Summary
We genetisch coderen natuurlijk aminozuur, p-azido-L-fenylalanine op verschillende gerichte posities in GPCRs en tonen de veelzijdigheid van de azidogroep in verschillende toepassingen. Deze omvatten een gerichte fotoverknoping technologie om resten in de ligand-bindingsplaats van een GPCR te identificeren, en de site-specifieke bioorthogonal modificatie van GPCR's met een peptide-epitoopmerker of fluorescente probe.
Abstract
Structurele en dynamische studies van G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR) signalering complexen te vergemakkelijken, zijn nieuwe benaderingen nodig zijn om informatieve probes of labels introduceren in uitgedrukt receptoren die geen receptor functie niet verstoren. We gebruikten amber codon suppressie technologie genetisch coderen van het niet-natuurlijke aminozuur, p-azido-L-fenylalanine (azf) bij verschillende gerichte posities in GPCRs heteroloog tot expressie gebracht in zoogdiercellen. De veelzijdigheid van de azidogroep is hier weergegeven in verschillende toepassingen GPCR bestuderen in hun natieve cellulaire omgeving of in detergens gesolubiliseerde omstandigheden. Ten eerste tonen we een cel-gebaseerde gerichte fotoverknoping technologie aan de residuen in de ligand-bindingsplaats van GPCR wanneer een tritium-gelabeld kleine moleculen ligand verknoopt een genetisch gecodeerd aminozuur azido identificeren. We tonen dan plaatsspecifieke modificatie van GPCR's door de bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligatie reactiestie dat de azidogroep richt met behulp van fosfine derivaten. We bespreken een algemene strategie voor gerichte peptide-epitoop tagging van uitgedrukt membraaneiwitten in-cultuur en de detectie met behulp van een whole-cell-gebaseerde ELISA aanpak. Tot slot laten we AZF-GPCR selectief kan worden gelabeld met fluorescente probes. De methoden besproken algemeen, aangezien zij kunnen in beginsel worden toegepast op elk aminozuur positie in een GPCR tot expressie actieve signalering complexen ondervragen.
Introduction
Heptahelical G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCR's) omvatten een superfamilie van zeer dynamische membraaneiwitten die belangrijk en diverse extracellulaire signalen mediëren. In het klassieke paradigma wordt receptoractivering gekoppeld ligand geïnduceerde conformatieveranderingen. 1, 2 hebben recente ontwikkelingen in de structurele biologie van GPCRs belangrijke inzicht in de moleculaire mechanismen van transmembraan signalering ontvangen. 3-5 echter te begrijpen met een grotere nauwkeurigheid de chemische werkingsmechanisme en structurele dynamica van GPCR-signalering, is een toolkit van benaderingen nodig zijn om informatieve moleculaire en chemische probes te nemen aan actieve signalering complexen ondervragen.
Daarom passen wij een methode om plaatsspecifiek voeren niet of minimaal storende sondes in expressie receptoren gebaseerd op natuurlijk aminozuur (UAA) mutagenese met amber codon suppressie technologie eerder ontwikkeld door Schultz en coworkers. 6 We geoptimaliseerd de UAA mutagenese methode om een high-yield expressie en mutagenesesysteem voor eiwitten zoals GPCR's, die moeilijk uit te drukken in een andere dan de zoogdiercellen meeste heterologe systemen zijn te bereiken. Met behulp van een orthogonale gemanipuleerde suppressor tRNA en evolueerde aminoacyl-tRNA synthetase paar voor een specifiek UAA, we plaatsspecifiek geïntroduceerd UAAs in uitgedrukt doel GPCR's. De succesvolle integratie van UAAs, p-acetyl-L-fenylalanine (ACF), p-benzoyl-L-fenylalanine (BZF), en p-azido-L-fenylalanine (azf) is aangetoond in ons model GPCRs - rhodopsine en menselijke CC chemokine receptor CCR5. 7, 8
In beginsel kan een UAA genetisch gecodeerd op elke positie in het eiwit sequentie en deze woning is een waardevol biochemische instrument omdat het zorgt voor single-codon scannen van een doel GPCR. We richten ons hier specifiek op de veelzijdigheid van de UAA, AZF, die een reactieve Azi heeftdo groep. Naast het dienen als een uniek infrarood (IR) sensor, 8, 9 azf kan ook dienen als een fotoactiveerbare verknoper door reactie met naburige primaire aminen of alifatische waterstofatomen. Bovendien kan het biologisch inerte azidogroep nemen als een selectief chemisch handvat bioorthogonal labelingsreacties. Hier laten we voorbeelden illustreren de nuttige toepassingen van plaats-specifieke incorporatie van AZF in GPCRs, zoals gerichte fotoverknoping te controleren een receptor-ligand-complex en modificatie van GPCR door bioorthogonal epitoop tagging en fluorescente labeling strategieën.
