Robust 3D DNA FISK Använda Direkt märkta prober

Summary

Vi beskriver en robust och mångsidig protokoll för analys kärnkraft arkitektur med 3D DNA FISH hjälp direkt märkt fluorescerande prober.

Abstract

3D DNA FISH har blivit ett viktigt verktyg för att analysera tredimensionella organisationen av kärnan, och flera varianter av tekniken har publicerats. I den här artikeln beskriver vi ett protokoll som har optimerats för robusthet, reproducerbarhet, och användarvänlighet. Ljust fluorescerande direkt märkta prober genereras genom nick-translation med amino-allyldUTP följt av kemisk koppling av färgämnet. 3D DNA FISH utförs med hjälp av en frys-tö steg för cell permeabilization och en uppvärmning steg för samtidig denaturering av prob och nukleärt DNA. Protokollet är tillämpbar på en rad olika celltyper och en mängd av sönder (BAC, plasmider, fosmids eller hela Paints Kromosom) och tillåter hög genomströmning automatiserad bildbehandling. Med denna metod undersöker vi rutinmässigt nukleär lokalisering av upp till tre kromosomala regioner.

Introduction

DNA fluorescens in situ hybridisering (DNA FISH) möjliggör tredimensionell visualisering av enskilda genloci, subkromosomal domäner och även hela kromosomer under alla faser av cellcykeln. 2D FISH används för metafas studier medan 3D fiskar har i stor utsträckning använts för att sondera förhållandet mellan den rumsliga organisationen av genomet och dess funktion under interphasen ^(1,2 och referenser däri). Historiskt sett var co-föreningen studier utförs genom att undersöka tiotals till hundratals enskilda loci vid fisken. Mer nyligen kraftfull hög genomströmning 3C-baserade tekniker såsom 4C och Hi-C har utvecklats ^3, vilket tillåter undersökning av molekylär överhörning mellan många tusentals olika lokus. Medan 3C-baserade tekniker och DNA fisk kan komplementära metoder, de inte nödvändigtvis svara på samma frågor. 3C baserade metoderna ger en ensemble avläsning av blandade cellpopulationer, vilket resulterar i en sannolikhet för co-föreningar. I kontrast medan låg genomströmning, fisk tekniker erbjuder möjligheten att analysera rumsliga arrangemang av loci eller kromosomer i enskilda celler enligt deras utvecklingsbehov eller cellcykeln stadier. Därför kommer FISH fortsätta att vara ett viktigt verktyg för att sondera nukleära struktur-funktionssamband.

Det finns två viktiga aspekter i att utföra lyckade 3D fiskar experiment. Dessa är; 1. erhålla optimalt märkta prober och 2. Valet av cellulära behandlingar, inklusive fixering, pre-och post-hybridisering steg, för att bevara kärnmorfologi så mycket som möjligt samtidigt som DNA är tillräckligt tillgänglig för probhybridisering. Effektiv sond märkning är oerhört viktigt för fisk. Traditionellt har nick-translation använts för att införa antingen hapten eller fluoroforen-konjugerade nukleotider ^4. Likaså kommersiella nick-översättning kit finns för direkt hapten eller fluoroforen införlivande, but även för två-stegs märkning med aminoallyl nukleotider och amin-reaktiva färgämnen. Det senare gör färgämnet införlivande effektivare genom att DNA-polymeras en mindre skrymmande molekyl att arbeta med. På senare tid har byggsatser för den icke-enzymatiska märkning av DNA utvecklats som utnyttjar koordinerade bindning av platina till nukleinsyror. FISH prober kan även köpas redan märkt ^5. Medan kit och kommersiellt tillverkade sonder utan tvekan ge användarvänlighet, är de betydligt dyrare än att köpa de enskilda komponenterna och producera prober i-huset. Vi optimerat en låg kostnad nicktranslation protokoll för att direkt märka många olika BAC sönder i flera färger. Vi upptäckte att erhålla högren BAC DNA är kritisk och resulterar i ett krav på endast 10-20 ng prob per FISH slide, jämfört med 10 - 20 gånger mer när oren mall-DNA används, vilket resulterar i stora kostnads-och tid- sparande. Användningen av amino-allyldUTP tillåter flexibel märkning avprober med tillgängliga amin-reaktiva färgämnen (t.ex. Alexa Fluor eller Cy-färgämnen) eller haptener (t.ex. biotin, digoxigenin). Hapten-märkta prober upptäcks av fluorofor-konjugerade antikroppar eller streptavidin att förstärka och visualisera signalen. Ljusa direkt märkta prober visar generellt mindre bakgrundsfärgning och undvika över-förstärkning av signaler, alltså resulterar i en mer korrekt bild av nukleär lokalisering och locus morfologi.

