Summary
Мы генетически кодирования искусственную аминокислоту, р-азидо-L-фенилаланина в различных целевых позиций в GPCRs и показать универсальность азидогруппы в различных приложениях. Они включают в себя целевой фотосшивки технологии для выявления остатков в лиганд-связывающего кармана GPCR и по конкретным участкам bioorthogonal модификацию GPCRs с пептид-эпитопной меткой или флуоресцентного зонда.
Abstract
Для облегчения структурные и динамические исследования G-белками рецепторы (GPCR) комплексы сигнализации, необходимы новые подходы ввести информативные зондов или наклейки в выраженных рецепторов, которые не нарушают функции рецептора. Мы использовали технологию подавления кодон янтарный генетически-кодирования искусственную аминокислоту, п-азидо-L-фенилаланин (AZF) в различных целевых позиций в GPCRs гетерологично выраженных в клетках млекопитающих. Универсальность азидогруппы иллюстрируется здесь в различных приложениях для изучения GPCRs на родном клеточной среде или под моющих солюбилизированных условиях. Во-первых, демонстрируют на основе клеток целевой фотосшивки технологию для идентификации остатков в лиганд-связывающего кармана GPCR где лиганд малые молекулы меченный тритием сшивают с генетически закодированного азидо аминокислоты. Затем мы продемонстрировать конкретным участкам модификацию GPCRs по bioorthogonal Штаудингера Bertozzi перевязки реакцийТион, что цели азидогруппы использованием производных фосфина. Мы обсуждаем общую стратегию для целевой пептид-эпитопной мечения выраженных мембранных белков в-культуры и ее обнаружения с помощью цельноклеточная подхода, основанного ELISA. Наконец, мы покажем, что AZF-GPCRs могут быть выборочно помечены флуоресцентных зондов. Методики, рассмотренные в целом, в том, что они в принципе может быть применен к любой аминокислотной позиции в любой выражена GPCR чтобы опросить активные комплексы сигнализации.
Introduction
Heptahelical G-белком рецепторы (GPCR) содержат суперсемейство очень динамичных мембранных белков, которые обеспечивают важные и разнообразные внеклеточные сигналы. В классической парадигмы, активация рецептора в сочетании с лиганд-индуцированной конформационных изменений. 1, 2 Последние достижения в области структурной биологии GPCRs оказали значительную представление о молекулярных механизмах трансмембранного сигнализации. 3-5 Однако, чтобы понять с большей химической точностью в функциональный механизм и структурная динамика сигнализации GPCR, инструментарий подходов требуется включить информативные молекулярные и химические исследования, чтобы допросить активные комплексы сигнализации.
С этой целью, мы адаптировали метод к сайт-специфически ввести не-или минимально возмущающие зонды в выраженных рецепторов на основе неестественной аминокислоты (UAA) мутагенеза с использованием янтаря кодон технологией подавления ранее пионером Шульц и сoworkers. 6 Мы оптимизировали методологию мутагенеза UAA для достижения выражение высокодоходным и системы мутагенеза для белков, таких как GPCRs, которые трудно выразить в другие, чем клетки млекопитающих наиболее гетерологичные системы. Использование ортогональной инженерии супрессорной тРНК и развивались аминоацил-тРНК синтетазы пару для конкретного UAA, мы сайт-специфически введены УААН в выраженных целевых GPCRs. Успешное включение УААН, п-ацетил-L-фенилаланин (ACF), п-бензоил-L-фенилаланин (БЗФ) и п-азидо-L-фенилаланин (AZF) была продемонстрирована в наших модельных GPCRs - родопсина и человеческий CC хемокинов, CCR5. 7, 8
В принципе, UAA могут быть генетически закодированы в любой позиции внутри белковой последовательности, и это свойство является бесценным биохимический инструмент, поскольку позволяет одним кодонов сканирование целевой GPCR. Мы сосредоточимся именно на универсальность UAA, AZF, которая имеет реактивный Aziсделать группировку. В дополнение к действующей в качестве уникального инфракрасного (ИК) датчика, 8, 9 AZF также может служить в качестве Фотоактивируемые сшивающего агента путем взаимодействия с соседними первичных аминов или алифатических атомов водорода. Кроме того, биологически инертным азидо-группа может участвовать в качестве селективного химического ручкой в bioorthogonal реакций маркировки. Здесь мы представляем примеры, иллюстрирующие полезные применения конкретных участков включения AZF в GPCRs, таких как целевой фотосшиванию ловушку в рецептор-лиганд, и модификации GPCRs по bioorthogonal эпитопной пометки и люминесцентных стратегий маркировки.