Fotoactiveerbare reagentia zijn gebruikt om biologische systemen te bestuderen sinds 1960. 10 In deze periode zijn een overvloed aan receptor-ligand verknoping experimenten gerapporteerd dat GPCR complexen studie, waarvan de meeste betrekking het gebruik van foto-affiniteit liganden. 11, 12 Echter, deze toepassingen zijn technisch beperkt, aangezien zij require synthese van liganden richting een verknopende groep. 13-15 bovendien de crosslinker deel in het ligand, is het een uitdaging om de locatie van de verknoping bepalen de GPCR. Plaatsspecifiek introduceren fotoverknopende groepen UAAs in eiwitten met het amber codon onderdrukking technologie is een waardevolle vooruitgang. 16 17 We ontwikkelden een fotoverknoping techniek om de binding interface op een receptor die betrokken is bij de vorming van een receptor-ligand-complex te identificeren levende cellen door de invoering fotolabiele groepen in GPCR's. 18, 19 Hier beschrijven we de experimentele protocol en de wijze van data-analyse voor de toepassing van deze gerichte fotoverknoping technologie om de bindingsplaats van een klein-molecule ligand, tritiumhoudend maraviroc, op CCR5 identificeren. Deze werkwijze in op de precieze kwantificering van de radioactieve handvat op het ligand, naast behoud van de natuurlijke chemische structuur van het ligand.
Fluorescentie-gebaseerde technieken ondersteunen juist begrip van de structurele basis van receptoractivering door direct sonderen van de conformationele toestand van de receptor. 20, 21 echter technieken bezit de flexibiliteit om fluorescerende labels introduceren in GPCRs plaatsspecifiek beperkt. Wij zijn geïnteresseerd in het gebruik van bioorthogonal chemische modificatie strategieën om single-molecule detectie (SMD) van GPCR signalering complexen te vergemakkelijken. 22 De azidogroep kan deelnemen aan bioorthogonal chemicaliën zoals Staudinger-Bertozzi ligatie, 23, 24 kopervrije-stam bevorderd azide- alkyne cycloadditie (SpAAC) 25 en-koper-gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie (CuAAC). 26 Wij richten ons hier op de Staudinger-Bertozzi ligatie reactie die de specifieke reactie tussen een azide en een fosfine gaat. We demonstreren het gebruik van twee verschillende fosfine derivaten geconjugeerd aan een peptide epitoop (FLAG peptide) of een fluorescerend label(Fluoresceïne) naar plaatsspecifieke modificatie van GPCR's te bereiken.
We hebben eerder geoptimaliseerd voorwaarden voor plaats-specifieke labeling van rhodopsine AZF varianten met de röntgenbron kristalstructuur en dynamische simulaties doelplaatsen die aan oplosmiddel blootgestelde zijn kiezen. 27 28 We geïllustreerd tevens de mogelijkheid om zonder achtergrond labeling bereiken door Staudinger- Bertozzi ligatie. 29 We tonen hier de algemene procedure gebruikt voor fluorescente labeling van een detergens gesolubiliseerde receptor die is geïmmobiliseerd op een matrix immuno vervolgens gevisualiseerd door in-gel fluorescentie bereiken. Daarnaast tonen we een nuttige uitbreiding op deze etikettering strategie om posities ontvankelijk voor etikettering op een receptor van onbekende structuur, CCR5 identificeren. Dit wordt uitgevoerd met een gerichte peptide-epitoop tagging strategie die is gebaseerd op bioorthogonal modificatie van AZF-GPCR varianten in een celgebaseerde semi-high throughput format. 30 Ditmethode maakt gebruik van de multi-step detectie eigenschappen van een cel-oppervlak ELISA etikettering gebeurtenissen volgen.
De methoden die we hier besproken zijn algemeen en kunnen in principe worden toegepast op elk GPCR opgenomen met AZF met het amber codon onderdrukking technologie. In de hier gepresenteerde gedetailleerde weergave van de stappen die in zoogdiercellen expressie van receptoren opgenomen met UAAs zoals AZF met het onnatuurlijke aminozuur mutagenese werkwijze en de latere toepassingen structurele en dynamische studies van GPCRs vergemakkelijken protocollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Site-specifieke genetische Oprichting van natuurlijke aminozuren in GPCR
- Handhaaf HEK293T cellen in DMEM (4,5 g / l glucose, 2 mM glutamine), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer.
- Transfecteren de cellen gekweekt tot 60-80% confluentie in een 10 cm plaat met behulp van Lipofectamine Plus reagens.
- Aan 750 ul DMEM, voeg 10 ul Plus reagens, 3,5 ug GPCR cDNA (pMT4. Rho of pcDNA 3.1. CCR5) bevattende amber stopcodon op een gewenste positie, 3,5 ug tRNA cDNA (pSVB.Yam) en 0,35 ug van mutante amino-acyl tRNA synthetase cDNA voor p-azido-L-fenylalanine (pcDNA.RS). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Ook voeren soortgelijke transfectie met de wt GPCR cDNA (een amber stopcodon bevatten) dienen als controle. Voeg dit mengsel aan 750 ul DMEM met 17 ul lipofectamine. Na equilibreren 15 minuten bij kamertemperatuur, breng detotale volume 4 ml.