Det finns flera olika FISK tekniker som använder olika fixativ, pre-behandlingar och post-hybridisering tvättar men dessa generellt delas in i följande kategorier: glutaraldehyd fixering med NaOH denaturering, formaldehyd fixering med HCl denaturering, och formaldehyd fixering med värmedenaturering ^6-9 . Alla dessa har fördelar och nackdelar. Glutaraldehyd fixering resulterar i god kärn strukturell konservering, men kräver behandling med reduktionsmedel för att minimeraden resulterande autofluorescensen, och NaOH behandling måste noga kontrolleras för att balansera tillräcklig DNA denaturering och potentiell skada på kärnkraft struktur ^6. Formaldehyd fixering är mindre stark, vilket ger en ökad risk för störningar av kärnkraft arkitektur, men även typiskt ger starkare och mer tillförlitliga signaler och lägre autofluorescens ^9. HCl behandling depurinates DNA och remsor ut proteiner, som ger god tillgång till DNA för sonderna, men kan också införa DNA-avbrott. Uppvärmning separerar fysiskt de två DNA-strängarna som resulterar i bra mål hybridisering och starka signaler men kan orsaka viss störning av kärnkraft struktur ^8. I vilken mån var och en av dessa tekniker påverkar proteinepitoper varierar kraftigt ^6,9, vilket resulterar i kravet att experimentellt bestämma för varje protein optimal protokoll som ska användas i immuno-FISH experiment.

Det finns ingen "perfekt" DNA FISH technique, kan de alla vara användbart om välkontrollerad. Vårt mål var att optimera ett protokoll för robust och reproducerbar DNA FISH att undersöka rumsliga placeringen av flera loci i en mängd olika celltyper ^10, med fokus på uppvärmning metod för mest pålitliga signaler. Med denna och användning av ett automatiserat avbildningssystem vi syftade till att öka genomströmningen för en enda cell analys av nukleära arrangemang.

Protocol

Ett. Generera direkt märkt DNA-prober genom nicktranslation

Observera: Direkt märkta prober tillverkade av BAC (100-250 kb) konsekvent producera ljusa signaler. Om mindre sonder krävs, använd fosmids (40-50 kb) eller till och med plasmider innehållande 5-10 kb skär. Identifiera BAC eller fosmid kloner som motsvarar specifika gener med Ensemble eller UCSC webbläsare genomet. Förbered hög kvalitet BAC DNA genom upprepad utfällning eller använda kommersiellt tillgängliga kit. Ju mindre beredningen är förorenad med bakteriellt genomiskt DNA, är den mindre sonden krävs per objektglas. Utför märkning i två steg: nicktranslation införa aminoallyl-dUTP och kemisk koppling av en amin-reaktiv färgämne.

1.1. Nick Translation

Under nicktranslation är DNase jag brukade skapa enkelsträngbrott. DNA-polymeras I förlänger 3'-ändarna av dessa "hack", ersätter befintliga nukleotider med nya, t härmed "översätta" nick och därmed ge möjlighet att införliva märkta nukleotider. Aminoallyl-dUTP väljs på grund av effektiv inkorporering av DNA-polymeras I och dess potential för senare kemisk koppling till aminreaktiva färgämnen eller haptener. Det är viktigt att uppnå rätt balans mellan DNase nicking och DNA-polymeras I översättning, för mycket DNas Jag kommer att resultera i överdriven DNA matsmältningen som ger låg avkastning och korta storlekar fragment, för lite kommer inte att producera tillräckligt med hack för polymeras för att initiera translation, ger stora fragment storlek och dålig inkorporering av aminoallyl-dUTP. Följande protokoll fungerar bra men det kan vara nödvändigt att titrera DNAs I från olika satser eller olika tillverkare.

1. Konfigurera märkning reaktion på is och inkubera i 2 h vid 16 ° C. Detta borde innebära 0,5-1 pg nicktranslaterades DNA och kan skalas upp. Späd DNas I 01:30 i DNas I-buffert (dvs. 0,3 U / | il).

1 "> Komponent Koncentration av lager Volym eller belopp BAC-DNA 5-10 ^ g NTB-buffert 10x 5 | il DTT 0,1 M 5 | il dNTP-blandning 10x 5 | il Aminoallyl-dUTP 0,5 mM 6 | il DNA-polymeras I 10 U / | il 1 il DNas I 10 U / | il 1 pl (av en 1:30 spädning) _H2O till 50 | il

2. Kör 1 ul på en 2% agarosgel för att kontrollera storleken av de märkta fragmenten. Medan du kör gelen, hålla reaktionen på is. Framgångsrik nick translatiom kommer att resultera i ett cellprov med huvuddelen av fragmenten som kör mellan 150 bp och 700 bp med några större fragment på ~ 1 kb (kritiskt steg: se Representativa resultat). Om det behövs, lägga till ytterligare en fil av en färskt 01:30 DNas I utspädning och inkubera vid 16 ° C under 15-30 min. Inkubationstiden kommer att variera beroende på mängden och kvaliteten av BAC-DNA.
3. Inaktivera DNas I genom upphettning till 75 ° C under 10 min.
4. Clean-up aminmodifierade DNA med användning av ett PCR-reningskit. Eluera i 100 pl _H2O
5. Etanolfällningen DNA genom att tillsätta 10 pl 3 M NaOAc (pH 5,2) och 275 pl etanol. Lämna vid -20 ° C i minst 1 h eller över natten. Snurra vid maximal hastighet under 30 min vid 4 ° C. Tvätta pelleten med 500 | il 70% etanol och låt lufttorka. Detta steg avlägsnar spår aminer som kommer att störa märkning reaktionen. Återsuspendera pelleten i 6 il _H2O per 1x första reaktion.
6. Använd 1 il för att bestämma koncentrationen av den amin-modifierade DNAgenom microvolume UV-spektroskopi.

