Summary
Wir genetisch kodieren die unnatürliche Aminosäure, p-Azido-L-Phenylalanin in verschiedenen gezielten Positionen in GPCRs und zeigen die Vielseitigkeit der Azidogruppe in verschiedenen Anwendungen. Dazu gehören eine gezielte Photo Technologie, um Rückstände in der Ligandenbindungstasche eines GPCR identifizieren und ortsspezifische Modifikation von GPCRs bioorthogonale mit einem Peptid-Epitop-Tag oder fluoreszierende Sonde.
Abstract
Um strukturelle und dynamische Untersuchungen von G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)-Signalkomplexe zu erleichtern, sind neue Ansätze erforderlich, um informative Sonden oder Etiketten in exprimierten Rezeptoren, die Rezeptor-Funktion nicht stören, nicht vorstellen. Wir verwendeten Amber-Codon Unterdrückungstechnologie genetisch codieren die unnatürlichen Aminosäure-, p-Azido-L-phenylalanin (AZF) an verschiedenen Positionen in gezielter GPCRs heterolog in Säugerzellen exprimiert. Die Vielseitigkeit der Azidogruppe ist hier in verschiedenen Anwendungen dargestellt, dass GPCRs in ihrer Mutterzellumgebung oder unter Reinigungsmittel gelösten Bedingungen zu studieren. Zuerst zeigen wir eine zellbasierte Zielphototechnik, um die Rückstände in den Liganden-Bindungstasche von GPCR wo ein Tritium-markierten niedermolekularen Liganden mit einem genetisch codierte Aminosäure Azido vernetzt identifizieren. Wir haben dann zeigen, ortsspezifische Modifikation von GPCRs durch die bioorthogonale Staudinger-Ligation Bertozzi Reaktionention, die die Azidogruppe zielt mit Phosphin-Derivate. Wir diskutieren eine allgemeine Strategie zur gezielten Peptid-Epitop-Tagging von exprimierten Membranproteinen in-Kultur und ihrer Erkennung mit Hilfe eines Ganzzell-ELISA-basierten Ansatz. Schließlich zeigen wir, dass AZF-GPCRs selektiv mit fluoreszierenden Sonden markiert werden. Die diskutierten Methoden sind die allgemeinen, in dass sie sich grundsätzlich an jede Aminosäureposition in jedem angewendet werden, ausgedrückt GPCR aktive Signalkomplexe zu verhören.
Introduction
Heptahelikalen G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) eine Superfamilie von hochdynamischen Membranproteine, die wichtige und vielfältige extrazelluläre Signale zu vermitteln. In der klassischen Paradigma wird Rezeptor-Aktivierung mit Liganden-induzierter Konformationsänderungen gekoppelt. 1, 2 Jüngste Fortschritte in der Strukturbiologie von GPCRs haben bedeutende Einblicke in die molekularen Mechanismen der Transmembran-Signalisierung zur Verfügung gestellt. 3-5 jedoch mit größerer Präzision der chemischen verstehen Funktionsmechanismus und Strukturdynamik von GPCR-Signalisierung wird ein Toolkit Ansätze erforderlich, um informative molekulare und chemische Sonden enthalten, um aktive Signalkomplexe zu verhören.
Zu diesem Zweck angepasst wir eine Methode, um ortsspezifisch einzuführen nicht oder minimal störenden Sonden in exprimierten Rezeptoren basierend auf unnatürliche Aminosäure (LF) Mutagenese mit Amber-Codon Unterdrückung Technologie zuvor von Schultz und c Pionieroworkers. 6 Wir optimierten die UAA-Mutagenese-Methode, um eine High-Yield-Expression und Mutagenese-System für Proteine, wie zB GPCRs, die nur schwer in anderen als den meisten Säugetierzellen heterologen Systemen zum Ausdruck zu erzielen. Mit einem orthogonalen entwickelt Suppressor-tRNA und entwickelte sich Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Paar für eine bestimmte UAA, wir ortsspezifisch eingeführt UAAs ausgedrückt Ziel GPCRs. Der erfolgreiche Einbau UAAs, p-Acetyl-L-Phenylalanin (ACF), p-Benzoyl-L-phenylalanin (BzF) und p-Azido-L-phenylalanin (AZF) wurde in unserem Modell GPCRs nachgewiesen - Rhodopsin und Menschen CC-Chemokin-Rezeptor CCR5. 7, 8
Im Prinzip kann ein UAA genetisch an beliebigen Stellen innerhalb der Proteinsequenz codiert werden, und diese Eigenschaft ist ein unschätzbares Werkzeug, wie es biochemische ermöglicht Single-Codon Abtastung eines Ziel GPCR. Wir konzentrieren uns hier speziell auf die Vielseitigkeit der UAA, AZF, die eine reaktive azi hatEinheit zu tun. Zusätzlich zur Funktion als eine einzigartige Infrarot (IR)-Sonde, 8, 9 AZF kann auch als photoaktivierbare Vernetzer dienen, indem sie mit benachbarten primären Aminen oder aliphatische Wasserstoffe dienen. Zusätzlich kann das biologisch inert Azidogruppe als selektive chemische Griff in bioorthogonalen Markierungsreaktionen teilnehmen. Hier präsentieren wir Ihnen Beispiele, die die nützlichen Anwendungen von ortsspezifischen Einbau von AZF in GPCRs, wie gezielte Photofalle zu einem Rezeptor-Liganden-Komplex, und Modifikation von GPCRs durch bioorthogonale Epitop-Tagging und Fluoreszenzmarkierungsstrategien.