- Zuig media 10-cm plaat, gelden transfectie mengsel aan cellen en terug naar 37 ° C in 5% CO2 atmosfeer. Na 4-6 uur, vullen cellen met 4 ml DMEM met 20% FBS en 1 mM azf.
- De volgende dag, vervang de groeimedia met DMEM met 10% FBS en 0,5 mM AZF.
- Oogst cellen 48 uur na transfectie, om uitdrukking te analyseren of zich naar fotoverknoping of etikettering procedures in de volgende paragrafen beschreven.
- Bevestig expressie van de GPCR amber mutant in aanwezigheid van de UAA van de groeimedia. We doen dit door Westerse immunoblot detectie. Lyse de celpellet in 1% (w / v) dodecyl-β-D-maltoside (DDM) in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl gedurende 1 uur bij 4 ° C. Centrifugeer het lysaat bij 16.000 xg en de supernatant oplossing onder reducerende omstandigheden door SDS-PAGE. Transfer naar een PVDF membraan en uitvoeren immunoblotanalyse volledige lengte receptor expressie te detecteren met behulp van ee 1D4 mAb (Nationale Cell Culture Center), die een aangelegde epitoop aan het C-uiteinde van de receptor herkent. 31
2. Het toewijzen van een ligandbindingsplaats Met behulp van gerichte fotoverknopende
- 48 uur na transfectie, zuig media uit cellen en vervangen door 4 ml 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Terug naar 37 ° C gedurende 15 minuten.
- Resuspendeer de cellen met 1 x PBS en overbrengen in een Falcon buis. Centrifugeer bij 1.500 rpm gedurende 2 minuten om de cellen te pelleteren en zuig de supernatant.
- Resuspendeer de celpellet in 1x Hank's gebufferde zoutoplossing bevattende 20 mM HEPES, pH 7,5, 0,2% BSA en getritieerd ligand binding aan verzadigende concentratie de vereiste tijd en temperatuur receptor-ligand complexvorming te waarborgen.
- Breng de celsuspensie op een 24-well of 96-well plaat voor fotoactivatie van de AZF bij 365 nm (bijv. gebruik van een UV-A lamp) gedurende 15 min bij 4 ° C. Maintain de plaat op het ijs om te voorkomen dat monster verwarming en cellysis.
- Breng de cellen aan een Eppendorf buis, centrifuge de cellen neer te slaan, de bovenstaande vloeistof en overgaan tot analyse. De pellets kunnen worden bewaard bij -20 ° C voor toekomstig gebruik.
- Resuspendeer de celpellets in lysisbuffer die 1% (w / v) DDM, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 en proteaseremmers. Na 1 uur incubatie bij 4 ° C, centrifugeer het cellysaat gedurende 10 minuten bij 16.000 xg en breng het supernatant naar een nieuwe buis.
- Add mAb 1D4-Sepharose 2B hars aan het supernatant en incubeer overnacht bij 4 ° C aan de GPCR op immunologische met de gemanipuleerde C-terminus mAb 1D4 epitoop. De volgende dag was de kralen meerdere malen met lysisbuffer. Elueer monsters met 1% SDS bij 37 ° C gedurende 1 uur onder schudden.
- Breng een gedeelte van de elutievloeistof een 15 ml flacon met scintillatievloeistof en tellen op een beta-scintillatieteller om de hoeveelheid specifieke binding van getritieerd ligand kwantificeren ee receptor.
- Het oplossen van de resterende 1D4 mAb gezuiverd eluens door standaard gel-elektroforese. We gebruiken een 4-12% SDS-PAGE gel en vervolgens semi-droge overdracht naar een PVDF membraan voor immunoblotting. We hebben ook een laan met standaard eiwit ladder naar visuele aanpassing van moleculair gewicht te begeleiden.
- Blokkeer de PVDF membraan met 5% melk in TBS buffer die 0,05% Tween-20. Probe het membraan volledige lengte receptor expressie te bevestigen met mAb 1D4 gevolgd door HRP-geconjugeerd anti-muis IgG secundair antilichaam.
- Behandel met verbeterde chemiluminescentie (ECL) reagens en bloot membraan film autoradiografie om bands te visualiseren.
- Knip het membraan met een scheermesje aan elk monster laan scheiden, gevolgd door het snijden op bepaalde molecuulgewicht merkers. Transfer membraan segmenten flesjes met scintillatievloeistof. Kwantificeren van de hoeveelheid tritium in elk membraan segment door te tellen op een beta-scintillatieteller.
- Identificeer de positievephotocrosslink de detectie van tritium in de schijnbare molecuulmassa gelijk aan de som van dat van de GPCR en de ligand.
3. Gerichte Epitoop Tagging en celoppervlak Enzymgekoppelde Immunosorbent Assay (ELISA)
- 24 uur na transfectie, was cellen met 1x PBS en 1 ml trypsinize met 1 ml 0,25% trypsine gedurende 3 minuten. Aan te vullen met 9 ml DMEM met 10% FBS en 0,5 mM AZF. Resuspendeer cellen en tel de celdichtheid. We maken gebruik van een standaard hemocytometer.