1.2. Koppling av det fluorescerande färgämnet

Fluorescent märkning av sonden uppnås genom kemisk koppling av färgämnet. Alexa Fluor succinimidylester färgämnen reagerar med aminerna i den modifierade amino-allyldUTP DNA för att bilda en kovalent bindning, varigenom direkt märkta prober. Alexa Fluor 488, 555, och 647 färgämnen har varit framgångsrika för denna process.

1. Justera 4 pg av amino-allyl modifierad DNA till en volym av 5 | il, upphetta till 95 ° C under 5 min, snäpp kyla på is, och tillsätt 3 | il av 0,2 M NaHCO _3.
2. Lös upp en alikvot av amin reaktiv färg i 2 ^ vattenfri DMSO vid rumstemperatur. Lägg 8 | il modifierat DNA med NaHCO _3, virvel, pulsera spinn och inkubera vid rumstemperatur i mörker under 1 timme.

Anmärkning: De amin-reaktiva färgämnen kan användas för att märka mer än en sond baserad på följande schema. Eftersom Ondast 10-20 ng prob används per slide märkning, ger 1 mikrogram räcker prob för 50-100 bilder. Det är också möjligt att lagra aminmodifierade DNA för framtida märkningsreaktioner vid -20 ° C.

DNA belopp	DNA-volym	0,2 M NaHCO 3	Volym av färgämne	Totalt	Tillräckligt för
4 x 1 ^ g	1,25 il vardera	0.75 il vardera	0,5 il vardera	2,5 | il (1/4)	50-100 diabilder vardera
3 x 1,35 g	1,67 il vardera	1 il vardera	0,67 il vardera	3,34 l (1/3)	65-130 slide varje
2 x 2 ^ g	2,5 il vardera	1,5 il vardera	1 il vardera	5 | il (1/2)	100-200glider varje
1 x 4 pg	5 | il	3 il	2 pl	10 | il (full)	200-400 diabilder

3. Lägg 90 | il _H2O och renar märkt prob med användning av en PCR-reningskit. Eluera i 100 | il 10 mMTris-Cl (pH 8,5).
4. Bestäm probkoncentration och märkning effektivitet genom microvolume hela spektrumet spektroskopi (se figur 2) med Beer-Lambert ekvationerna (Instruktioner ges i databladet åtföljer Alexa Fluor reaktiva färgämnen eller kan hittas på nätet). Sonderna innehåller 3-6 färgämnen per 100 bp fungerar bra. Sönder med lägre grad av inkorporering kan ge svag fisk signaler. Alternativt, kör 5 ^ på en 2% agarosgel utan DNA fläcken och kontrollera införlivandet av fluorescerande färg med en phosphoimager. Post-färga gelen med etidiumbromid eller DNA alternativ färgning och jämför märkt DNA till total DNA.

Via följande steg, är cellerna av intresse fäst diabilder och permeabiliseras. Cellulärt DNA och direkt märkta prober därefter denatureras tillsammans på en värmeplatta och hybridiserades över natten i en ljustät fuktkammare.