Photoaktivierbare Reagenzien sind verwendet worden, um biologische Systeme untersuchen seit den 1960er Jahren. 10 In diesem Zeitraum sind eine Fülle von Rezeptor-Ligand-Vernetzungsexperimente wurde berichtet, GPCR-Komplexe zu untersuchen, von denen die meisten bei dem durch Verwendung von Photoaffinitätsliganden. 11, 12 jedoch, diese Anwendungen sind technisch begrenzt, da sie requirE Synthese von Liganden mit einer Vernetzungsgruppe. 13-15 Zudem mit dem Vernetzer-Einheit in dem Liganden, es ist eine Herausforderung, die Position der auf der Querverbindung GPCR identifiziert. Ortsspezifisch Einführen Photogruppen UAAs in Proteine unter Verwendung der Amber-Codon Unterdrückungstechnik ist ein wertvoller Fortschritt. 16, 17. Wir entwickelten eine Phototechnik, um die Bindungsschnittstelle an einen Rezeptor, der in der Bildung eines Rezeptor-Ligand-Komplex beteiligt ist, zu identifizieren lebende Zellen durch die Einführung von photolabilen Gruppen in GPCRs. 18, 19 Hier beschreiben wir die Versuchsprotokoll und Methode der Datenanalyse für die Anwendung dieses gezielte Photo Technologie, um die Bindungsstelle eines niedermolekularen Liganden, tritiiertes Maraviroc, auf CCR5 identifizieren. Dieses Verfahren nutzt die genaue Quantifizierung der radioaktiven Griff auf dem Liganden, die neben Beibehaltung der nativen chemischen Struktur des Liganden.
Fluoreszenz-basierte Techniken unterstützen die präzise Kenntnis der strukturellen Basis der Rezeptor-Aktivierung durch direkte Erforschung der Konformation des Rezeptors. 20, 21 jedoch ortsspezifisch sind Techniken, die über die Flexibilität, um Fluoreszenzmarkierungen in GPCRs vorstellen begrenzt. Wir interessieren uns für den Einsatz bioorthogonale chemische Modifikation von Strategien zur Einzelmoleküldetektion (SMD) der GPCR-Signalkomplexe zu erleichtern. 22. Die Azidogruppe in bioorthogonale Chemikalien wie Staudinger-Ligation Bertozzi, 23, 24 kupferfreien Stamm-Azid-Teilnahme Alkin-Cycloaddition (SPAAC) 25 und Kupfer-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) 26 Wir konzentrieren. hier auf der Staudinger-Bertozzi Ligationsreaktion, die die spezifische Reaktion zwischen einem Azid und einem Phosphin beinhaltet. Wir zeigen die Verwendung zweier unterschiedlicher Phosphin-Derivate, ein Peptid-Epitop (FLAG-Peptid) oder einer fluoreszierenden Markierung konjugiert(Fluorescein), um ortsspezifische Modifikation von GPCRs zu erreichen.
Wir haben bereits optimiert die Bedingungen für die ortsspezifische Markierung von Rhodopsin AZF-Varianten mit Hilfe der Röntgenkristallstruktur und dynamische Simulationen, um Zielstellen, die Lösungsmittel ausgesetzt sind, zu wählen. 27, 28 Wir veranschaulicht auch die Möglichkeit, Hintergrundfreie Kennzeichnung zu erreichen durch Staudinger- Bertozzi Ligation. 29. Wir zeigen hier eingesetzt, um die Fluoreszenzmarkierung von einem Reinigungsmittel mit gelöstem Rezeptor, der auf einer Immun Matrix immobilisiert wird und anschließend durch in-Gel-Fluoreszenz sichtbar zu erzielen allgemeine Verfahren. Außerdem zeigen wir eine sinnvolle Erweiterung auf dieser Kennzeichnungsstrategie zu Positionen zugänglich Kennzeichnung auf einem Rezeptor unbekannter Struktur, CCR5 identifizieren. Dies wird unter Verwendung einer Zielpeptid-Epitop-Tagging-Strategie, die auf bioorthogonalen Modifikation AZF-GPCR-Varianten in einem zellbasierten semiHochDurchSatzFormat durchgeführt stützt. 30 DieserVerfahren nutzt die mehrstufige Detektionseigenschaften eines Zelloberflächen-ELISA zur Kennzeichnung Ereignisse überwachen.
