt van deze protocol op een verscheidenheid van verschillende celtypes, en met ofwel epi-fluorescentie of confocale microscopen. Geautomatiseerde beeldvorming met behulp van een epi-fluorescence microscoop vereist scherpe, gemakkelijk herkenbaar FISH signalen met weinig achtergrond (figuur 3), terwijl de confocale microscopie vereist intenser signalen. Figuur 4A toont representatieve bewerkte beelden. Nucleaire coördinaten van FISH signalen worden verkregen en ruimtelijke relaties van genomische gebieden worden berekend (zie voorbeeld in Figuur 4B). We hebben ook gebruik afbeeldingsstapels verkregen door confocale microscopie voor 3D-modellering van FISH-signalen in hun chromosoom gebieden (Film 1).

Figuur 1. Workflow voor probe etikettering en DNA FISH. Probe voorbereiding wordt in blauw weergegeven. FISH procedure DNA wordt in zwart met gegevens in groen.

Figuur 2. Labelen sondes door nick-translatie en kwaliteitscontrole van gelabelde probes. A) Gel toont ideale uitstrijkje voordat verhitting tot inactiveren DNase I (laan 1: DNA-ladder, baan 2 en 3: BAC na nick-translatie). Fragmenten moeten worden in de 150-700 bp bereik. Een extra uitstrijkje bij ~ 1 kb wordt vaak waargenomen met succesvolle nick-translatie reacties. B) Microvolume volledige spectrum analyse van gemerkte probes. Een DNA piek bij 260 nm wordt waargenomen met een tweede piek van de absorptie golflengte van het fluorofoor de probe is gelabeld met: Alexa Fluor 488: 495 nm, Alexa Fluor 555: 555 nm, Alexa Fluor 647: 650 nm. Getoond zijn drie probes met goede incorporatie: fluorofoor absorptie pieken eenzelfde hoogte of hoger dan het DNA pieken. Alexa Fluor 647 heeft meestal een hogere absorptiedan Alexa Fluor 555, die op zijn beurt een hogere absorptie dan Alexa Fluor 488. Alexa Fluor 488 absorbeert enig licht bij 260 nm, waardoor de eerste piek van deze probe hoger is dan de anderen. Sondes met een slechte opname tonen fluorofor absorptie 2-3-voudig lager dan de DNA-absorptie. Probes met een meer dan 2-voudig hoger dan DNA fluorofoor piek piek bevatten kenmerkend geconjugeerde kleurstof die in de achtergrond FISH kunnen veroorzaken.

Figuur 3. Screenshot van de MetaCyte 3D FISH imaging software toont een typische drie-kleuren FISH experiment. Het scherm is verdeeld in verschillende delen. A) beeld Ruwe field-of-view (FOV) gevangen genomen door de Metafer / MetaCyte slide scanning systeem. B) Galerij van beelden van geïdentificeerde kernen die un hebbendergone beeldverwerking en segmentatie voor FISH-signalen. Verschillende soorten gegevens kunnen worden weergegeven elke afbeeldingengalerij op. In dit voorbeeld celaantal wordt linksboven met verschillende interallelic en interlocus afstanden rechtsboven en weerszijden onder elke afbeelding. C) Slide naam met het aantal kernen die in de analyse. D) afbeelding van de slede met het gebied afgetast door de systeem. E) Uitbreiding van het gescande gebied. Witte vlekken vertegenwoordigen geïdentificeerd kernen per FOV. F) Verwerkte gegevens. In dit voorbeeld interallelic maximale afstanden tussen groene signalen (boven) en rode signalen (onder) weergegeven. De getoonde gegevens is uit muizen P20 kiemcellen. Probes zijn gelegen op verschillende chromosomen, die HBB en Hba genen en een histon cluster. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 4. Voorbeelden van verwerkte beelden en afgeleide positiegegevens. A) Verwerkte beelden voor E13.5 muis foetale levercellen gekleurd met BAC probes zich op verschillende chromosomen die Myc en KCNQ1 genen (zogenaamde myc en KvDMR, gekleurde groen en rood, respectievelijk). B) Tukey doos-whiskerdiagrammen vertegenwoordigt de interallelic afstand distributie voor dezelfde loci in 600 kernen. Interallelic afstand wordt uitgezet als een fractie van de kern 'radius (afstand / radius) om rekening te houden met variaties in kerngrootte. ES-cel kernen hebben een straal van ongeveer 5 micrometer. Rode probes aanzienlijk dichter bij elkaar dan groen probes (***: p <0,01, ongepaarde t-test). Gegevens van ^10.