2.1. Dag 1

1. Probe Utfällning
   Obs: fällning sonder någon gång under dag 1. Detta kan bekvämt utföras parallellt med behandlingen av cellerna och behöver inte göras i början av dagen.
   1. Blanda 10-20 ng direkt märkt sond, 6 pl C ₀ t-1 DNA (6 mikrogram), 1 pl enda DNA från lax testiklar (9,7 g) och justera volymen till 100 l med vatten.
   2. Tillsätt 10 l 3 M NaOAc och 275 xl EtOH, och omskakas. Fällning i minst 1 h vid -20 ° C.
   3. Spin i mikrofug vid maximal hastighet under 30 min vid 4 ° C. Tvätta pelleten med 70% EtOH och snurra igen. Torr pelletoch återsuspendera i 5 ^ avjoniserat formamid. Resuspendera i 30 min vid 37 ° C under skakning vid 1000 rpm skyddade från ljus (plats folie över Thermomixer).
   4. Tillsätt 5 | il dextransulfat blanda och skaka i ytterligare 10 min vid 37 ° C igen skyddas mot ljus. Pipettera upp och ner precis innan pipettering på täckglas.
      Obs: För kromosom målning kombinerat med BAC sonder, hel kromosom målning sonder som levereras i färdiga att använda hybridiseringsblandning är ett bekvämt alternativ. Återsuspendera utfälldes BAC sond (med C ₀ t1 DNA och enkelsträngad DNA från lax testiklar) i 10 ^ kromosom färg blandas genom att pipettera upp och ned. Inkubera vid 37 ° C under skakning vid 300-500 rpm under 10 min. Använd 10 pl kromosom färg / BAC sondblandningen per plats.
2. Fästa celler till Slides
   Obs: celler benägenhet att vidhäfta till objektglasen kraftigt varierar med celltyp. För varje celltyp, fastställa vilkenoptimala inställningstid och celltäthet empiriskt. För konsekventa resultat bör cellerna i en enda cellsuspension.
   För enkel användning cirkel området cellerna kommer att upptäckas på med en hydrofob penna, även för celler återsuspenderades i PBS är detta inte absolut nödvändigt. En hydrofob barriär hindrar avstängning från spridning på bilden, håller upp till tre prover per slide snyggt separerade och tillåter användning av mycket små volymer av antikropp lösning i immuno-FISH. Dessutom kan spotting område hållas till ett minimum om cellantal är låga.
3. Mus fetala leverceller
   1. Samla varje E13.5 musfosterlever i cirka 1,5 ml PBS och återsuspendera genom att pipettera upp och ned. Spin i mikrofug vid 3000 rpm under 2 min. Upprepa tvättar tre gånger. Vid den sista tvättningen, stam celler genom en 70 ^ m sikt. Resuspendera cellerna från en lever i 160 pl PBS och använd 50 μ per fläck. Lämna cellerna att sedimentera i 2 min vid rumstemperatur.
4. Mouse ES-celler
   Ett. Mus-ES-celler inte fastnar lätt till bilden. På en bild, området cirkeln cellerna kommer att upptäckas på med en hydrofob penna. Bered en suspension av 20,000-50,000 celler per 80-100 ul i normal odlingsmedium, pipett in i cirkeln och låt fästa under ca 3 timmar i en fuktig kuvös Obs. Alternativt kan ES-celler odlas på bilderna, men kommer sedan att utgöra kolonier som kan försvåra automatiserad bildbehandling.
5. Fixerade celler
   Ett. Vissa experiment kräver användning av fixerade celler som inte fäster till objektglasen genom själva. Gentle spinning vid 300 rpm under 3 min med användning av en cytocentrifug bevarar den tredimensionella strukturen av cellerna och säkerställer att celler inte ramlar av.

Celltyp	Suspension i	Insvängningstid	Kommentera
Musfetal lever	PBS	2 min	På bänken
Mouse ES	DMEM med tillskott	4 tim	37 ° C i fuktad inkubator
Mus lymfocyter	PBS	2 min	På bänken
Mus P20 könsceller	Fix i lösning	Cytospin	På bänken

3. För att fixa celler, försiktigt dränka bildspel i 4% PFA (VARNING: Utför i dragskåp) under 10 minuter. Fix celler med sliden lägenhet i ett fack för bästa retention av celler (t.ex. 50 ml 4% PFA i locket av en spets box) Anmärkning:. Här steget gäller inte celler fixerade före fastsättning till diabilder.

För alla efterföljande steg, använd 50 ml eller 100 ml Coplinburkar. Se till att inte skrapa celler bort när du flyttar bilder mellan burkar.

4. Släck i 0,1 M Tris-Cl, pH 7,4 under 10 min vid rumstemperatur.
5. Permeabilisera celler i 0,1% saponin/0.1% Triton X-100 i PBS under 10 min vid rumstemperatur.
6. Tvätta två gånger i PBS under 5 min vid rumstemperatur.
7. Inkubera under minst 20 min i 20% glycerol / PBS vid RT Obs. Vid denna punkt, kan objektglasen lagras i 50% glycerol / PBS vid -20 ° C under åtminstone flera veckor. Det har observerats att lagring under minst en dag resulterar i en ökning i signalstyrka ^9. Kalibrera i rumstemperatur 20% glycerol / PBS innan du fortsätter Observera:. Detta är en lämplig punkt att börja fälla sonderna (se 2.1.1).
8. 3x frysning / upptining i flytande kväve. Sänk en bild i taget i flytande kväve med hjälp av en liten Dewar. Dra efter ett par sekunder och en karakteristisk poppande ljud, och lägg på hushållspapper för att tina. Vänta ogenomskinlig frusen glycerol att försvinna sedan frysa igen. Upp till 15 bilder kan göras bekvämt i rotation för tre frys / tö cykler.
9. Waska två gånger i PBS under 5 min vid rumstemperatur.
10. Inkubera i 0,1 M HCl under 30 min vid RT.
11. Tvätta i PBS under 5 min vid rumstemperatur.
12. Permeabilize i 0,5% saponin/0.5% Triton X-100/PBS under 30 min vid RT.
13. Tvätta två gånger i PBS under 5 min vid rumstemperatur.
14. Jämvikt i 50% formamide/2x SSC under minst 10 min vid RT.
15. Pipettera sond på ett täckglas. Avlägsna objektglaset från burken och torka bort överflödig vätska runt cellen plats (er) med en pappershandduk. Som formamiden torkar snabbt, se till att inte torka ut celler. För bilder med två eller tre celler fläckar, tillämpa 10 il prob per plats på en 22 mm x 50 mm täckglas motsvarande upptäcka platsen på bilden. Invertera täckglas på objektglas över fläcken (s). Täta med gummi cement och låt detta torka helt. Skyddas från ljus i alla efterföljande led.
16. Heat diabilder till 78 ° C under exakt 2 minuter på en varm platta (t.ex. en inverterad värmeblock, kritiskt steg: se diskussion). Placera ett lock (kartong eller sim Ilar) över den varma plattan för att skydda mot ljus under denaturering.
17. Inkubera över natten vid 37 ° C i en ljustät fuktkammare. För att fukta, placera pappershanddukar i en ljustät låda och dämpa med vatten.