Фотоактивируемые реагенты были использованы для изучения биологических систем с 1960 года. 10 В этот период, обилие рецептор-лиганд экспериментов сшивания были зарегистрированы для изучения GPCR комплексы, большинство из которых связано с использованием фотоаффинное лигандов. 11, 12 Однако эти приложений технически ограничено, так как они Requirэ синтез лигандов, несущих сшивания группу. 13-15 Кроме того, с сшивателя фрагмента в лиганда, это сложно определить местоположение пантографа на GPCR. Сайт-специфически введения фотосшивки группы, как УААН в белки с использованием кодонов желтым технологии подавления является ценным продвижение. 16, 17 Мы разработали методику фотосшивки, чтобы определить интерфейс на связывание с рецептором, который участвует в формировании рецептор-лиганд в живых клеток путем введения фотолабильных групп в GPCRs. 18, 19 Здесь мы описываем экспериментальный протокол и способ анализа данных для применения этого целевого технологии фотосшивки идентифицировать сайт связывания лиганда с малой молекулой, меченного тритием маравирок, на CCR5. Этот способ использует преимущества точного количественного определения радиоактивного ручкой на лигандом, в дополнение к сохранению родной химическую структуру лиганда.
Методы флуоресценции основе поддерживать точное понимание структурной основе активации рецептора непосредственно зондирования конформационное состояние рецептора. 20, 21 Однако, методы, обладающие гибкостью ввести флуоресцентные метки в GPCRs сайт-специфически ограничены. Мы заинтересованы в привлечении bioorthogonal стратегии химической модификации для облегчения обнаружения одиночных молекул (SMD) из GPCR сигнализации комплексов. 22 азидогруппу могут участвовать в bioorthogonal химии, таких как Штаудингера Bertozzi перевязки, 23, 24 меди без деформации раскрученной азида- алкин циклоприсоединение (SpAAC) 25 и медно-катализируемой азид-алкин циклоприсоединение (CuAAC). 26 Мы сосредоточимся на перевязки реакции Штаудингера Bertozzi который включает в себя специфическую реакцию между азида и фосфина. Показано, использование двух различных производных фосфин, конъюгированный с эпитопом пептида FLAG (пептид) или флуоресцентной меткой(Флуоресцеина) для достижения конкретного участка модификацию GPCRs.
Мы ранее Оптимизированы условия по конкретным участкам маркировки родопсина AZF варианты с использованием рентгеновской кристаллическую структуру и динамическое моделирование выбрать целевые сайты, которые растворителя подвергается. 27, 28 Мы также проиллюстрировал возможности для достижения фона без маркировки на Staudinger- Bertozzi лигирование. 29 Покажем здесь общей процедуре, используемой для достижения флуоресцентного мечения моющей-солюбилизированного рецептора, который иммобилизован на иммуноаффинной матрицы, а затем визуализировали с помощью флуоресценции в геле. Кроме того, мы демонстрируем полезное расширение на этой маркировки стратегии выявления позиции поддающиеся маркировки на рецептором неизвестной структуры, CCR5. Это осуществляется с помощью целевой мечения стратегию пептид-антигенной детерминанты, которая опирается на bioorthogonal модификации вариантов AZF-ХВГФ в формате полу-высокой пропускной основе клеток. 30 ЭтоМетод основан на использовании свойств обнаружения многоступенчатой из клеточной поверхности ELISA для контроля маркировки события.
Методологии мы обсуждаем здесь носят общий характер и в принципе может быть применен к любой GPCR объединена с AZF помощью янтаря кодонов технологией подавления. В протоколах, представленных здесь мы подробно шаги, участвующие в млекопитающих выражения клеток рецепторов, включенных с УААН, таких как AZF использованием неестественный метод мутагенеза аминокислот и их последующие заявки для облегчения структурные и динамические исследования GPCRs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Сайт-специфическая генетическая Включение неприродных аминокислот в GPCRs
- Поддержание HEK293T клеток в DMEM (4,5 г / л глюкозы, 2 мМ глутамина) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) при 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы.
- Трансфекции клеток, выращенных в 60-80% слияния в 10-см пластины, используя Липофектамин Plus реагента.
- Для 750 мкл DMEM, добавить 10 мкл Плюс реагента, 3,5 мкг GPCR кДНК (pMT4. Rho или pcDNA 3.1. CCR5), содержащие янтарную стоп-кодон в желаемом положении, 3,5 мкг супрессора тРНК кДНК (pSVB.Yam) и 0,35 мкг мутантного амино-ацил тРНК синтетазы кДНК р-азидо-L-фенилаланина (pcDNA.RS). Инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин. Также выполняют аналогичную трансфекции с использованием мас GPCR кДНК (не содержащий янтарную стоп-кодон), чтобы служить в качестве контроля. Добавить эту смесь к 750 мкл DMEM с 17 мкл Lipofectamine. После уравновешивания 15 мин при комнатной температуре, довестиОбщий объем до 4 мл.
- Аспирируйте СМИ на 10-см пластины, распространяются трансфекции смесь к клеткам, и вернуться к 37 ° С в 5% CO 2 атмосферы. После 4-6 ч, дополнить клеток с 4 мл среды DMEM, содержащей 20% FBS и 1 мМ AZF.