Die Methoden wir hier diskutieren, sind die allgemeinen und im Prinzip kann auf jeden GPCR mit AZF mit der Amber-Codon Unterdrückung Technologie integriert angewendet werden. In den Protokollen hier präsentierten wir detailliert die Schritte in Säugerzell Expression von Rezeptoren mit UAAs wie AZF mit der unnatürlichen Aminosäure-Mutagenese-Methode und ihre Folgeanträge auf strukturelle und dynamische Studien von GPCRs erleichtern eingebaut beteiligt.
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Protocol
1. Standortspezifische Genetische Einbau von unnatürlichen Aminosäuren in GPCRs
- Aufrechterhaltung HEK293T-Zellen in DMEM (4,5 g / l Glucose, 2 mM Glutamin), das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt war, bei 37 ° C in einem 5% CO 2-Atmosphäre.
- Transfektion die Zellen 60-80% Konfluenz in einem 10-cm-Platte mit Lipofectamine Plus-Reagenz gewachsen.
- 750 ul DMEM, mit 10 ul Plus-Reagens, 3,5 ug GPCR-cDNA (pMT4. Rho oder pcDNA 3.1. CCR5), der das Amber-Stopcodon an einer gewünschten Position, 3,5 &mgr; g des cDNA-Suppressor-tRNA (pSVB.Yam) und 0,35 ug der mutierten Aminoacyl-tRNA-Synthetase-cDNA für p-Azido-L-phenylalanin (pcDNA.RS). Inkubieren bei Raumtemperatur für 15 min. Auch eine ähnliche Transfektion mit der Gew. GPCR-cDNA (ein Amber-Stopp-Codon enthalten), um als Kontrolle dienen. Fügen Sie diese Mischung auf 750 ul DMEM mit 17 ul Lipofectamine. Nach Gleichgewichtseinstellung 15 min bei Raumtemperatur bringen dieGesamtvolumen von 4 ml.
- Saugen Medien auf 10-cm-Platte gelten Transfektion Mischung, um Zellen und werden wieder zu 37 ° C in 5% CO 2-Atmosphäre. Nach 4-6 Stunden, ergänzen die Zellen mit 4 ml DMEM mit 20% FBS und 1 mM AZF.
- Am nächsten Tag ersetzt das Wachstumsmedium mit DMEM mit 10% FBS und 0,5 mM AZF.
- Ernten Sie die Zellen 48 Stunden nach der Transfektion die Expression zu analysieren, oder fahren Sie in den folgenden Abschnitten beschrieben Photo oder Markierungsverfahren.
- Expression des GPCR-Amber-Mutante bestätigt in Gegenwart von LF in den Wachstumsmedien. Wir tun dies durch Western-Immunoblot-Detektion. Lysieren das Zellpellet in 1% (w / v) Dodecyl-β-D-maltosid (DDM) in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 h bei 4 ° C Zentrifugieren Sie das Lysat bei 16.000 xg und zur Lösung der Überstand unter reduzierenden Bedingungen durch SDS-PAGE. Übertragung auf eine PVDF-Membran und führen Immunoblotanalyse in voller Länge Rezeptor-Expression erkennen, mit the mAb 1D4 (National Cell Culture Center), die eine gentechnisch Epitop am C-Terminus des Rezeptors erkennt. 31
2. Zuordnen eines Ligandenbindungsstelle durch gezielte Photovernetzung
- 48 Stunden nach der Transfektion von Zellen, Medien absaugen und ersetzen mit 4 ml 1x Phosphate Buffered Saline (PBS). Rückkehr zu 37 º C für 15 min.
- Resuspendieren der Zellen mit 1x PBS und Transfer in ein Falcon-Röhrchen. Zentrifugieren bei 1.500 rpm für 2 min auf die Zellen zu pelletieren, und saugen Sie den Überstand.
- Zellpellet in 1 × Hanks gepufferte Salzlösung mit 20 mM HEPES, pH 7,5, 0,2% BSA und tritiierten Liganden bei Sättigungsbindungskonzentration für die erforderliche Zeitdauer und Temperatur, um Rezeptor-Liganden-Komplexbildung zu gewährleisten.
- Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 24-Well-oder 96-Well-Platte für Photoaktivierung von AZF bei 365 nm (z. B. mit einem UV-A-Lampe) für 15 min bei 4 ° C Maintain die Platte auf Eis, um die Probenerwärmung und Zell-Lyse zu vermeiden.
- Übertragen Sie die Zellen, um ein Eppendorf-Röhrchen, Zentrifugen, um die Zellen zu pelletieren, den Überstand und zur Analyse. Die Pellets können bei -20 ° C zur weiteren Verwendung gelagert werden.
- Resuspendieren des Zellpellets in Lyse-Puffer, der 1% (w / v) DDM, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 und Protease-Inhibitoren. Nach 1-stündiger Inkubation bei 4 ° C zentrifugieren Sie das Zelllysat für 10 min bei 16.000 × g, und den Überstand in ein neues Röhrchen.