Film 1. 3D modellering van twee loci binnen hun chromosoom territory. Twee BAC sondes dicht bij een van de uiteinden van de muis chromosoom 7 werden bestempeld (rood en verrood, (pseudo-wit gekleurd)) en tezamen gehybridiseerd met een heel chromosoom verf (groen) om de muis ES-cellen. Klik hier om film te bekijken .

Discussion

3D DNA FISH is uitgegroeid tot een algemeen erkend instrument om ruimtelijke regelingen te analyseren in de kern. Terwijl FISH biedt visuele en directe resultaten, zoals met elke techniek, moet men zich bewust zijn van de beperkingen ervan. DNA FISH wordt geconfronteerd met de inherente probleem dat relatief agressieve behandelingen zijn nodig om chromatine toegankelijk voor FISH probes die uiteindelijk verstoort nucleaire structuur-de zeer ding dat moet worden geanalyseerd maken. Verschillende strategieën werden gevolgd om de toegankelijkheid en de structuur behoud jongleren. In het hier beschreven protocol, wordt chromosomaal DNA bereikbaar met vries-dooi permeabilisatie van cellen en warmte denaturatie voorafgaand aan probe hybridisatie gemaakt. Solovei, et al.. (2002) analyseerden structurele veranderingen na vergelijkbare behandeling en vond dat de gemiddelde verplaatsing van chromatinedomeinen was 300 nm waarbij de oplossing van structurele analyse beperkt tot ongeveer 1 Mb gebieden in het genoom ^8. Hoewel dit niet een hoge resolutie, hetis een redelijke schaal voor het analyseren van de nucleaire positie.

Een praktische overweging voor FISH analyse is dat beeldacquisitie en metingen van nucleaire afstanden tijdrovende processen die het aantal kernen die kunnen worden geanalyseerd beperken. Om te studeren zelden voorkomende gebeurtenissen willen wij aan high throughput geautomatiseerde beeldvorming doen. Dan, met geschikte controles plaats, voldoende kunnen worden vergeleken om voor robuuste statistische analyse van ruimtelijke relaties. We routinematig analyseren 600 kernen per datapunt waarvoor wij bepalen de 3D-coördinaten van alle FISH signalen binnen de nucleaire volume. Deze gegevens vereisen zeer weinig opslagruimte en zorgen voor de analyse van de inter-en intra-allelische afstanden, of radiale posities op een later moment. Bovendien kunnen automatische verwerking worden gedaan in een onderzoeker blinde manier die sterk vermindert de kans op onbewuste vooroordelen.

Om dit soort high throughput analys stellenis, ons doel was om een ​​snelle en efficiënte manier van het uitvoeren van DNA-FISH vestigen. We vonden het hier beschreven protocol te zijn uiterst robuust, consistent produceren van heldere signalen met een lage achtergrond. Het werkte voor alle celtypes we probeerden op voorwaarde dat we aangepast de stap van het bevestigen van de cellen aan de dia. Bovendien, met een uitzondering, alle BAC's gebruikten we konden worden omgezet in heldere sondes. We hebben ook met succes een aantal nucleaire proteïnen gedetecteerd door antilichaamkleuring na DNA FISH. Terwijl voor sommige eiwitten dit goed werkt, raden we vergelijking met traditionele immunofluorescentie (IF) om de consistentie van het antilichaam kleuringspatroon tussen IF en DNA immuno FISH (vergelijk ¹¹⁾ te garanderen.

Algemeen vonden we dat probes kleur gemarkeerd geproduceerd dezelfde resultaten. Echter, de volgende aspecten worden beschouwd bij het kiezen van de etikettering kleurstof. Ten eerste, de kleur van de fluorofoor moet wel detecteerbaar zijn door de microscoop used. Ten tweede moet de golflengte van het licht dat door de fluoroforen voldoende verschillend om randen te voorkomen door in het andere kanaal. Dit zal afhangen van de filters in de microscoop. En ten derde, althans in onze handen, sommige kleuren produceren heldere signalen constanter dan anderen. We hebben altijd DAPI (blauw) als tegenkleuring die Alexa Fluor 555 (rood), 488 (groen) maakt, en 647 (ver rood) goede keuzes voor het labelen van probes. Met onze afbeeldingssysteem vonden we Alexa Fluor 555 (rood) de meest heldere signalen, gevolgd door Alexa Fluor 488 (groen) te produceren. Alexa Fluor 647 (ver rood) heeft het nadeel dat het niet kan worden gedetecteerd door het menselijk oog en dus geen signalen zichtbaar zijn wanneer bekeken langs de microscoop. Dus, als het doen van twee-kleuren FISH, adviseren wij de combinatie van rode en groene verf.