- Pre-behandeling van een hoog-bindende, heldere bodem 96-well plaat met 100 ml 0,01 mg / ml poly-D-lysine per putje. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur herhaaldelijk wassen met 1 x PBS en drogen.
- Plaat 200 ul van de getransfecteerde cellen bij een dichtheid van 6 x 04-08 oktober x 10 4 cellen / putje aan de 96-well plaat en terug naar 37 ° C in 5% CO2 atmosfeer.
- Volgende dag voor te bereiden cellen voor etikettering. Was voorzichtig drie keer met 100 pl / well 1x PBS to verwijder AZF met groeimedia. Zorg cellen blijven gehecht, bijvoorbeeld door PBS dat Ca2 + en Mg2 +.
- Bereid 50-200 uM FLAG-triarylfosfine labelingsreagens in 1x HBSS / PBS uit een voorraad gehandhaafd op 5-20 mM in PBS. Breng 60 ml aan elk putje (in drievoud voor elke amber mutant) en terugkeer naar 37 ° C gedurende 30 minuten tot 4 uur. Handhaven van een reeks putten zonder label behandeling in 1x HBSS / PBS. Ook een gew GPCR controle te vergelijken met AZF-GPCR varianten.
- Was de cellen 3 maal met 100 ul / putje blokkerende buffer, BB (1x PBS, 0,5% BSA), om niet-omgezette label volledig te verwijderen.
- Breng 100 ul / putje van 4% paraformaldehyde (bereid uit een 16% voorraad in 1x PBS) aan de cellen. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Was driemaal uit met BB.
- Voer standaard celoppervlak ELISA-protocol om het label receptor en receptor expressie te detecteren. Incubeer met primair antilichaam gedurende 1,5 uur op het ijs gevolgd door secundaire eentibody incubatie bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Voeg 100 ul van anti-FLAG M2 antilichaam (bijv. 1:2000 verdunning van antilichamen in BB) tot FLAG-peptide epitoop van de FLAG-triarylfosfine labelingsreagens detecteren. Ook probe niet-behandelde putjes label als een negatieve controle. Voeg anti-CCR5 2D7 (we gebruiken een 1:500 verdunning) antilichaam aan een aparte reeks putten om te bepalen gew of AZF-GPCR expressie op het celoppervlak.
- Was de cellen drie maal met BB en incubeer met 100 ul HRP-geconjugeerd anti-muis IgG secundair antilichaam (1:2000 verdunning).
- Wassen zorgvuldig cellen vijf keer met BB. Voeg 50 ul buffer detectie: Amplex Red, 20 mM H 2 O 2, 1x PBS (1:10:90 verhouding) en incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur. Verzamel spectrale gegevens op fluorescentie multi-well plaatlezer bij λ = 530 af en λ em = 590.
4. Bioorthogonal Fluorescerende Labeling van een GPCR
- Lyse10 7 geoogste cellen die wt of AZF-Rhodopsin varianten in 1 ml solubilisatie-buffer bevattende 1% (w / v) DM, 50 mM HEPES en Tris-HCl, pH 6,8, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2 en proteaseremmers 1 uur bij 4 ° C. Centrifugeer het cellysaat bij 15.000 xg gedurende 10 minuten en verzamel de supernatant fractie.
- Voeg 100 ul 1D4-mAb sepharose 2B hars receptor vast te leggen met behulp van de gemanipuleerde C terminus 1D4 epitoop. Incubeer 12 uur bij 4 ° C. Was de hars driemaal met 0,1% (w / v) DDM in 0,1 M natriumfosfaatbuffer, pH 7,3.
- Voeg 0,1 mM fluoresceïne-fosfine in een totaal volume van 0,3-0,5 ml receptor geïmmobiliseerd op de immuno matrix (1D4-mAb Sepharose 2B) label. Incubeer 12 uur bij kamertemperatuur geroerd. Centrifuge en verwijder supernatant. Was de hars gereageerde label te verwijderen.
- Elueer het gemerkte receptor met 100 ml elutiebuffer die 0,1% (w / v) DDM en 0,33 mg / ml nonapeptide (C9 peptide tegen de epitoop 1D4)in 2 mM fosfaatbuffer, pH 6,0 door incubatie op ijs gedurende 1 uur.
- Los gelabelde monsters met SDS-PAGE onder reducerende omstandigheden. Wassen gels kort in PBS en vervolgens visualiseren etikettering van AZF-GPCR door in-gel fluorescentie. Gebruik bijvoorbeeld een confocale fluorescentie-scanner met een 488-nm laser om receptor gemodificeerd met fluoresceïne detecteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We gebruikten het onnatuurlijke aminozuur mutagenese methode voor plaatsspecifiek moleculaire probes introduceren in een GPCR volgens de amber codon onderdrukking technologie. De regeling in Figuur 1 schetst de voornaamste stappen van de methodologie en de verschillende toepassingen van het opnemen van de veelzijdige UAA, p-azido-L-fenylalanine (AZF), in GPCR's. Expressie van AZF-GPCR's in zoogdiercellen maakt het mogelijk gerichte fotoverknoping aan liganden, en gerichte peptide-epitoop tagging of fluorescerende modificaties van een GPCR via bioorthogonal etikettering chemie.