- На следующий день, замените СМИ роста с DMEM, содержащей 10% FBS и 0,5 мМ AZF.
- Урожай клеток 48 ч после трансфекции, проанализировать выражение или перейти к фотосшивки или маркировки процедур, описанных в следующих разделах.
- Подтверждение экспрессии мутантного янтарного GPCR в присутствии UAA в ростовой среде. Мы делаем это, Западной иммуноблоттинге обнаружения. Lyse осадок клеток в 1% (вес / объем) додецил-β-D-мальтозид (DDM) в 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ NaCl в течение 1 часа при 4 ° С. Центрифуга лизата при 16000 х г и решить супернатант в восстанавливающих условиях с помощью SDS-PAGE. Переход к PVDF мембрану и провести анализ иммуноблот для обнаружения экспрессии рецептора полнометражный помощью тыс.е 1D4 мАт (Национальный Cell Culture Center), который распознает эпитоп инженерии на С-конце рецептора. 31
2. Отображение сайт связывания лиганда с помощью целевой фотосшивки
- 48 ч после трансфекции, аспирации носители из клеток и заменить 4 мл 1х забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS). Возврат до 37 ° С в течение 15 мин.
- Ресуспендируют клеток с 1x PBS и передачи в трубки Сокол. Центрифуге при 1500 оборотах в минуту в течение 2 минут для осаждения клеток и аспирации супернатант.
- Ресуспендируют осадок клеток в 1X Хэнка забуференном солевом растворе, содержащем 20 мМ HEPES, рН 7,5, 0,2% БСА и тритием лиганда при концентрации насыщения связывания для требуемого периода времени и температуры, чтобы обеспечить рецептор-лиганд образование.
- Передача клеточной суспензии в 24-луночный или 96-луночный планшет для фотоактивации в AZF при 365 нм (например, использовать УФ-лампой) в течение 15 мин при 4 ° С. Maintaiн пластина на льду, чтобы избежать образец отопление и лизис клеток.
- Передача клеток в пробирку Эппендорфа, центрифуге для осаждения клеток, удалить супернатант и перейти к анализу. Гранулы можно хранить при -20 ° С для последующего использования.
- Ресуспендируют клеточный пеллет в буфере для лизиса, содержащего 1% (вес / объем) DDM, 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5 и ингибиторы протеаз. После 1-часовой инкубации при 4 ° С, центрифуге клеточного лизата течение 10 мин при 16000 х г и перенести супернатант в новую пробирку.
- Добавить 1D4 мАт-Sepharose 2B смолы к надосадочной жидкости и инкубируют в течение ночи при 4 ° С в immunopurify на GPCR с помощью инженерии С-концевой эпитоп 1D4 мАт. На следующий день Вымойте бисером несколько раз буфером для лизиса. Образцы элюируют 1% SDS при 37 ° С в течение 1 часа, встряхивая.
- Перенести часть элюента до 15 мл флакон, содержащий сцинтилляционной жидкости и рассчитывать на сцинтилляционном счетчике бета для определения количества специфического связывания меченого тритием лиганда к-йэ рецепторов.
- Решить оставшиеся 1D4 мАт очищенной элюент стандартными гель-электрофореза. Мы используем 4-12% геля SDS-страницы, а затем полусухого передачу в PVDF мембраны для иммуноблоттинга. Мы также переулок со стандартным белка лестнице, чтобы вести визуальное приближение молекулярного веса.
- Блокировать PVDF мембрану с помощью 5% молока в TBS буфере, содержащем 0,05% Твин-20. Зонд мембрану для подтверждения экспрессии рецептора полнометражный с 1D4 МКА последующим HRP-конъюгированного антитела против мышиного IgG вторичным антителом.
- Отнеситесь с усиленной хемилюминесценции (ECL) реагента и подвергать мембрану авторадиографии фильм визуализировать полосы.
- Разрежьте мембрану с лезвием бритвы, чтобы отделить каждый образец переулок, а затем резки в определенных маркеров молекулярной массы. Передача сегменты мембраны в пробирки, содержащие сцинтилляционной жидкости. Определения количества трития в каждом сегменте мембраны путем подсчета на бета-сцинтилл ционного счетчика.
- Определите положительныйphotocrosslink с обнаружением трития в кажущейся молекулярной массой, равной сумме, что из GPCR и лигандом.
3. Целевые Эпитоп Tagging и клеточной поверхности иммуноферментный анализ (ИФА)
- 24 часа в сутки после трансфекции, мыть клетки с 1 мл 1X PBS и Trypsinize 1 мл 0,25% трипсина в течение 3 мин. Дополнение с 9 мл DMEM, содержащей 10% FBS и 0,5 мМ AZF. Ресуспендируют клетки и подсчитать плотность клеток. Мы используем стандартный гемоцитометра.