2,2 Dag 2

1. Förbered Coplinburkar med lösningar vid rätt temperatur för efterföljande tvättsteg. Skydda bilder från ljus så mycket som möjligt under alla efterföljande steg. En kaffe kan gör ett bra ljus-tight skydd för Coplinburkar.
2. Dra av gummi cement och plats glida i 2x SSC tills täckglas lossna och glida av.
3. Tvätta i 50% formamide/2x SSC under 15 min vid 45 ° C. Sätt lock på vattenbad för att skydda mot ljus.
4. Tvätta i 0,2 x SSC under 15 min vid 63 ° C.
5. Tvätta i 2x SSC under 5 min vid 45 ° C.
6. Tvätta i 2x SSC under 5 min vid rumstemperatur.
7. Tvätta i PBS under 5 min vid rumstemperatur.
8. Fläcken med DAPI (5 | ig / ml i 2 x SSC) under 2 min i ett Coplin-kärl vid RT.

innehåll "> Anmärkning: DAPI-lösning kan lagras vid 4 ° C i mörker under två månader.

9. Avfärga i PBS under 5 min vid rumstemperatur.
10. För att montera täckglas, pipett montering mediet på ett täckglas. Använd 10 l per cell plats, med hjälp av 22 mm x 22 mm täckglas för en plats, och 22 mm x 50 mm täckglas i två till tre ställen. Torka av PBS runt cellen plats så mycket som möjligt, men se till att inte torka ut cellerna. Invertera täckglas på objektglas, och tätning med nagellack.

Representative Results

Protokollet som beskrivs här (figur 1 för översikt) har använts med stor framgång för att kombinera DNA FISH med hög genomströmning bildfångst för analys av genomisk organisation. Den generation av god kvalitet sonder är avgörande för framgång (se diskussion). Figur 2 visar två viktiga kvalitetskontroller för FISH sonder. Efter nick-translation, bör ett utstryk av DNA vara synlig med huvuddelen av fragmenten körs mellan 150 och 700 bp (Figur 2A). Efter kemisk koppling, kan inkorporering av det fluorescerande färgämnet mätas genom spektroskopisk analys av sonden (Figur 2B).

Vid användning av goda sönder, efter protokollet DNA FISH oftast resulterar i ljusa signaler DNA fiskar på låg bakgrund. Vi har med framgång använt detta protokoll på en mängd olika celltyper, och med antingen epi-fluorescens eller konfokala mikroskop. Automatiserad avbildning med en epi-fluorescence mikroskop kräver skarpa, lätt identifierbara FISH signaler med lite bakgrund (Figur 3), medan konfokalmikroskopi kräver mer intensiva signaler. Figur 4A visar representativa bearbetade bilderna. Nuclear koordinater av fisk signaler kan erhållas, och rumsliga relationer genomiska regioner kan beräknas (till exempel se figur 4B). Vi har också använt bildstaplar erhållits genom konfokalmikroskopi för 3D-modellering av fisk signaler inom deras kromosom territorier (film 1).

Figur 1. Arbetsflöde för sond märkning och DNA-FISH. Probe förberedelse visas i blått. DNA FISH procedur visas i svart med uppgifterna i grönt.

Figur 2. Märkning prober genom nick-translation och kvalitetskontroll av märkta prober. A) gel som visar idealisk smeta före upphettning för att inaktivera DNas I (bana 1: DNA-stege, spår 2 och 3: BACs efter nick-translation). Fragment bör vara i 150-700 bp sortiment. En ytterligare smeta på ~ 1 kb observeras ofta med framgångsrika nick-översättning reaktioner.. B) Microvolume fullt spektrum analys av märkta prober En DNA-topp vid 260 nm observeras med en andra topp som motsvarar det absorbansvärde våglängden av fluoroforen sonden är märkt med: Alexa Fluor 488: 495 nm, Alexa Fluor 555: 555 nm, Alexa Fluor 647: 650 nm. Visade är tre prober med god införlivande: fluoroforenhetema absorbanstoppar är en liknande höjd eller högre än DNA topparna. Alexa Fluor 647 har typiskt högre absorbansän Alexa Fluor 555, vilket i sin tur har högre absorbans än Alexa Fluor 488. Alexa Fluor 488 absorberar också lite ljus vid 260 nm, därav den första toppen för denna sond är högre än de andra. Prober med dålig inkorporering show fluorofor absorbans 2-3 gånger lägre än den DNA-absorbans. Sönder med en mer än 2-faldigt högre fluoroforen topp än DNA topp innehåller typiskt okonjugerat färgämne som kan orsaka bakgrunden i fisken.