Twee belangrijke problemen kunnen ontstaan: cellen wassen uit de dia's en zwakke signalen. Hoe goed cellen zich te houden aan de glijbaan is enorm variabel tussEEN celtypen, en de beste protocol / zaad van de cellen moet worden bepaald vestigen. We hebben met succes gebruikt voor hetzij positief geladen of Poly-L-lysine beklede objectglaasjes (gekocht gebruiksklaar), maar vond cellen gehecht algemeen beter Poly-L-lysine beklede objectglaasjes. We vonden ook dat wanneer de cellen waren te dichte hele gebieden zou afpellen als een blad, terwijl geautomatiseerde beeldvorming werd gehinderd als de cellen waren te schaars. Dus, indien het monster niet te kostbaar, verschillende celaantallen worden gezaaid op het ideale dichtheid bepalen. Als cellen zijn bijzonder gevoelig voor wassen, kan een hydrofobe barrière pen gebruikt en FISH stappen kunnen worden uitgevoerd door zorgvuldig pipetteren, rechtstreeks op het glaasje. Pipetteren ook drastisch vermindert de volumes van reagentia nodig zijn, maar duurt aanzienlijk langer bij het doen van meerdere dia's.

Zwakke signalen zijn meestal te wijten aan slechte sondes, en het is de moeite waard om te investeren tijd in het maken van goede. Schoon BAC DNA moet worden gebruiktd als uitgangsmateriaal kan worden verkregen door herhaalde precipitatie of commercieel verkrijgbare kits. Verontreiniging met bacterieel genomisch DNA negatief effect probe kwaliteit en zorgvuldige behandeling tijdens cellysis en filtreren van het cellysaat nodig om het te minimaliseren. Het is echter niet nodig om een ​​exonuclease stap om lineaire DNA verteren, omdat dit sterk vermindert opbrengst. Efficiëntie-etikettering van de sonde is cruciaal. De belangrijkste kwaliteitscontrole voor deze stap is het controleren van het fragment grootte na nicktranslatie (zie Representatieve resultaten). Een 'goede' uitstrijkje zal bijna altijd resulteren in een felgekleurde sonde. Wij hebben echter gevonden dat soms een zekere BAC niet kan worden verwerkt tot een goede probe en een verschillende BAC moet worden gekozen. Een andere belangrijke stap is warmte denaturatie. Als de temperatuur te laag is, zal het DNA gedeeltelijk gedenatureerde probe hybridisatie worden geschaad. Als de temperatuur te hoog is, nucleaire structuur will worden verstoord meer dan nodig. In onze handen 78 ° C op een omgekeerde hete blok het ideale compromis, maar kan variëren naargelang de gebruikte respectievelijke hete blok.

We hebben goede resultaten met behulp Vectashield montage medium had, maar vond dat Slowfade Gold heeft minder achtergrond en behoudt het fluorescerende signaal voor langer. Wij raden het gebruik van hard-set montage medium aanbevelen als we vonden dit invloed 3D-structuur en luchtbelletjes vormen in de tijd.