- Предварительная обработка высокую связывания ясно, нижний-96-луночный планшет с 100 мл 0,01 мг / мл поли-D-лизина на лунку. Выдержите в течение 30 мин при комнатной температуре, мыть неоднократно с 1x PBS и воздушно-сухой.
- Тарелка 200 мкл трансфицированных клеток при плотности 6 × 10 4 - 8 х 10 4 клеток / лунку в 96-луночный планшет и вернуться к 37 ° С в 5% CO 2 атмосферы.
- На следующий день приготовить клетки для маркировки. Осторожно промыть три раза 100 мкл / лунку 1x PBS то удалять любые AZF содержащий питательной среды. Убедитесь, клетки остаются придерживался, например, с помощью ФБР, содержащим Са 2 + и Mg 2 +.
- Подготовка 50-200 мкмоль ФЛАГ-триарилфосфина маркировки реагента в 1x HBSS / PBS из запаса поддерживается на уровне 5-20 мм в PBS. Применить 60 мл в каждую лунку (в трех экземплярах для каждого мутанта янтарной) и вернуть до 37 ° С в течение 30 мин до 4 ч. Поддерживать набор скважин без лечения этикетки в 1x HBSS / PBS. Кроме того, включать контроль GPCR мас сравнить с вариантами AZF-GPCR.
- Промывают клетки 3 раза 100 мкл / лунку блокирующего буфера, BB (1X PBS, 0,5% BSA), чтобы удалить непрореагировавший этикетку полностью.
- Применить 100 мкл / лунку 4% параформальдегида (приготовленного из 16% складе в 1X PBS) к клеткам. Инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре. Промыть три раза BB.
- Выполните стандартный протокол клеточной поверхности ELISA для обнаружения надписью рецептор и экспрессии рецептора. Инкубировать с первичным антителом в течение 1,5 часа на льду с последующим вторичным ANtibody инкубации при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Добавить 100 мкл анти-FLAG M2 антитела (например, 1:2000 разбавления антител сделано в BB) для обнаружения FLAG пептида эпитоп FLAG-триарилфосфина маркировки реагента. Также зонд без ярлыка обработанных скважин в качестве отрицательного контроля. Добавить против CCR5 2D7 (мы используем разбавления 1:500) антитела к отдельным набором скважин для определения масс или клеточной поверхности выражение AZF-GPCR.
- Промывают клетки три раза BB, и инкубируют со 100 мкл HRP-конъюгированного антитела против мышиного IgG вторичного антитела (1:2000 разбавление).
- Тщательно промыть клетки в пять раз с BB. Добавить 50 мкл буфера обнаружения: Amplex Red, 20 мМ H 2 O 2, 1x PBS (соотношение 1:10:90) и инкубировать 15 минут при комнатной температуре. Сбор спектральные данные по флуоресценции многолуночном ридере на λ экс = 530 и λ ет = 590.
4. Bioorthogonal Флуоресцентная маркировка на GPCR
- Lyse10 7 Собранные клетки, экспрессирующие вес или варианты AZF-Родопсин в 1 мл солюбилизации буфера, содержащего 1% (вес / объем) DM, 50 мМ HEPES или трис-HCl, рН 6,8, 100 мМ NaCl, 1 мМ CaCl 2 и ингибиторы протеазы за 1 ч при 4 ° С. Центрифуга клеточного лизата при 15000 х г в течение 10 мин и собирают фракцию супернатанта.
- Добавить 100 мкл 1D4-МАБ сефарозной 2B смолы захватить рецептор с помощью сконструированного С конца 1D4 эпитоп. Инкубировать в течение 12 часов при 4 ° С. Промыть смолы три раза с 0,1% (вес / объем) DDM в 0,1 М натрий-фосфатного буфера, рН 7,3.
- Добавить 0,1 мМ флуоресцеином фосфина в общем объеме 0,3 - 0,5 мл на помеченной рецептор иммобилизован на иммуноаффинной матрицы (1D4-мАт сефарозы 2В). Инкубировать в течение 12 часов при комнатной температуре. Центрифуга и удалить супернатант. Вымойте смолы для удаления непрореагировавшего этикетку.
- Элюции меченого рецептора с 100 мл элюирующего буфера, содержащего 0,1% (вес / объем) DDM и 0,33 мг / мл нонапептид (С9 пептид против эпитопа 1D4)в 2 мМ фосфатного буфера, рН 6,0 путем инкубации на льду в течение 1 часа.
- Устранение меченых проб в ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. Вымойте гели кратко в PBS, а затем визуализировать маркировки AZF-GPCR по флуоресценции в геле. Например, использовать конфокальной флуоресцентной сканер с длиной волны лазера 488 нм для обнаружения рецептора модифицированный флуоресцеина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы использовали методику искусственную аминокислоту мутагенеза сайт-специфическое ввести молекулярных зондов в GPCR используя желтым кодон технологии подавления. Схема на рисунке 1 излагаются существенные шаги методологии и различные приложения включения универсальный UAA, п-азидо-L-фенилаланин (AZF), в GPCRs. Выражение AZF-GPCRs в клетках млекопитающих позволяет целевой фотосшиванию лигандов, а также целевые пептид-эпитопную тегов или люминесцентные модификации с GPCR через bioorthogonal маркировки химических.