- Hinzufügen mAb 1D4-Sepharose-2B-Harz zu dem Überstand und Inkubation über Nacht bei 4 ° C, um die GPCR immunopurify mit dem C-Terminus konstruiert mAb 1D4-Epitop. Am nächsten Tag Waschen der Kügelchen mehrmals mit Lyse-Puffer. Eluat-Proben mit 1% SDS bei 37 ° C für 1 Stunde unter Schütteln.
- Übertragen eines Teils des Eluenten in ein 15 ml Fläschchen mit Szintillationsflüssigkeit und zählen auf einem Beta-Szintillationszähler, die Menge der spezifischen Bindung des tritiierten Liganden zu quantifizieren thE-Rezeptor.
- Beheben Sie den restlichen mAb 1D4 Laufmittel gereinigt durch Standard-Gel-Elektrophorese. Wir verwenden ein 4-12% SDS-PAGE-Gel und dann halbtrockenen Transfer auf eine PVDF-Membran für Immunoblotting. Wir sind auch eine Spur mit Standard-Protein-Leiter, um visuelle Annäherung der Molekulargewicht zu führen.
- Sperrung der PVDF-Membran mit 5% Milch in TBS-Puffer, enthaltend 0,05% Tween-20. Sonde die Membran in voller Länge Rezeptor-Expression mit mAb 1D4 gefolgt von HRP-konjugierte Anti-Maus-IgG Sekundäranti bestätigen.
- Behandeln mit verstärkter Chemilumineszenz (ECL)-Reagens und setzen Membran Autoradiographie Film Banden sichtbar.
- Schneiden der Membran mit einer Rasierklinge, um jede Probenspur zu trennen, gefolgt von Schneiden zu bestimmten Molekulargewichtsmarkern. Übertragen Membransegmente Fläschchen mit Szintillationsflüssigkeit. Quantifizierung der Menge an Tritium in jeder Membransegment durch Zählen auf einem Beta-Szintillationszähler.
- Identifizieren Sie die positivephotovernetzen mit der Detektion von Tritium in der scheinbaren molekularen Masse gleich der Summe derjenigen der GPCR und dem Liganden.
3. Gezielte Epitop-Tagging und Zelloberflächen Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)
- 24 Stunden nach der Transfektion, waschen Sie die Zellen mit 1 ml 1x PBS und trypsinize mit 1 ml 0,25% Trypsin für 3 min. Ergänzt mit 9 ml DMEM, enthaltend 10% FBS und 0,5 mM AZF. Die Zellen und zählen die Zelldichte. Wir verwenden eine Standard-Zählkammer.
- Pre-Behandlung eine hohe Bindungs, klare Boden 96-Well-Platte mit 100 ml 0,01 mg / ml Poly-D-Lysin pro Vertiefung. Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur, immer wieder waschen mit 1x PBS und an der Luft trocknen.
- Platte 200 ul der transfizierten Zellen in einer Dichte von 6 × 10 4 - 8 Stück 10 4 Zellen / Well auf 96-Well-Platte und zurück auf 37 ° C in 5% CO 2-Atmosphäre.
- Am nächsten Tag vorbereiten Zellen für die Kennzeichnung. Behutsam dreimal mit 100 ul / 1x PBS to entfernen Sie AZF enthalten Wachstumsmedien. Sicherzustellen Zellen haften bleiben, zum Beispiel durch Verwendung von PBS, das Ca 2 + und Mg 2 +.
- Bereiten 50-200 uM FLAG-Triarylphosphins Markierungsreagenzes in 1x HBSS / PBS aus einer Stamm 5-20 mM in PBS erhalten. Bewerben 60 ml in jede Vertiefung (in dreifacher Ausfertigung für jede Amber-Mutante) und zurück auf 37 ° C für 30 min bis 4 Stunden. Achten Sie auf eine Reihe von Brunnen ohne Label-Behandlung in 1x HBSS / PBS. Auch eine Gewichtskontrolle GPCR mit AZF-GPCR-Varianten vergleichen.
- Waschen der Zellen 3-mal mit 100 &mgr; l / Vertiefung Blockierungspuffer, BB (1x PBS, 0,5% BSA), um nicht umgesetztes Etikett vollständig zu entfernen.
- Bewerben 100 ul / 4% Paraformaldehyd (aus einer 16% Lager in 1x PBS) zu den Zellen. Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur. Dreimal mit BB waschen.
- Führen Sie Standard-Zelloberfläche ELISA-Protokoll, um markierten Rezeptor und Rezeptor-Expression zu erkennen. Inkubation mit primärem Antikörper für 1,5 h auf Eis, gefolgt von Sekundär eintibody Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
- 100 l Anti-FLAG-M2-Antikörper (z. B. 1:2000 Verdünnung des Antikörpers in BB) an FLAG-Peptid-Epitop des FLAG-Triarylphosphins Markierungsreagenzes zu erkennen. Sonde auch ohne Etikett behandelten Vertiefungen als Negativkontrolle. Hinzufügen anti-CCR5-2D7 (wir verwenden eine 1:500 Verdünnung)-Antikörper mit einem getrennten Satz von Vertiefungen, um zu bestimmen wt oder AZF-GPCR-Zelloberflächenexpression.