Figur 3. Skärmdump från MetaCyte 3D FISH bildprogram som visar en typisk tre färger FISH experiment. Skärmen är uppdelad i flera delar.. A) Raw fält-of-view (FOV) videobild som tas med Metafer / MetaCyte diabilder systemet B) Galleri bilder av identifierade kärnor som har undergone bildbehandling och segmentering för fisk signaler. Olika typer av data kan visas på varje galleriet image. I detta exempel cell nummer visas överst till vänster med olika interallelic och avstånden interlocus uppe till höger och på vardera sida under varje bild.) C Slide namn med antalet kärnor som identifierats i analysen. D) skildring av bilden med det område som skannas av systemet. E) Utvidgningen av det skannade området. Vita fläckar representerar identifierade kärnor per FOV. F) Bearbetade data. I detta exempel maximala interallelic avstånd mellan gröna signaler (överst) och röda signaler (nederst) visas. Data som visas är från mus P20 könsceller. Sönder ligger på olika kromosomer, som täcker Hbb och HBA-gener och en histone kluster. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 4. Exempel på bearbetade bilder och härledda positionsdata. A) Bearbetade bilder för E13.5 musfosterlever celler färgade med BAC sonder placerade på olika kromosomer som täcker Myc och KCNQ1 gener (kallas myc och KvDMR, färgat grönt och rött, respektive). B) Tukey box-morrhår tomter representerar interallelic avstånd fördelning för samma loci i 600 kärnor. Interallelic avstånd ritas som en del av kärnan 'radien (avståndet / radie) att ta hänsyn till variationer i kärn storlek. ES cellkärnor har en radie på ca 5 | im. Röda prober är betydligt närmare varandra än gröna prober (***: p <0,01, oparat t-test). Data från ^10.

Film 1. 3D-modellering av två loci inom deras kromosom territory. Två BAC sonder placerade nära vardera änden av muskromosom 7 märktes (röd och långt rött, (pseudo-färgade vita)) och hybridiserades tillsammans med en hel kromosom färg (grön) till mus-ES-celler. Klicka här för att se filmen .

Discussion

3D DNA FISH har blivit en allmänt erkänd verktyg för att analysera rumsliga arrangemang i kärnan. Även fisk ger visuella och direkta resultat, som med varje teknik, måste man vara medveten om sina begränsningar. DNA FISH står det inneboende problemet att relativt hårda behandlingar behövs för att göra kromatin tillgänglig för fisk sonder som slutligen stör kärnkraft struktur-just det som ska analyseras. Flera strategier har eftersträvas att jonglera tillgänglighet och struktur bevaras. I det protokoll som beskrivs här, är kromosomal DNA görs tillgänglig genom frysning-tining permeabilization av celler och värmedenaturering före probhybridisering. Solovei, et al., (2002) analyserade strukturella förändringar efter liknande behandling och fann att den genomsnittliga förskjutningen av kromatin domäner var 300 nm, vilket begränsar upplösningen av strukturell analys att cirka 1 Mb regioner i genomet ^8. Även om detta inte hög upplösning, detär en rimlig nivå för att analysera kärnkraft position.

En mer praktisk fråga för FISH analys är att bilden förvärv och mätningar av nukleära avstånden är tidskrävande processer som begränsar antalet kärnor som kan analyseras. För att studera ovanliga händelser vi siktade på att göra hög genomströmning automatiserad bildbehandling. Sedan, med lämpliga kontroller på plats, kan tillräckligt antal jämföras för att möjliggöra robust statistisk analys av rumsliga relationer. Vi analyserar rutinmässigt 600 kärnor per datapunkt som vi bestämmer 3D-koordinaterna av all fisk signaler inom det nukleära volymen. Dessa uppgifter kräver mycket lite utrymme och möjliggör analys av inter-och intra-allel avstånd eller radiella positioner vid någon senare tidpunkt. Dessutom kan automatiserad behandling ske i en forskare blint sätt som i hög grad minskar sannolikheten för omedvetna fördomar.