Техника фотосшивка может быть использован для исследования структурных аспектов ХВГФ-лиганд комплексов в живых клетках (рис. 1а). Представительства данные, полученные из одного такого эксперимента приведена на рисунке 2. 19 Здесь мы использовали меченый лиганд радиоактивный низкомолекулярных, тритиированного маравирок, чтобы определить свою обязательную сидетье на CCR5. В этом примере, УФ-облучение на клетках, экспрессирующих CCR5-AZF варианты предварительно инкубировали с тритием результатов Маравирок в ковалентно поперечно-сшитыми комплексов, которые можно идентифицировать с помощью чувствительного радиоактивную метку в лиганда. Среди нескольких позиций по CCR5 испытания, I28azF и W86azF смогли photocrosslink чтобы тритием маравирока как изображено со значительно более высоким сцинтилляционных пунктам (красный баров, нижней панели, рис 2). Рецептор вес не показали сшивание до радиоактивного лиганда.
Bioorthogonal маркировки химические соединения могут быть использованы для сайта-специально изменить варианты AZF-GPCR. Мы использовали лигирующей химию Штаудингера Bertozzi маркировать два GPCRs: CCR5 и родопсина, используя производные фосфина (схема 1). Одна из стратегий заключается в целевой эпитопную маркировку на GPCR в живых клетках с помощью пептида-сопряженных метку (рис. 1b). Мы демонстрируем один такой эксперимент, в которой флаг пептидэлектронной триарилфосфин маркировка реагент используется для сайт-специфически и селективно модифицировать варианты AZF-CCR5. На рисунке 3 мы показываем репрезентативные данные от чувствительного и многоступенчатой ELISA стратегии обнаружения используется для идентификации позиции, помеченные с флагом пептида. +30 Среди позиций по CCR5 исследуемого были высказаны все варианты AZF-CCR5 на поверхности клетки (красный бары, рисунок 3) и примерно половина из них успешно прошли целевой эпитоп пометки (синие полосы, рисунок 3). вес CCR5 служил в качестве отрицательного контроля для эпитопа тегов, демонстрируемого на отсутствие анти-FLAG сигнала. В альтернативной стратегии, то меченый моюще-солюбилизированного AZF-GPCRs, иммобилизованных на иммуноаффинной матрицы, такие как анти-1D4 мАт, конъюгированных с сефарозой 2B смолы с флуорофора, конъюгированным с меткой (рис. 1в). В-гель флуоресценции изображение показано на рисунке 4 демонстрирует успешную флуоресцентныемаркировка GPCR, родопсина, в трех различных положениях, включенных с AZF по лигирования Штаудингер-Bertozzi использованием фосфина производное флуоресцеина. 29 Как и ожидалось, мас родопсина не показали фона маркировки, как показано на отсутствие флуоресцентного полосы на ожидаемое Молекулярная масса рецептора.
Схема 1. Лигирование реакции Штаудингера Bertozzi между триарилфосфина и азида с образованием стабильного амидосвязанной аддукта.
Рисунок 1. Схема, иллюстрирующая конкретным участкам включение в UAA (AZF) и его приложения к ы . Tudy GPCRs UAA сайт-специфического мутагенеза достигается путем ко-трансфекции трех отдельных плазмид в клетках млекопитающих, которые несут: развитую ортогональный амино ацил-тРНК синтетазы, специфического для UAA, ортогональной супрессорной тРНК, который распознает янтарный стоп-кодон (UAG) , и ген, кодирующий GPCR, содержащий тег мутацию в нужном положении. Клетки, выращенные в присутствии UAA выразить полнометражный GPCR с сайт-специфически введенной AZF. Эти клетки могут затем быть (а) инкубировали с лигандом и активируют УФ-светом, чтобы определить поперечные сшивки между GPCR и его лигандом, (б) используется для сайт-специфически эпитоп-тега GPCR в культуре с пептидом, конъюгированным с химической меткой, или (с) солюбилизируют, чтобы очистить GPCRs, которые затем bioorthogonally модифицированные с флуоресцентной меткой в условиях, когда рецептор иммобилизуют на антитела конъюгированного с сефарозой смолы.0588/50588fig1highres.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение
Рисунок 2. Целевые фотосшивка из GPCR к тритием лиганда. Просмотрен вот представительные результаты сшивания эксперимента между вариантами AZF-CCR5 и лиганда низкомолекулярного меченного тритием, маравирока. Верхняя панель: Западная иммуноблот генерируется после типичного эксперимента, показывая выражение тестируемых вариантов AZF-CCR5. Цветные сегменты выделить где PVDF мембрану вырезать для сцинтилляционного счета и соответствуют обнаруженных сцинтилляционных пунктам, построенных в гистограмму в нижней панели. Красный сегмент представляет ожидаемую молекулярную массу (около 40 кДа) ковалентной сшитого комплекса между рецептором и лигандом.refore, мы ожидали бы обнаружить тритий в тех сегментах только тогда, когда AZF вводится в положении, в рецепторе, который находится в непосредственной близости от лиганд-связывающий карман и может образовывать ковалентную поперечных связей с лигандом. Печатается (адаптировано) с разрешения Grünbeck, А., и др.. Генетически кодируемые фото-сшивателей карту сайта связывания аллостерического препарата на-белками рецепторы G. ACS химической биологии 7, 967-972 (2012). Copyright (2012) Американское химическое общество. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение
Рисунок 3. Обнаружение ИФА адресной эпитопной-тегов о ХВГФ Верхняя панель:. Клеточной поверхности выражение НЕК 293T челLs выражающие варианты AZF-CCR5 и WT и макет трансфицированными управления зондировали против CCR5 МКА 2D7, используя весь клеток на основе ELISA (красные полосы). Нижняя панель: Клетки из той же трансфекции обрабатывали 0,05 мМ FLAG-триарилфосфина в течение 1 часа в живых клетках, а затем количественно с помощью ELISA последующим использованием анти-FLAG M2 мАт, чтобы определить степень пептид эпитопа-меток в каждом положении (синие столбики) . Планки погрешностей представляют стандартное отклонение от среднего для двух или более наборов данных повторных. Печатается (адаптировано) с разрешения Naganathan, S., и др.. Сайт-специфическая Эпитоп мечение GPCRs на bioorthogonal модификации генетически закодированного неестественной аминокислоты Биохимия DOI:. 10.1021/bi301292h (2013). Copyright (2013) Американское химическое общество. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение
Рисунок 4. Люминесцентная маркировка родопсина AZF включены в различных положениях. Мас и AZF-родопсина мутантов иммобилизованные на иммуноаффинной матрицы, меченных флуоресцеин-фосфина. Очищенные образцы были разделены на 4-12% SDS-PAGE и флуоресценции изображение в геле показали, была сделана с помощью конфокального 488 нм лазерный сканер флуоресценции с использованием набора фильтров излучение, оптимизированный для обнаружения флуоресцеина. Рисунок заимствован из Хубер Т., и др.. Bioorthogonal маркировки функциональных G-белком в генетически кодируемых азидогруппы. представлены (2013). Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описываем здесь четкой методологии для конкретных участков включения реактивного зонда, AZF, в GPCRs и продемонстрировать три полезные применения этого инструмента для изучения структуры и динамики GPCRs. Наш метод на сайт-специфически включить УААН обходит фундаментальную проблему с альтернативной стратегии, основанной на химически маркировка 32, 33 или установке фотосшивающие 34 к одному доступной цистеина мутанта. Хотя, химические, которые нацелены на тиольных групп цистеина были использованы для присоединения флуоресцентных зондов, такой стратегии требует генерирование цистеина, свободной фоне белка. Это может быть ограничение, так как все GPCRs обладают более одного цистеин, многие из которых могут иметь важное значение для поддержания нормальной работы рецепторов. Поэтому, возможность ввести UAA то, что поддается химической модификации или может быть активирован с помощью УФ-света является очень привлекательным.
Реакционную ковалентное фотoactivatable сшиватель с молекулой-мишенью зависит от расстояния и соседних боковых цепей. Таким образом, эти зонды могут быть использованы в определении взаимодействий, которые находятся в пределах определенного расстояния от сшивающего агента, например, бензофенон-сшивающие агенты на основе предложены иметь зависимость расстояния 3 Å. 35 Ранее мы представили как Azf и BZF, в UAA содержащий бензофенона реактивную группу, для выявления остатков в GPCR, которые в течение определенного расстояния от флуоресцеина или трития меченого лиганда. 18, 19 общей применимости этой технологии зависит только от наличия таких меченых лигандов и генерации янтаря мутантов целевого GPCR. Кроме того, в теории это целевой метод фотосшивка может быть применен для определения взаимодействия между GPCR, и их другими партнерами связывания, таких как белок G или β-аррестина. Данные, полученные от этих сшивающих исследований могут быть использованы для создания более точной меслекулярные модели GPCR сигнализации комплексов.