- Mit BB waschen Zellen dreimal, und Inkubation mit 100 &mgr; l HRP-konjugiertes Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper (1:2000 Verdünnung).
- Sorgfältig waschen Sie die Zellen fünfmal mit BB. In 50 ul Detektionspuffer: Amplex Rot, 20 mM H 2 O 2, 1x PBS (1:10:90 Verhältnis) und Inkubation 15 Minuten bei Raumtemperatur. Sammeln spektralen Daten auf einer Fluoreszenz Multi-Well-Plattenlesegerät bei λ ex = 530 und λ em = 590.
4. Bioorthogonale Fluoreszenzmarkierung eines GPCR
- Lyse10 7 Zellen, geerntet oder AZF Gew.-Rhodopsin-Varianten in 1 ml Lösungspuffer, enthaltend 1% (w / v) DM, 50 mM HEPES oder Tris-HCl, pH 6,8, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl 2 und Protease-Inhibitoren für 1 h bei 4 ° C. Zentrifugieren Sie die Zelllysat bei 15.000 g für 10 min und sammeln die Überstandsfraktion.
- 100 l-mAb 1D4 Sepharose 2B Rezeptor Harz erfassen mit Hilfe der C-Terminus entwickelt 1D4 Epitop. Inkubation für 12 Stunden bei 4 ° C. Dreimal mit 0,1% Das Harz (w / v) DDM in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,3.
- Mit 0,1 mM Fluorescein-Phosphin in einem Gesamtvolumen von 0,3 - 0,5 mL an Rezeptor auf der Immun-Affinitätsmatrix (mAb 1D4-Sepharose 2B) immobilisiert beschriften. Inkubation für 12 Stunden bei Raumtemperatur. Zentrifuge und entfernen Stand. Das Harz, um nicht umgesetztes Etikett zu entfernen.
- Eluieren des markierten Rezeptors mit 100 ml Elutionspuffer, enthaltend 0,1% (w / v) DDM und 0,33 mg / ml Nonapeptid (C9-Peptid gegen die Epitop 1D4)in 2 mM Phosphat-Puffer, pH 6,0 durch Inkubation auf Eis für 1 Stunde.
- Beheben markierten Proben durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen. Kurz waschen Gele in PBS und dann visualisieren Kennzeichnung von AZF-GPCR durch in-Gel-Fluoreszenz. Verwenden Sie beispielsweise einen konfokalen Fluoreszenz-Scanners mit einem 488-nm-Laserwellenlänge an den Rezeptor mit Fluorescein modifizierte erkennen.
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Representative Results
Wir beschäftigten die unnatürliche Aminosäure Mutagenese Methode zur ortsspezifisch molekulare Sonden einzuführen in ein GPCR mit der Amber-Codon Unterdrückung Technologie. Das Schema in Abbildung 1 skizziert die wesentlichen Schritte der Methodik und die verschiedenen Anwendungen der Einbeziehung der vielseitige UAA, p-Azido-L-Phenylalanin (AZF) in GPCRs. Die Expression von AZF-GPCRs in Säugerzellen ermöglicht eine gezielte Photoliganden und gezielte Peptid-Epitop-Tagging oder fluoreszierenden Modifikationen eines GPCR über bioorthogonale Kennzeichnung Chemie.
Die Phototechnik kann verwendet werden, um die strukturellen Aspekte von GPCR-Liganden-Komplexe in lebenden Zellen (1a) zu untersuchen. Aus einem solchen Experiment erhaltenen repräsentativen Daten sind in Fig. 2 gezeigt. 19 Hier verwendeten wir einen radioaktiv markierten niedermolekularen Liganden, tritiiertem maraviroc, um seine Bindung zu identifizieren site auf CCR5. In diesem Beispiel UV-Bestrahlung auf die Zellen, die CCR5 AZF-Varianten mit tritiiertem maraviroc Ergebnisse in kovalent vernetzte Komplexe, die mit dem empfindlichen radioaktiven Markierung auf dem Liganden identifiziert werden können, vorinkubiert. Unter den verschiedenen Positionen auf CCR5 getestet, waren I28azF und W86azF kann in tritiiertes Maraviroc photovernetzen als mit deutlich höheren Scintillations zählt (rote Balken, Bodenplatte, Abbildung 2) dargestellt. Die Gew. Rezeptor zeigte keine Vernetzung zu radioaktiven Liganden.