Concluderend helder fluorescent gemerkte probes direct samen met de DNA FISH hier beschreven protocol biedt een efficiënte oplossing voor robuuste en snelle analyse van nucleaire architectuur die toepassing op een breed scala aan biologische vragen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
NTB buffer			Step 1.1.1 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
DTT	Invitrogen	D-1532	Step 1.1.1
dNTPs	Bioline	BIO-39025	Step 1.1.1 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Aminoallyl-dUTP	Ambion	AM8439	Step 1.1.1
DNA Polymerase I	New England Biolabs	M02095	Step 1.1.1
DNase I recombinant RNase free	Roche	4716728001	Step 1.1.1
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	28104	Step 1.1.4, 1.2.3
NaOAc	VWR	27653	Step 1.1.5, Step 2.1.1.2
NaHCO3	Sigma	S5761	Step 1.2.1
Alexa Fluor Reactive Dye Decapacks for Microarray Applications	Invitrogen (Molecular Probes)	A32750, A32756, A32757	Step 1.2.2
DMSO (anhydrous)	Sigma Aldrich	276855	Step 1.2.2
SYBR Safe DNA gel stain	Life Technologies	S33102	Step 1.2.4 (alternative to ethidium bromide)
Cot-1 DNA	Invitrogen	18440-016	Step 2.1.1.1 (Cot-1 DNA can be home-made in large quantities and works just as well)
Single stranded DNA from salmon testes	Sigma	D7656	Step 2.1.1.1
Deionised formamide	Sigma	F-9037	Step 2.1.1.3 (Health hazard)
Dextran sulphate	Sigma Life Sciences	D8906	Step 2.1.1.4 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
XMP painting probes	MetaSystems	000000-0528-837	Step 2.1.1.4
Poly-L-lysine coated slides	Sigma Aldrich	P0425	Step 2.1.2
Hydrophobic pen (ImmEdge)	Vector Laboratories	H-4000	Step 2.1.2
70 μm sieve (Mouse f–tal liver cells only)	BD Falcon	352350	Step 2.1.2.1
PFA	Sigma Aldrich	P6148	Step 2.1.3 (Flammable, corrosive, acute toxicity, health hazard) (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Tris-Cl			Step 2.1.3 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Saponin from Quillaja bark	Sigma Aldrich	47036	Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity), (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Triton X-100	Sigma	T9284	Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity, hazardous to the environment)
10 x PBS	Life Technologies (GIBCO)	70011-036	Step 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9,
Glycerol	Fisher Scientific	G/0650	Step 2.1.6
HCl	VWR	20252	Step 2.1.9 (Acute toxicity, corrosive)
Formamide	Sigma Aldrich	47670	Step 2.1.14, 2.2.3 (Health hazard)
SSC			Step 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Coverslips 22 x 22	Menzel-Glaser	BB022022A1	Step 2.1.15
Coverslips 22 x 50	Menzel-Glaser	BB022050A1	Step 2.1.15
Rubber cement	Marabu	2901 (10 000)	Step 2.1.15 (Flammable, health hazard, danger to the environment)
DAPI	Invitrogen Molecular Probes	D3571	Step 2.2.8 (Health hazard)
SlowFade Gold	Invitrogen	S36936	Step 2.2.10 (mounting medium)
Clear nail polish	Any supplier		Step 2.2.10
Equipment
Nanodrop 2000	Thermo Scientific		Step 1.1.6, 1.2.4 (microvolume spectroscopy)
Typhoon FLA 7000 phosphoimager	GE Life Sciences		Step 1.2.4
Coplin jars	Sigma-Aldrich	S6016 (6EA)/S5516 (6EA)	Step 2.1.3 onwards
Liquid nitrogen dewar	Any supplier		Step 2.1.7
Base with Black Lid (light-tight chamber)	Simport	M920-2	Step 2.1.17
Thermomixer comfort	Eppendorf	5355 000.011	Step 2.2.3 (or use shaker in a 37 °C room)
Imaging and Image processing
Metafer - Imaging Automation Platform	MetaSystems		automated imaging software
MetaCyte - Automated Interphase FISH analysis	MetaSystems		automated imaging software
Axio Imager Z2 upright	Zeiss		epifluorescence microscope used with automated imaging
IX81 confocal microscope (FV1000)	Olympus		confocal microscope
Bitplane, version 7.3	Imaris		image analysis and 3D modelling software
Scientific volume Imaging, version 4.1	Huygens		image analysis and deconvolution software
FISH buffers and reaction mixes Name Composition Comments 10 x NTB buffer 0.5 M Tris-HCl, pH 7.5 0.05 M MgCl2 0.5 mg/ml BSA dNTP Mix 0.5 mM dGTP Store 50 μl aliquots at -20 °C 0.5 mM dATP 0.5 mM dCTP 0.125 mM dTTP 4 % PFA Weigh 4 g/100 ml PFA in PBS and heat to 62 °C. Adjust pH with NaOH to 7.0 to dissolve remaining PFA. Store 50 ml aliquots at -20 °C, do not re-freeze 2 % saponin solution Dissolve 2 g saponin per 100 ml PBS by extended stirring. Dissolve and adjust pH to 7.0 with NaOH. Bring to 1 l with ddH20 and autoclave. Store 5 ml aliquots at -20 °C 20 x SSC Weigh 175.3 g NaCl and 88.2 g sodium citrate and add to 80 ml ddH20 . Dissolve and adjust pH to 7.0 with NaOH. Bring to 1 l with ddH20 and autoclave. Dextran sulphate mix 20 % dextran sulphate in 2 x SSC buffer; Vortex solution and mix on a rocker overnight. Store 500 μl aliquots at -20 °C