För att möjliggöra denna typ av hög genomströmning analysär, var vårt mål att skapa ett snabbt och effektivt sätt att utföra DNA-FISH. Vi hittade det protokoll som beskrivs här för att vara extremt robust, konsekvent producerar ljusa signaler med låg bakgrund. Det fungerade för alla celltyper vi försökt förutsatt att vi anpassat steget att fästa cellerna till bilden. Dessutom, med ett undantag, kunde alla BAC vi använt vändas till ljusa sonder. Vi har också framgångsrikt upptäckt ett antal nukleära proteiner genom antikroppsfärgning efter DNA-FISH. Även för vissa proteiner detta fungerar bra, rekommenderar vi jämförelse med traditionella immunofluorescens (IF) för att säkerställa konsekvens av antikroppen färgningsmönstret mellan IF och DNA immuno FISH (jämför ^11).

Generellt fann vi att prober märkta i olika färger gav samma resultat. Dock bör följande aspekter beaktas när man väljer märkning färgämnet. Först måste färgen av fluoroforen vara väl detekterbar genom mikroskopet used. Andra bör våglängden hos det ljus som avges av fluoroforer vara tillräckligt olika för att undvika blöda igenom till den andra kanalen. Detta kommer att bero på filtren i mikroskopet. Och för det tredje, åtminstone i våra händer, vissa färger ger ljusa signaler mer konsekvent än andra. Vi har alltid använt DAPI (blå) som en motfärg som gör Alexa Fluor 555 (röd), 488 (grön), och 647 (långt rött) bra val för märkning av prober. Med vårt avbildar systemet, fann vi Alexa Fluor 555 (röd) för att producera de ljusaste signaler, följt av Alexa Fluor 488 (grön). Alexa Fluor 647 (långt rött) har den nackdelen att den inte kan upptäckas av det mänskliga ögat, och därför inga signaler kan ses när man tittar ner i mikroskopet. Således, om gör tvåfärgad FISK, rekommenderar vi en kombination av röda och gröna färger.

Två huvudsakliga problem kan uppstå: celler tvätta bort bilderna och svaga signaler. Hur väl celler följer bilden är enormt varierande between celltyper, och det bästa protokollet för att lösa / frö cellerna måste fastställas. Vi har framgångsrikt användas antingen positivt laddad eller poly-L-lysinbelagda objektglas (köpta färdig att använda), men fann celler i allmänhet vidhäftade bättre att poly-L-lysinbelagda objektglas. Vi fann också att när celler var alltför täta hela områden skulle lossna som ett ark, medan automatiserad bildbehandling hämmades om cellerna var alltför gles. Således, om provet inte är alltför dyrbar, bör olika cellantal seedas att bestämma den ideala densiteten. Om celler är särskilt benägna att tvätta bort, kan en hydrofob barriär penna användas och fisk stegen kan utföras genom att försiktigt pipettera lösningar direkt på bilden. Pipettering också drastiskt minskar volymerna av nödvändiga reagenser, men tar betydligt längre tid när man gör flera bilder.

Svaga signaler är oftast på grund av dåliga sönder, och det är väl värt att investera tid på att göra bra. Clean BAC-DNA bör användad som utgångsmaterial, som kan erhållas genom upprepad utfällning eller kommersiellt tillgängliga kit. Förorening med bakterie-DNA påverkar negativt sond kvalitet och noggrann hantering under cellysering och filtrering av cellysatet är skyldig att hålla det till ett minimum. Det är emellertid inte nödvändigt att använda ett exonukleas steg att smälta linjärt DNA, eftersom detta i hög grad reducerar utbyte. Effektiv märkning av sonden är avgörande. Den viktigaste kvalitetskontrollen för detta steg är att kontrollera fragment storlek efter nicktranslation (se Representativa resultat). En "bra" smeta kommer nästan alltid att resultera i en färgglad sond. Vi har emellertid funnit att ibland en viss BAC inte kan bearbetas till en bra sond, och en annan BAC måste väljas. Ett annat viktigt steg är värmedenaturering. Om temperaturen är för låg, kommer DNA vara endast delvis denatureras och probhybridisering risk för skada. Om temperaturen är för hög, kärn struktur will störas mer än nödvändigt. I våra händer, är 78 ° C på en inverterad varma blocket den idealiska kompromissen, men detta kan variera beroende på respektive använd varma blocket.

Vi har haft bra resultat med Vectashield monteringsmedium, men fann att SlowFade Gold har mindre bakgrund och bevarar den fluorescerande signalen längre. Vi rekommenderar inte användning av hård-set montage mediet som vi funnit att påverka 3D-struktur och att bilda luftbubblor över tiden.