Bioorthogonalen Markierungschemie kann verwendet werden, ortsspezifisch AZF-GPCR-Varianten ändern. Wir beschäftigten die Staudinger-Ligation Bertozzi Chemie zu zwei GPCRs beschriften: CCR5 und Rhodopsin mit Phosphin-Derivate (Schema 1). Eine Strategie beinhaltet die gezielte Epitop-Tagging eines GPCR in lebenden Zellen mit Hilfe eines Peptid-konjugierte Etikett (Abbildung 1b). Wir zeigen, wie ein Experiment, in dem ein Flag PeptidE-Triarylphosphins Kennzeichnung Reagenz an ortsspezifisch eingesetzt und AZF-CCR5-Varianten selektiv zu ändern. In Fig. 3 repräsentative Daten aus einem empfindlichen und mehrstufigen ELISA Erkennungsstrategie verwendet, um Positionen, die mit dem FLAG-Peptid markiert sind. 30 Unter den Positionen auf CCR5 suchten wir identifizieren angezeigt wurden alle Varianten AZF-CCR5 an der Zelloberfläche (rot exprimiert Bars, Abbildung 3) und etwa die Hälfte von ihnen erfolgreich unterzogen gezielte Epitop-Tagging (blaue Balken, Abbildung 3). Gew. CCR5 diente als negative Kontrolle für die Epitop-Tagging, durch das Fehlen von Anti-FLAG-Signal gezeigt. In einer alternativen Strategie, markierten wir Detergens-solubilisierten AZF-GPCRs auf einer Immun-Affinitätsmatrix immobilisiert ist, wie z. B. Anti-1D4-mAb, konjugiert an Sepharose 2B-Harz, mit einem Fluorophor-konjugierten Etikett (Fig. 1c). Die In-Gel-Fluoreszenzbild in Fig. 4 gezeigt veranschaulicht die erfolgreiche Fluoreszenz29 Kennzeichnung des GPCR Rhodopsin, an drei verschiedenen Stellen mit AZF vom Staudinger-Ligation unter Verwendung eines Bertozzi Phosphin-Derivat von Fluorescein eingebaut. Wie erwartet, zeigte der WT Rhodopsin keine Hintergrundmarkierung, wie durch Fehlen einer Fluoreszenz-Bande bei der erwarteten gesehen Molekulargewicht des Rezeptors.
Schema 1. Die Staudinger-Ligation Bertozzi Reaktion zwischen einem Triarylphosphins und einem Azid, um eine stabile Amid-gebundenen Addukt zu bilden.
Fig. 1 ist. Schema, das die ortsspezifischen Einbau eines UAA (AZF) und seine Anwendungen zu s . einen weiterentwickelten orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase spezifisch für die UAA, eine orthogonale Suppressor-tRNA, die ein Amber-Stopp-Codon (UAG) erkennt: tudy GPCRs Ortsspezifische Mutagenese UAA wird durch Co-Transfektion von drei getrennten Plasmiden in Säugerzellen, tragen erreicht und die die GPCR, die eine TAG-Mutation an einer gewünschten Position kodierende Gen. Zellen, die in der Gegenwart des UAA gewachsen Ausdruck einer in voller Länge GPCR mit einem ortsspezifisch eingeführt AZF. Diese Zellen können dann (a) mit dem Liganden inkubiert und mit UV-Licht aktiviert wird, um Vernetzungen zwischen GPCR und seinem Liganden zu identifizieren, (b) ortsspezifisch-Epitop-Tag ein GPCR in Kultur mit einem Peptid-konjugierten chemischen Marker verwendet wird, oder (c) gelöst sind, um GPCRs, die dann bioorthogonally mit einer fluoreszierenden Markierung unter Bedingungen, wo der Rezeptor für einen Antikörper-konjugierte Sepharose-Harz immobilisiert modifizierten reinigen.0588/50588fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht
2. Gezielte Photovernetzung eines GPCR-Liganden zu einer tritiiertes. Angezeigt werden hier die repräsentativen Ergebnisse einer Vernetzung zwischen Experiment AZF-CCR5-Varianten und ein Tritium-markierten Liganden kleines Molekül, Maraviroc. Oberseite: Der Western-Immunoblot nach einem typischen Experiment erzeugt, die den Ausdruck der getesteten AZF-CCR5-Varianten. Die gefärbten Segmente markieren, wo der PVDF-Membran wurde für die Szintillationszählung geschnitten und jeweils den detektierten Szintillations Zählungen in dem Balkendiagramm in der unteren Platte aufgetragen. Die rote Segment stellt das erwartete Molekulargewicht (etwa 40 kDa) der kovalenten vernetzten Komplexes zwischen dem Rezeptor und dem Liganden. Dierefore, würden wir erwarten, Tritium in den Segmenten zu erfassen nur dann, wenn AZF ist an einer Position in dem Rezeptor, die in der Nähe der Liganden-Bindungstasche und eine kovalente Vernetzung mit dem Liganden zu bilden, eingeführt. Nachdruck (angepasst) mit Genehmigung von Grünbeck, A., et al. Genetisch kodierte Foto-Vernetzer Karte die Bindungsstelle eines allosterischen Droge auf einem G-Protein-gekoppelten Rezeptor. ACS Chemical Biology 7, 967-972 (2012). Copyright (2012) American Chemical Society. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht
3. ELISA-Nachweis von gezielten Epitop-Tagging eines GPCR Oberseite:. Zelloberflächenexpression von HEK 293T-cells ausdrücken AZF-CCR5-Varianten und wt und scheintransfizierten Kontrollen mit Anti-CCR5 mAb 2D7 mit der gesamten Zell-basierten ELISA (rote Balken) sondiert. Bodenplatte: Zellen aus der gleichen Transfektion wurden mit 0,05 mM FLAG-Triarylphosphin für 1 h in lebenden Zellen behandelt und dann durch nachfolgende ELISA quantifiziert unter Verwendung von Anti-FLAG-M2-mAb, das Ausmaß der Peptid-Epitop-Markierung an jeder Position (blaue Balken) zu bestimmen, . Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts für zwei oder mehr Wiederholungsdatensätzen. Nachdruck (angepasst) mit Genehmigung aus Naganathan, S., et al. Standort-spezifisches Epitop-Tagging von GPCRs durch bioorthogonale Modifikation eines genetisch kodierten unnatürliche Aminosäure Biochemie DOI:. 10.1021/bi301292h (2013). Copyright (2013) American Chemical Society. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht
4. Fluoreszenzmarkierung von Rhodopsin AZF an verschiedenen Positionen. Wt und AZF-Rhodopsin-Mutanten auf einer Immun-Affinitätsmatrix mit Fluorescein-markierten immobilisierten Phosphin aufgenommen. Gereinigten Proben wurden durch 4-12% SDS-PAGE getrennt und die In-Gel-Fluoreszenzbild dargestellt wurde mit einem konfokalen 488-nm-Laser-Fluoreszenz-Scanner mit einer Emissionsfiltersatz für Fluorescein Erfassungs optimiert gemacht. Figur von Huber, T., et al. Bioorthogonale Kennzeichnung von Funktions G-Protein-gekoppelte Rezeptoren auf genetisch codierten Azidgruppen angepasst. eingereicht (2013). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht
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Discussion
Wir beschreiben hier eine robuste Methode zur ortsspezifischen Einbau eines reaktiven Sonde, AZF, in GPCRs und zeigen drei nützliche Anwendungen dieses Werkzeug, um die Struktur und Dynamik von GPCRs zu studieren. Unsere Methode zur ortsspezifisch integrieren UAAs umgeht ein grundsätzliches Problem mit einer alternativen Strategie, die auf chemisch Beschriftung 32, 33 oder Anbringen Photovernetzer 34 zu einem einzigen zugänglichen Cystein-Mutante. Obwohl die chemischen Cysteinthiolgruppen Ziel verwendet worden, um fluoreszierende Sonden zu befestigen, eine solche Strategie erfordert die Erzeugung eines Cystein-freiem Protein Hintergrund. Dies kann als Einschränkung, da alle GPCRs besitzen mehr als eine Cystein, von denen viele wesentlich sein, um die ordnungsgemäße Rezeptorfunktion aufrecht zu erhalten. Daher ist die Möglichkeit, eine UAA, die zugänglich für chemische Modifikation oder durch UV-Licht aktiviert werden, einzuführen äußerst attraktiv.
Die kovalente Reaktion eines photoactivatable Vernetzer mit einem Zielmolekül ist abhängig von der Entfernung und den benachbarten Seitenketten. Daher können diese Sonden bei der Identifizierung von Wechselwirkungen verwendet, die in einem bestimmten Abstand von dem Vernetzungsmittel sind beispielsweise, Benzophenon-basierte Vernetzer werden vorgeschlagen, um einen Abstandsabhängigkeit von 3 Å aufweisen. 35 Zuvor sowohl AZF und BzF, führten wir eine UAA enthaltend eine reaktive Gruppe Benzophenon, zu Rückständen in einem GPCR, die in einem definierten Abstand von einem Fluorescein oder Tritium markiertem Ligand 18., 19 Die allgemeine Anwendbarkeit dieser Technik hängt nur von der Verfügbarkeit der markierten Liganden und der Erzeugung von Mutanten zu identifizieren, Bernstein einer Ziel-GPCR. Zusätzlich kann in der Theorie gezielte Phototechnik kann angewendet werden, um Wechselwirkungen zwischen GPCRs und ihre anderen Bindungspartnern, wie beispielsweise ein G-Protein oder β-Arrestin identifizieren. Die aus diesen Studien gewonnenen Daten Vernetzen kann verwendet werden, um genauere mo erstellenMolekularmodelle von GPCR-Signalkomplexe.