De fotoverknoping techniek kan worden gebruikt om de structurele aspecten van GPCR-ligand complexen in levende cellen (figuur 1a) onderzoeken. Representatieve gegevens van een dergelijk experiment wordt getoond in figuur 2. 19 Hier gebruikten we een radioactief gemerkte klein-molecuul ligand, getritieerd maraviroc, zijn binding zitten identificerene op CCR5. In dit voorbeeld, UV bestraling op cellen die CCR5 AZF-varianten gepreïncubeerd met getritieerd maraviroc leidt tot covalent verknoopte complexen die kunnen worden geïdentificeerd met de gevoelige radioactieve tag op het ligand. Onder de verschillende posities op CCR5 getest I28azF en W86azF konden photocrosslink aan getritieerd maraviroc zoals afgebeeld met aanzienlijk hogere scintillatie tellen (rode balken, onderste paneel, Figuur 2). Het gew receptor toonde geen verknoping op de radioactieve ligand.
Bioorthogonal etikettering chemie worden gebruikt om plaatsspecifiek AZF-GPCR varianten wijzigen. We gebruikten de Staudinger-Bertozzi ligatie chemie twee GPCR's te labelen: CCR5 en rhodopsin gebruik fosfine derivaten (schema 1). Een strategie is de gerichte epitoop tagging van een GPCR in levende cellen met behulp van een peptide-geconjugeerd label (Figuur 1b). We tonen een dergelijk experiment waarbij een FLAG peptide-triarylfosfine labeling reagens wordt gebruikt om de site-specifiek en AZF-CCR5 varianten selectief te wijzigen. In figuur 3 representatieve gegevens van een gevoelige en multi-staps-ELISA detectie strategie gebruikt om posities die zijn gelabeld met de FLAG-peptide. 30 Onder de posities op CCR5 onderzocht aangeeft wat we werden alle AZF-varianten CCR5 expressie op het celoppervlak (rode bars, Figuur 3) en ongeveer de helft van hen met succes onderging gerichte epitoop tagging (blauwe balken, figuur 3). wt CCR5 diende als een negatieve controle voor epitoop tagging, vertoond door het gebrek aan anti-FLAG signaal. In een alternatieve strategie, we afwasmiddel-gesolubiliseerde AZF-GPCR geïmmobiliseerd op een immuno matrix, zoals anti-1D4 mAb geconjugeerd aan Sepharose 2B hars, met een fluorofoor geconjugeerd label (figuur 1c). De in-gel fluorescentie beeld getoond in figuur 4 toont de succesvolle fluorescerendeetikettering van de GPCR, rhodopsine, op drie verschillende posities opgenomen met AZF de Staudinger-Bertozzi ligatie met een fosfine derivaat van fluoresceïne. 29 Zoals verwacht, de wt rhodopsine toonde geen achtergrond labeling zoals gezien door het ontbreken van een fluorescerende band van de verwachte molecuulgewicht van de receptor.
Schema 1. De Staudinger-Bertozzi ligatie reactie tussen een triarylfosfine en een azide een stabiele amide-gebonden adduct.
Figuur 1. Regeling ter illustratie van de site-specifieke opname van een UAA (AZF) en de toepassingen voor de s . tudy GPCR Plaatsspecifieke UAA mutagenese wordt bereikt door co-transfectie van drie afzonderlijke plasmiden in zoogdiercellen die dragen: een geëvolueerde orthogonale amino-acyl-tRNA synthetase specifiek voor de UAA, een orthogonale tRNA dat een amber stopcodon (UAG) erkent en het gen dat codeert voor de GPCR die een TAG mutatie op een gewenste positie. Cellen gekweekt in aanwezigheid van de UAA drukken een full-length GPCR met een plaatsspecifiek geïntroduceerd azf. Deze cellen kunnen dan (a) geïncubeerd met ligand en geactiveerd met UV-licht verknopingen identificeren van een GPCR en zijn ligand, (b) gebruikt om plaatsspecifiek epitoop-tag een GPCR in kweek met een peptide geconjugeerd chemische label of (c) oplosbaar te GPCRs, die vervolgens bioorthogonally worden gemodificeerd met een fluorescerend label onder omstandigheden waarbij de receptor wordt geïmmobiliseerd op een antilichaam-geconjugeerde sepharose hars te zuiveren.0588/50588fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor een grotere afbeelding