Несколько bioorthogonal химические реакции были описаны в литературе, которые позволяют для сайт-специфической модификации UAA остатков. УАА, ACF, например, обладает группа кето, которые могут принимать участие в гидразона или оксим лигирования реакций. 36, 37 Ранее мы сравнили модификации кетогруппы и азидогруппы с биотинилированных и флуоресцеина конъюгированных реагентов. 29 Наши наблюдения показали, что азидо группа AZF это действительно больше, bioorthogonal чем его кето коллегой. Таким образом, мы впоследствии сосредоточены на использовании лигирования Штаудингер-Bertozzi изменить два GPCRs с пептид эпитопа тега или флуоресцентной меткой. Следует отметить, однако, что лигирование Штаудингер-Bertozzi обладает суб-стехиометрических 38 и плохие кинетические свойства маркировки. Кроме того, фосфины сильно подвержены окислению на воздухе. 25 Мы обнаружили, что Штаудингера Будьтеrtozzi перевязки только достигает 30% маркировку после инкубации в течение 12 ч при комнатной температуре. 29 По этим причинам, мы в настоящее время оцениваем альтернативные маркировки химии, такие как CuAAC и SpAAC на сайт-специфически маркировать AZF-GPCRs.
Хотя и недостатков лигирования реакций Штаудингера Bertozzi, мы демонстрируем здесь использование пептид-эпитопной мечения стратегии живых клеток для выявления позиции на целевой GPCR, которые доступны для будущего флуоресцентного маркировки. Кроме того, этот Эпитоп стратегия пометки имеет множество других полезных приложений, таких как, введением эпитопной меткой на одной модифицированного звена в отличие от вставки всю эпитоп, заменив родные последовательности. Эта функция имеет особое значение с GPCRs с изменения длины и последовательность высоко консервативных сегментов цикла может резко изменить функцию. Наконец, мы также показано здесь доказательство правильности концепции эксперименты маркировать GPCRs флуорофорами, макороль их пригодными для экспериментов обнаружения одиночных молекул.
В заключение, AZF является универсальным инструментом для изучения структуры и функции GPCRs. Мы показали, что AZF является сайт-специфически включены в GPCRs, выраженных в клетках млекопитающих с использованием янтаря кодон системы подавления. Это дает возможность модификации GPCR только в одной единственной позиции. Структура и функции меченого рецептора затем могут быть оценены либо в нативной плазматической мембраны, окружающей среды или в растворе моющего средства. Мы сейчас готова расследовать GPCR комплексы сигнализации с гибкостью зонда AZF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим щедрую поддержку нескольких фондов и благотворительных доноров (см. SakmarLab.org).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid pSVB. Yam | (Ye et al., 2008) | ||
| Plasmid pcDNA.RS for azF | (Ye et al., 2009) | ||
| Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5 | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position | ||
| HEK 293T cells | Adherent cells | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 10566 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14200 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Lipofectamine Plus | Invitrogen | Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015 |
|
| p-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | 6162 | |
| Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials | |||
| Maxima ML-3500S UV-A lamp | Spectronics Corporation | azF is activated by 365-nm light | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14065 | |
| HEPES | Irvine Scientific | 9319 | |
| Bovine serum albumin | Roche | 3117405001 | |
| Tritium-labeled ligand | From collaborator (Grunbeck et al., 2012) | ||
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| 1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166 | |
| NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Trans-Blot SD apparatus | Biorad | Apparatus for semi-dry transfer | |
| Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Non-fat powered milk | Fisher Scientific | NC9934262 | |
| Tween-20 | Aldrich | 274348 | |
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | Scintillation fluid |
| Scintillation vials | Fisher Scientific | 333726 | |
| LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter | Perkin Elmer | Beta-Scintillation counter | |
| Anti-rhodopsin 1D4 mAb | National Cell Culture Center | custom | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG | KPL, Inc. | 474-1806 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
| Hyblot CL AR film | Denville | E3018 | |
| Table 2. Targeted photocrosslinking materials | |||
| 0.25% Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
| FLAG-triarylphosphine | Sigma | GPHOS1 | |
| M2 FLAG mAb | Sigma | F1804 | |
| anti-CCR5 2D7 mAb | BD Biosciences | 555990 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| 96-well plate | Costar | 3601 | Clear bottom, high binding EIA/RIA |
| Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium) | Gibco | 14040 | |
| 16% Paraformaldehyde | EMS | 28908 | |
| HRP-conjugated | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| anti-rabbit IgG | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 | |
| Hydrogen peroxide | DE Healthcare Products | 97-93399 | |
| CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader | Perseptive Biosystems | ||
| Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials | |||
| Fluorescein-phosphine | (Huber et al., submitted 2012) | ||
| Nonapeptide (C9 peptide) | AnaSpec | 62190 | Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH |
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner | GE Healthcare | discontinued | Scanner with 488-nm wavelength laser |
| Table 4. Fluorescent labeling materials |
References
- Huber, T., Menon, S., Sakmar, T. P. Structural basis for ligand binding and specificity in adrenergic receptors: Implications for GPCR-targeted drug discovery. Biochemistry. 47, 11013-11023 (2008).
- Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current opinion in structural biology. 21, 567-572 (2011).
- Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Wu, B., et al. Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists. Science. 330, 1066-1071 (2010).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301, 964-967 (2003).