Mehrere bioorthogonalen chemischen Reaktionen sind in der Literatur, die für die ortsspezifische Modifikation der UAA Rückstände erlauben beschrieben. Die UAA, AcF, beispielsweise besitzt eine Keto-Gruppe, die in Hydrazon-oder Oxim-Reaktionen teilnehmen können. 36, 37. Wir verglichen die zuvor Modifikation Ketogruppen und Azidgruppen und mit biotinyliertem Fluorescein konjugierten Reagenzien. 29 Unsere Beobachtungen zeigten, dass die Azido Gruppe von AZF ist wirklich mehr als sein bioorthogonale Keto-Gegenstück. Daher konzentrierten wir uns nachfolgend auf die Verwendung der Staudinger-Ligation Bertozzi zwei GPCRs mit einem Peptid-Epitop-Markierung oder einer fluoreszierenden Markierung zu ändern. Es ist jedoch bemerkenswert, dass der Staudinger-Ligation Bertozzi aufweist unterstöchiometrischen 38 und Armen kinetischen Eigenschaften der Kennzeichnung. Darüber hinaus sind Phosphine sehr anfällig für Luftoxidation. 25. Wir haben beobachtet, dass die Staudinger-Be-rtozzi Ligation erreicht nur 30% Kennzeichnung nach Inkubation für 12 Stunden bei Raumtemperatur. 29. Aus diesen Gründen sind wir derzeit der Bewertung alternativer Kennzeichnung Chemie wie CuAAC und SPAAC ortsspezifisch beschriften AZF-GPCRs.
Wenn auch die Nachteile der Staudinger-Ligationsreaktionen Bertozzi zeigen wir hier die Verwendung eines lebenden Zellen Peptid-Epitop-Tagging Strategie zu Positionen auf einer Ziel-GPCR, die für zukünftige Fluoreszenzmarkierung zugänglich zu identifizieren. Darüber hinaus hat diese Epitop-Tagging Strategie zahlreiche weitere nützliche Anwendungen, wie die Einführung einer Epitop-Tag an einem modifizierten Rest im Gegensatz zum Einlegen der gesamten Epitop durch Ersetzen nativen Sequenzen. Diese Funktion ist von besonderer Bedeutung, da mit GPCRs Änderung der Länge und Sequenz der hochkonservierten Schleife Segmente könnte dramatisch verändern-Funktion. Schließlich haben wir auch hier die Proof-of-Concept-Experimente dargestellt, dass GPCRs mit Fluorophore, ma beschriftenKönig sie für Einzelmoleküldetektion Experimenten.
Zusammenfassend ist AZF ein vielseitiges Werkzeug für die Untersuchung der Struktur und Funktion von GPCRs. Wir haben gezeigt, dass AZF ist ortsspezifisch in GPCRs in Säugerzellen unter Verwendung des Amber-Codon Unterdrückungssystem ausgedrückt eingebaut. Dies ermöglicht die Modifikation eines GPCR nur an einer einzigen Position. Die Struktur und Funktion des markierten Rezeptors kann dann entweder in der nativen Plasmamembran-Umgebung oder in einer Detergenslösung bewertet. Wir sind nun bereit, GPCR-Signalkomplexe mit der Flexibilität der AZF-Sonde zu untersuchen.
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Disclosures
Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken für die großzügige Unterstützung mehrerer Stiftungen und wohltätigen Spendern (siehe SakmarLab.org).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid pSVB. Yam | (Ye et al., 2008) | ||
| Plasmid pcDNA.RS for azF | (Ye et al., 2009) | ||
| Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5 | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position | ||
| HEK 293T cells | Adherent cells | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 10566 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14200 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Lipofectamine Plus | Invitrogen | Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015 |
|
| p-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | 6162 | |
| Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials | |||
| Maxima ML-3500S UV-A lamp | Spectronics Corporation | azF is activated by 365-nm light | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14065 | |
| HEPES | Irvine Scientific | 9319 | |
| Bovine serum albumin | Roche | 3117405001 | |
| Tritium-labeled ligand | From collaborator (Grunbeck et al., 2012) | ||
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| 1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166 | |
| NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Trans-Blot SD apparatus | Biorad | Apparatus for semi-dry transfer | |
| Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Non-fat powered milk | Fisher Scientific | NC9934262 | |
| Tween-20 | Aldrich | 274348 | |
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | Scintillation fluid |
| Scintillation vials | Fisher Scientific | 333726 | |
| LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter | Perkin Elmer | Beta-Scintillation counter | |
| Anti-rhodopsin 1D4 mAb | National Cell Culture Center | custom | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG | KPL, Inc. | 474-1806 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
| Hyblot CL AR film | Denville | E3018 | |
| Table 2. Targeted photocrosslinking materials | |||
| 0.25% Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
| FLAG-triarylphosphine | Sigma | GPHOS1 | |
| M2 FLAG mAb | Sigma | F1804 | |
| anti-CCR5 2D7 mAb | BD Biosciences | 555990 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| 96-well plate | Costar | 3601 | Clear bottom, high binding EIA/RIA |
| Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium) | Gibco | 14040 | |
| 16% Paraformaldehyde | EMS | 28908 | |
| HRP-conjugated | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| anti-rabbit IgG | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 | |
| Hydrogen peroxide | DE Healthcare Products | 97-93399 | |
| CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader | Perseptive Biosystems | ||
| Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials | |||
| Fluorescein-phosphine | (Huber et al., submitted 2012) | ||
| Nonapeptide (C9 peptide) | AnaSpec | 62190 | Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH |
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner | GE Healthcare | discontinued | Scanner with 488-nm wavelength laser |
| Table 4. Fluorescent labeling materials |
References
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