Figuur 2. Gerichte fotoverknoping van een GPCR een getritieerde ligand. Hier Weergegeven zijn de representatieve resultaten van een experiment verknoping tussen AZF-CCR5 varianten en een met tritium gelabeld klein molecuul ligand, maraviroc. Bovenkant: De West-immunoblot gegenereerd na een typisch experiment, waarin de expressie van de geteste AZF-CCR5 varianten. De gekleurde segmenten geven waar het PVDF membraan werd gesneden voor scintillatietelling en corresponderen met de gedetecteerde scintillatie tellingen uitgezet in de grafiek in het onderste paneel. De rode segment vertegenwoordigt de verwachte molecuulmassa (ongeveer 40 kDa) van de verknoopte covalente complex tussen de receptor en ligand. Deor wij verwachten we tritium sporen in de segmenten wanneer azf wordt ingebracht op een plaats in de receptor die in de nabijheid van de ligand-bindingsplaats en een covalente verknoping te vormen met het ligand. Herdrukt (aangepast) met toestemming van Grünbeck, A., et al.. Genetisch gecodeerde foto-vernetters map bindingsplaats van een allosterische geneesmiddel op een G-eiwit-gekoppelde receptor. ACS Chemical Biology 7, 967-972 (2012). Copyright (2012) American Chemical Society. Klik hier voor grotere afbeelding
Figuur 3. ELISA detectie van gerichte epitoop-tagging van een GPCR Bovenkant:. Celoppervlakexpressie van HEK 293T cells het uiten van AZF-CCR5 varianten en wt en schijn-getransfecteerde controles gesondeerd met anti-CCR5 mAb 2D7 met behulp van de hele cel-gebaseerde ELISA (rode balken). Onderkant: Cellen van dezelfde transfectie werden behandeld met 0,05 mM FLAG-triarylfosfine gedurende 1 uur in levende cellen en vervolgens gekwantificeerd door latere ELISA met anti-FLAG M2 mAb om de mate van peptide-epitoop tagging op elke positie (blauwe staven) . Fout balken geven de standaardafwijking van het gemiddelde van twee of meer repliceren datasets. Herdrukt (aangepast) met toestemming van Naganathan, S., et al.. Site-specifiek epitoop tagging van GPCR's door bioorthogonal modificatie van een genetisch gecodeerd onnatuurlijke aminozuur Biochemie DOI:. 10.1021/bi301292h (2013). Copyright (2013) American Chemical Society. Klik hier voor grotere afbeelding
Figuur 4. Fluorescent etikettering van rhodopsin AZF opgenomen op verschillende posities. Wt en AZF-rhodopsine mutanten geïmmobiliseerd op immuno-matrix gelabeld met fluoresceïne-fosfine. Gezuiverde monsters werden gescheiden met 4-12% SDS-PAGE en in-gel fluorescentie beeld weergegeven is gemaakt met een confocale 488-nm laser fluorescentie scanner met een emissie filterset geoptimaliseerd voor fluoresceïne detectie. Figuur aangepast van Huber, T., et al.. Bioorthogonal labeling van functionele G-proteïne gekoppelde receptoren op genetisch gecodeerde azidogroepen. ingediend (2013). Klik hier voor grotere afbeelding
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven hier een robuuste methode voor plaatsspecifieke integratie van een reactieve probe, AZF, in GPCRs en tonen drie nuttige toepassingen van dit hulpmiddel om de structuur en dynamiek van GPCR bestuderen. Onze methode naar site-specifiek te nemen UAAs omzeilt een fundamenteel probleem met een alternatieve strategie op basis van chemisch labelen 32, 33 of vastmaken fotocrosslinkers 34 tot een enkel toegankelijk cysteïne mutant. Hoewel chemische dat cysteïne thiol doelgroepen zijn gebruikt om fluorescerende probes hechten dergelijke strategie vereist de vorming van een cysteïne-vrij proteïne achtergrond. Dit kan beperkend aangezien alle GPCRs bezitten meer dan een cysteïne, waarvan vele essentieel voor een goede receptorfunctie handhaven. Daarom is de haalbaarheid van een UAA die vatbaar is voor chemische modificatie of kan worden geactiveerd door UV-licht te voeren is zeer aantrekkelijk.
De covalente reactie van een photoactivatable crosslinker met een doel-molecuul is afhankelijk van de afstand en de naburige zijketens. Daarom kunnen deze probes worden gebruikt bij het identificeren van interacties die binnen een bepaalde afstand van de crosslinker bijvoorbeeld benzofenon gebaseerde vernettingsmiddelen worden voorgesteld om een afstand afhankelijkheid van 3 A hebben. 35 Eerder hebben we zowel AZF en BZF, OCG geïntroduceerd die een benzofenon reactieve groep aan residuen in een GPCR die binnen een bepaalde afstand van een fluoresceïne of tritium gemerkte ligand. 18, 19 de algemene toepasbaarheid van deze techniek hangt alleen af van de beschikbaarheid van dergelijke gemerkte liganden en de vorming van barnsteen mutanten te identificeren van een doel GPCR. Bovendien, in theorie deze gerichte fotoverknoping techniek kan worden toegepast op interacties tussen GPCRs en hun andere bindende partners, zoals een G-proteïne of β-arrestin identificeren. De gegevens verkregen uit deze studies verknoping kan worden gebruikt om nauwkeuriger mo creërenculair modellen van GPCR signalering complexen.