Sammanfattningsvis ljust fluorescerande direkt märkta prober tillsammans med DNA-FISH protokoll som beskrivs här erbjuda en effektiv lösning för robust och snabb analys av kärn-arkitektur, som är tillämplig på en mängd olika biologiska frågeställningar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
NTB buffer			Step 1.1.1 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
DTT	Invitrogen	D-1532	Step 1.1.1
dNTPs	Bioline	BIO-39025	Step 1.1.1 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Aminoallyl-dUTP	Ambion	AM8439	Step 1.1.1
DNA Polymerase I	New England Biolabs	M02095	Step 1.1.1
DNase I recombinant RNase free	Roche	4716728001	Step 1.1.1
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	28104	Step 1.1.4, 1.2.3
NaOAc	VWR	27653	Step 1.1.5, Step 2.1.1.2
NaHCO3	Sigma	S5761	Step 1.2.1
Alexa Fluor Reactive Dye Decapacks for Microarray Applications	Invitrogen (Molecular Probes)	A32750, A32756, A32757	Step 1.2.2
DMSO (anhydrous)	Sigma Aldrich	276855	Step 1.2.2
SYBR Safe DNA gel stain	Life Technologies	S33102	Step 1.2.4 (alternative to ethidium bromide)
Cot-1 DNA	Invitrogen	18440-016	Step 2.1.1.1 (Cot-1 DNA can be home-made in large quantities and works just as well)
Single stranded DNA from salmon testes	Sigma	D7656	Step 2.1.1.1
Deionised formamide	Sigma	F-9037	Step 2.1.1.3 (Health hazard)
Dextran sulphate	Sigma Life Sciences	D8906	Step 2.1.1.4 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
XMP painting probes	MetaSystems	000000-0528-837	Step 2.1.1.4
Poly-L-lysine coated slides	Sigma Aldrich	P0425	Step 2.1.2
Hydrophobic pen (ImmEdge)	Vector Laboratories	H-4000	Step 2.1.2
70 μm sieve (Mouse f–tal liver cells only)	BD Falcon	352350	Step 2.1.2.1
PFA	Sigma Aldrich	P6148	Step 2.1.3 (Flammable, corrosive, acute toxicity, health hazard) (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Tris-Cl			Step 2.1.3 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Saponin from Quillaja bark	Sigma Aldrich	47036	Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity), (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Triton X-100	Sigma	T9284	Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity, hazardous to the environment)
10 x PBS	Life Technologies (GIBCO)	70011-036	Step 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9,
Glycerol	Fisher Scientific	G/0650	Step 2.1.6
HCl	VWR	20252	Step 2.1.9 (Acute toxicity, corrosive)
Formamide	Sigma Aldrich	47670	Step 2.1.14, 2.2.3 (Health hazard)
SSC			Step 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Coverslips 22 x 22	Menzel-Glaser	BB022022A1	Step 2.1.15
Coverslips 22 x 50	Menzel-Glaser	BB022050A1	Step 2.1.15
Rubber cement	Marabu	2901 (10 000)	Step 2.1.15 (Flammable, health hazard, danger to the environment)
DAPI	Invitrogen Molecular Probes	D3571	Step 2.2.8 (Health hazard)
SlowFade Gold	Invitrogen	S36936	Step 2.2.10 (mounting medium)
Clear nail polish	Any supplier		Step 2.2.10
Equipment
Nanodrop 2000	Thermo Scientific		Step 1.1.6, 1.2.4 (microvolume spectroscopy)
Typhoon FLA 7000 phosphoimager	GE Life Sciences		Step 1.2.4
Coplin jars	Sigma-Aldrich	S6016 (6EA)/S5516 (6EA)	Step 2.1.3 onwards
Liquid nitrogen dewar	Any supplier		Step 2.1.7
Base with Black Lid (light-tight chamber)	Simport	M920-2	Step 2.1.17
Thermomixer comfort	Eppendorf	5355 000.011	Step 2.2.3 (or use shaker in a 37 °C room)
Imaging and Image processing
Metafer - Imaging Automation Platform	MetaSystems		automated imaging software
MetaCyte - Automated Interphase FISH analysis	MetaSystems		automated imaging software
Axio Imager Z2 upright	Zeiss		epifluorescence microscope used with automated imaging
IX81 confocal microscope (FV1000)	Olympus		confocal microscope
Bitplane, version 7.3	Imaris		image analysis and 3D modelling software
Scientific volume Imaging, version 4.1	Huygens		image analysis and deconvolution software
FISH buffers and reaction mixes Name Composition Comments 10 x NTB buffer 0.5 M Tris-HCl, pH 7.5 0.05 M MgCl2 0.5 mg/ml BSA dNTP Mix 0.5 mM dGTP Store 50 μl aliquots at -20 °C 0.5 mM dATP 0.5 mM dCTP 0.125 mM dTTP 4 % PFA Weigh 4 g/100 ml PFA in PBS and heat to 62 °C. Adjust pH with NaOH to 7.0 to dissolve remaining PFA. Store 50 ml aliquots at -20 °C, do not re-freeze 2 % saponin solution Dissolve 2 g saponin per 100 ml PBS by extended stirring. Dissolve and adjust pH to 7.0 with NaOH. Bring to 1 l with ddH20 and autoclave. Store 5 ml aliquots at -20 °C 20 x SSC Weigh 175.3 g NaCl and 88.2 g sodium citrate and add to 80 ml ddH20 . Dissolve and adjust pH to 7.0 with NaOH. Bring to 1 l with ddH20 and autoclave. Dextran sulphate mix 20 % dextran sulphate in 2 x SSC buffer; Vortex solution and mix on a rocker overnight. Store 500 μl aliquots at -20 °C