- Ye, S., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. The Journal of biological chemistry. 283, 1525-1533 (2008).
- Ye, S., Huber, T., Vogel, R., Sakmar, T. P. FTIR analysis of GPCR activation using azido probes. Nature chemical biology. 5, 397-399 (2009).
- Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464, 1386-1389 (2010).
- Singh, A., Thornton, E. R., Westheimer, F. H. The photolysis of diazoacetylchymotrypsin. The Journal of biological chemistry. 237, 3006-3008 (1962).
- Nakayama, T. A., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bovine rhodopsin determined by cross-linking using a photoactivatable analog of 11-cis-retinal. The Journal of biological chemistry. 265, 15762-15769 (1990).
- Chen, Q., Pinon, D. I., Miller, L. J., Dong, M. Molecular basis of glucagon-like peptide 1 docking to its intact receptor studied with carboxyl-terminal photolabile probes. The Journal of biological chemistry. 284, 34135-34144 (2009).
- Huang, K. S., Radhakrishnan, R., Bayley, H., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bacteriorhodopsin as studied by cross-linking using a photosensitive analog of retinal. The Journal of biological chemistry. 257, 13616-13623 (1982).
- Zoffmann, S., Turcatti, G., Galzi, J., Dahl, M., Chollet, A. Synthesis and characterization of fluorescent and photoactivatable MIP-1alpha ligands and interactions with chemokine receptors CCR1 and CCR5. Journal of medicinal chemistry. 44, 215-222 (2001).
- Janz, J. M., et al. Direct interaction between an allosteric agonist pepducin and the chemokine receptor CXCR4. Journal of the American Chemical Society. 133, 15878-15881 (2011).
- Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11020-11024 (2002).
- Hino, N., et al. Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid. Nature. 2, 201-206 (2005).
- Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50, 3411-3413 (2011).
- Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS chemical biology. 7, 967-972 (2012).
- Dunham, T. D., Farrens, D. L. Conformational changes in rhodopsin. Movement of helix f detected by site-specific chemical labeling and fluorescence spectroscopy. The Journal of biological chemistry. 274, 1683-1690 (1999).
- Maurel, D., et al. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nature. 5, 561-567 (2008).
- Huber, T., Sakmar, T. P. Escaping the flatlands: new approaches for studying the dynamic assembly and activation of GPCR signaling complexes. Trends in pharmacological sciences. 32, 410-419 (2011).
- Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
- Kiick, K. L., Saxon, E., Tirrell, D. A., Bertozzi, C. R. Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 19-24 (2002).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted [3 + 2] azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems. Journal of the American Chemical Society. 126, 15046-15047 (2004).
- Kolb, H. C., Sharpless, K. B. The growing impact of click chemistry on drug discovery. Drug discovery today. 8, 1128-1137 (2003).
- Huber, T., Botelho, A. V., Beyer, K., Brown, M. F. Membrane Model for the G-Protein-Coupled Receptor Rhodopsin: Hydrophobic Interface and Dynamical Structure. Biophys. J. 84, 2078-2100 (2004).
- Okada, T., et al. The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 Å crystal structure. J. Mol. Biol. 342, 571-583 (2004).
- Huber, T., Tian, H., Ye, S., Naganathan, S., Kazmi, M. A., Duarte, T., Sakmar, T. P. Bioorthogonal labeling of functional G protein-coupled receptors at genetically encoded azido groups. , submitted (2013).
- Naganathan, S., Ye, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Site-specific epitope tagging of GPCRs by bioorthogonal modification of a genetically-encoded unnatural amino acid. Biochemistry. , (2013).
- Molday, R. S., MacKenzie, D. Monoclonal antibodies to rhodopsin: characterization, cross-reactivity, and application as structural probes. Biochemistry. 22, 653-660 (1983).
- Gether, U., et al. Agonists induce conformational changes in transmembrane domains III and VI of the beta2 adrenoceptor. The EMBO journal. 16, 6737-6747 (1997).
- Hubbell, W. L., Altenbach, C., Hubbell, C. M., Khorana, H. G. Rhodopsin structure, dynamics, and activation: A perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking. Advances in Protein Chemistry; Membrane Proteins. 63, 243-290 (2003).
- Cai, K., Itoh, Y., Khorana, H. G. Mapping of contact sites in complex formation between transducin and light-activated rhodopsin by covalent crosslinking: use of a photoactivatable reagent. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4877-4882 (2001).
- Dorman, G., Prestwich, G. D. Benzophenone photophores in biochemistry. Biochemistry. 33, 5661-5673 (1994).
- Zhang, Z., et al. A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo. Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).
- Dirksen, A., Hackeng, T. M., Dawson, P. E. Nucleophilic catalysis of oxime ligation. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7581-7584 (2006).
- Yanagisawa, T., et al. Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification. Chemistry & biology. 15, 1187-1197 (2008).