Verschillende bioorthogonal chemische reacties zijn in de literatuur wel voldoende voor de plaatsspecifieke modificatie van UAA residuen. De UAA, ACF, bijvoorbeeld, bezit een ketogroep die deelnemen aan hydrazon-of oxim ligatiereacties. 36, 37 We eerder dan de wijziging van ketogroepen en azidogroepen met gebiotinyleerd en fluoresceïne geconjugeerde reagentia. 29 Onze observaties aan dat de azido groep van AZF is echt meer bioorthogonal dan zijn keto tegenhanger. Daarom hebben we vervolgens gericht op het gebruik van de Staudinger-Bertozzi ligatie twee GPCR modificeren met een peptide-epitoop label of een fluorescerend label. Opmerkelijk is echter dat de Staudinger-Bertozzi ligatie vertoont substoichiometrische 38 en slechte kinetische eigenschappen van de etikettering. Bovendien fosfinen zijn zeer gevoelig voor luchtoxidatie. 25 Wij hebben waargenomen dat de Staudinger-Bertozzi ligatie behaalt slechts 30% etiket na incubatie gedurende 12 uur bij kamertemperatuur. 29 Om deze redenen, zijn we momenteel de evaluatie van alternatieve etikettering chemicaliën zoals CuAAC en SpAAC naar site-specifiek label AZF-GPCR's.
Zij het de nadelen van Staudinger-Bertozzi ligatie reacties, tonen we hier gebruik van een levende cel peptide-epitoop tagging strategie posities op een doelwit GPCR die toegankelijk zijn voor toekomstige fluorescentielabelling identificeren. Bovendien, dit epitoop tagging strategie talrijke andere nuttige toepassingen, zoals de invoering van een epitoop label een gemodificeerde residu in tegenstelling tot het inbrengen van de gehele epitoop vervangen door natieve sequenties. Deze functie is van specifiek belang met GPCR's sinds het aanpassen van de lengte en volgorde van sterk geconserveerd lus segmenten kan drastisch veranderen functie. Ten slotte hebben we ook hier geïllustreerd de proof-of-concept experimenten om GPCR's labelen met fluoroforen, makoning ze geschikt zijn voor single-molecule detectie experimenten.
Concluderend AZF is een veelzijdig gereedschap voor het bestuderen van de structuur en functie van GPCR. We hebben aangetoond dat AZF is ter plaatse specifieke wijze GPCR tot expressie in zoogdiercellen met het amber codon onderdrukking systeem opgenomen. Dit maakt de modificatie van een GPCR slechts een enkele positie. De structuur en functie van de gemerkte receptor kan vervolgens worden geëvalueerd hetzij in de natieve plasmamembraan omgeving of in een reinigingsmiddel. We zijn nu klaar om GPCR-signalering complexen te onderzoeken met de flexibiliteit van de AZF-sonde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken de gulle steun van diverse stichtingen en filantropische donoren (zie SakmarLab.org).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid pSVB. Yam | (Ye et al., 2008) | ||
| Plasmid pcDNA.RS for azF | (Ye et al., 2009) | ||
| Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5 | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position | ||
| HEK 293T cells | Adherent cells | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 10566 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14200 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Lipofectamine Plus | Invitrogen | Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015 |
|
| p-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | 6162 | |
| Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials | |||
| Maxima ML-3500S UV-A lamp | Spectronics Corporation | azF is activated by 365-nm light | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14065 | |
| HEPES | Irvine Scientific | 9319 | |
| Bovine serum albumin | Roche | 3117405001 | |
| Tritium-labeled ligand | From collaborator (Grunbeck et al., 2012) | ||
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| 1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166 | |
| NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Trans-Blot SD apparatus | Biorad | Apparatus for semi-dry transfer | |
| Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Non-fat powered milk | Fisher Scientific | NC9934262 | |
| Tween-20 | Aldrich | 274348 | |
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | Scintillation fluid |
| Scintillation vials | Fisher Scientific | 333726 | |
| LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter | Perkin Elmer | Beta-Scintillation counter | |
| Anti-rhodopsin 1D4 mAb | National Cell Culture Center | custom | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG | KPL, Inc. | 474-1806 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
| Hyblot CL AR film | Denville | E3018 | |
| Table 2. Targeted photocrosslinking materials | |||
| 0.25% Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
| FLAG-triarylphosphine | Sigma | GPHOS1 | |
| M2 FLAG mAb | Sigma | F1804 | |
| anti-CCR5 2D7 mAb | BD Biosciences | 555990 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| 96-well plate | Costar | 3601 | Clear bottom, high binding EIA/RIA |
| Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium) | Gibco | 14040 | |
| 16% Paraformaldehyde | EMS | 28908 | |
| HRP-conjugated | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| anti-rabbit IgG | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 | |
| Hydrogen peroxide | DE Healthcare Products | 97-93399 | |
| CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader | Perseptive Biosystems | ||
| Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials | |||
| Fluorescein-phosphine | (Huber et al., submitted 2012) | ||
| Nonapeptide (C9 peptide) | AnaSpec | 62190 | Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH |
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner | GE Healthcare | discontinued | Scanner with 488-nm wavelength laser |
| Table 4. Fluorescent labeling materials |
References
- Huber, T., Menon, S., Sakmar, T. P. Structural basis for ligand binding and specificity in adrenergic receptors: Implications for GPCR-targeted drug discovery. Biochemistry. 47, 11013-11023 (2008).
- Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current opinion in structural biology. 21, 567-572 (2011).
- Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Wu, B., et al. Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists. Science. 330, 1066-1071 (2010).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301, 964-967 (2003).
- Ye, S., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. The Journal of biological chemistry. 283, 1525-1533 (2008).
- Ye, S., Huber, T., Vogel, R., Sakmar, T. P. FTIR analysis of GPCR activation using azido probes. Nature chemical biology. 5, 397-399 (2009).
- Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464, 1386-1389 (2010).
- Singh, A., Thornton, E. R., Westheimer, F. H. The photolysis of diazoacetylchymotrypsin. The Journal of biological chemistry. 237, 3006-3008 (1962).
- Nakayama, T. A., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bovine rhodopsin determined by cross-linking using a photoactivatable analog of 11-cis-retinal. The Journal of biological chemistry. 265, 15762-15769 (1990).
- Chen, Q., Pinon, D. I., Miller, L. J., Dong, M. Molecular basis of glucagon-like peptide 1 docking to its intact receptor studied with carboxyl-terminal photolabile probes. The Journal of biological chemistry. 284, 34135-34144 (2009).
- Huang, K. S., Radhakrishnan, R., Bayley, H., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bacteriorhodopsin as studied by cross-linking using a photosensitive analog of retinal. The Journal of biological chemistry. 257, 13616-13623 (1982).
- Zoffmann, S., Turcatti, G., Galzi, J., Dahl, M., Chollet, A. Synthesis and characterization of fluorescent and photoactivatable MIP-1alpha ligands and interactions with chemokine receptors CCR1 and CCR5. Journal of medicinal chemistry. 44, 215-222 (2001).
- Janz, J. M., et al. Direct interaction between an allosteric agonist pepducin and the chemokine receptor CXCR4. Journal of the American Chemical Society. 133, 15878-15881 (2011).
- Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11020-11024 (2002).
- Hino, N., et al. Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid. Nature. 2, 201-206 (2005).
- Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50, 3411-3413 (2011).
- Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS chemical biology. 7, 967-972 (2012).
- Dunham, T. D., Farrens, D. L. Conformational changes in rhodopsin. Movement of helix f detected by site-specific chemical labeling and fluorescence spectroscopy. The Journal of biological chemistry. 274, 1683-1690 (1999).
- Maurel, D., et al. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nature. 5, 561-567 (2008).
- Huber, T., Sakmar, T. P. Escaping the flatlands: new approaches for studying the dynamic assembly and activation of GPCR signaling complexes. Trends in pharmacological sciences. 32, 410-419 (2011).
- Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
- Kiick, K. L., Saxon, E., Tirrell, D. A., Bertozzi, C. R. Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 19-24 (2002).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted [3 + 2] azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems. Journal of the American Chemical Society. 126, 15046-15047 (2004).
- Kolb, H. C., Sharpless, K. B. The growing impact of click chemistry on drug discovery. Drug discovery today. 8, 1128-1137 (2003).
- Huber, T., Botelho, A. V., Beyer, K., Brown, M. F. Membrane Model for the G-Protein-Coupled Receptor Rhodopsin: Hydrophobic Interface and Dynamical Structure. Biophys. J. 84, 2078-2100 (2004).
- Okada, T., et al. The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 Å crystal structure. J. Mol. Biol. 342, 571-583 (2004).
- Huber, T., Tian, H., Ye, S., Naganathan, S., Kazmi, M. A., Duarte, T., Sakmar, T. P. Bioorthogonal labeling of functional G protein-coupled receptors at genetically encoded azido groups. , submitted (2013).
- Naganathan, S., Ye, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Site-specific epitope tagging of GPCRs by bioorthogonal modification of a genetically-encoded unnatural amino acid. Biochemistry. , (2013).
- Molday, R. S., MacKenzie, D. Monoclonal antibodies to rhodopsin: characterization, cross-reactivity, and application as structural probes. Biochemistry. 22, 653-660 (1983).
- Gether, U., et al. Agonists induce conformational changes in transmembrane domains III and VI of the beta2 adrenoceptor. The EMBO journal. 16, 6737-6747 (1997).
- Hubbell, W. L., Altenbach, C., Hubbell, C. M., Khorana, H. G. Rhodopsin structure, dynamics, and activation: A perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking. Advances in Protein Chemistry; Membrane Proteins. 63, 243-290 (2003).
- Cai, K., Itoh, Y., Khorana, H. G. Mapping of contact sites in complex formation between transducin and light-activated rhodopsin by covalent crosslinking: use of a photoactivatable reagent. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4877-4882 (2001).
- Dorman, G., Prestwich, G. D. Benzophenone photophores in biochemistry. Biochemistry. 33, 5661-5673 (1994).
- Zhang, Z., et al. A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo. Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).
- Dirksen, A., Hackeng, T. M., Dawson, P. E. Nucleophilic catalysis of oxime ligation. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7581-7584 (2006).
- Yanagisawa, T., et al. Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification. Chemistry & biology. 15, 1187-1197 (2008).
