Summary
Vi genetiskt koda den onaturliga aminosyror, p-azido-L-fenylalanin vid olika riktade positioner i GPCRs och visar mångsidigheten hos azidogrupp i olika applikationer. Dessa inkluderar en riktad fototvär teknik för att identifiera rester i den ligandbindande fickan hos en GPCR, och sätesspecifik bioorthogonal modifiering av GPCR: er med en peptid-epitop-tag eller fluorescerande sond.
Abstract
För att underlätta strukturell och dynamiska studier av G-proteinkopplad receptor (GPCR) signaleringskomplex, är nya metoder som krävs för att införa informations prober eller etiketter i uttryckta receptorer som inte perturb receptorfunktion. Vi använde amber kodon undertryckande teknik för att genetiskt koda den onaturliga aminosyror, p-azido-L-fenylalanin (AZF) vid olika riktade positioner i GPCRs heterologt uttryckta i däggdjursceller. Mångsidigheten azidogruppen illustreras här i olika applikationer för att studera GPCRs i deras naturliga cellulära miljö eller under tvätt-och rengöringsmedel upplösta förhållanden. Först visar vi en cellbaserad riktad fototvär teknik för att identifiera rester i ligand-bindande fickan på GPCR där en tritiummärkt småmolekylära ligand tvärbunden till en genetiskt kodad azido aminosyra. Vi visar sedan platsspecifik modifiering av GPCRs av bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaktionning som riktar azidogruppen använda fosfin derivat. Vi diskuterar en allmän strategi för riktade peptid-epitop taggning av uttryckta membranproteiner i-kulturen och dess upptäckt med hjälp av en hel-cell-baserade ELISA-metod. Slutligen visar vi att AZF-GPCR kan selektivt märkta med fluorescerande prober. De metoder som diskuteras är generella, i det att de kan i princip tillämpas på alla aminosyrapositionen i någon uttryckte GPCR att förhöra aktiva signaleringskomplex.
Introduction
Heptahelical G-proteinkopplade receptorer (GPCR) innefattar en superfamilj av högdynamiska membranproteiner som förmedlar viktiga och olikartade extracellulära signaler. I den klassiska paradigmet, är receptoraktivering i kombination med ligandinducerade konformationsförändringar. 1, har 2 Nya framsteg inom strukturbiologi av GPCRs förutsatt betydande insikt i de molekylära mekanismerna för trans signalering. 3-5 Men för att förstå med ökad kemisk precision funktionell mekanism och strukturdynamik av GPCR signalering, är en verktygslåda med metoder som krävs för att införliva informativa molekylära och kemiska sonder för att förhöra aktiva signaleringskomplex.
För detta ändamål anpassade vi en metod för att sätesspecifikt införa icke-eller minimalt störande prober in uttryckta receptorer baserade på onaturlig aminosyra (UAA) mutagenes med användning amber kodon undertryckande teknik tidigare uppfunnen av Schultz och coworkers. 6 Vi optimerat UAA mutagenes metod för att uppnå en hög avkastning uttryck och mutagenes system för proteiner såsom GPCRs, som är svåra att uttrycka i andra än däggdjursceller mest heterologa system. Med hjälp av en ortogonal konstruerad suppressor tRNA och utvecklats aminoacyl-tRNA-syntetas paret för en specifik UAA, vi platsspecifikt infört UAAs i uttryckta mål GPCRs. Den framgångsrika inkorporeringen av UAAs, p-acetyl-L-fenylalanin (ACF), p-bensoyl-L-fenylalanin (BZF), och p-azido-L-fenylalanin (AZF) har visats i våra modell GPCRs - rhodopsin och humant CC kemokinreceptorn, CCR5. 7, 8
I princip kan en UAA vara genetiskt kodade vid någon position inom proteinsekvensen och den här egenskapen är ett ovärderligt biokemiska verktyg eftersom det möjliggör enkel-kodon skanning av ett mål GPCR. Vi fokuserar här på just mångsidigheten hos UAA, AZF, som har en reaktiv azido-delen. Förutom att fungera som en unik infraröd (IR) sond, 8, 9 AZF kan också fungera som ett fotoaktiverbart tvärbindningsmedel genom att reagera med de angränsande primära aminer eller alifatiska väten. Dessutom kan biologiskt inert azidogrupp delta som ett selektivt kemiskt handtag i bioorthogonal märkningsreaktioner. Här presenterar vi exempel som illustrerar de användbara tillämpningar av platsspecifik inkorporering av AZF i GPCRs, såsom riktad fototvär att fånga en receptor-ligand-komplex, och modifiering av GPCRs genom bioorthogonal epitop taggning och fluorescerande strategier märkning.
Fotoaktiverbara reagens har använts för att studera biologiska system sedan 1960-talet. 10 Under denna period har ett överflöd av receptor-ligand tvärbindningsförsök rapporterats att studera GPCR komplex, deltar de flesta av vilka användningen av fotoaffinitetsligander. 11, 12 Men dessa applikationer är tekniskt begränsade, eftersom de kräe syntes av ligander som bär en tvärbindningsgrupp. 13-15 Dessutom med tvärbinddelen i liganden, det är svårt att identifiera platsen för tvärbindning på GPCR. Platsspecifikt införande av fototvär grupper som UAAs i proteiner med användning av den gula kodonet undertryckande teknologi är ett värdefullt framsteg. 16, 17 Vi utvecklade en fototvär teknik för att identifiera det bindande gränssnittet på en receptor som är involverad i bildningen av ett receptor-ligand-komplex i levande celler genom införande av fotolabila grupper till GPCR. 18, 19 Här beskriver vi den experimentella protokollet och metod för dataanalys för att tillämpa denna riktad fototvär teknik för att identifiera bindningsstället av en liten molekyl liganden tritierad maravirok å CCR5. Metoden drar nytta av exakt kvantifiering av den radioaktiva handtaget på liganden, förutom att behålla den nativa kemiska strukturen av liganden.
Fluorescensbaserade tekniker stöder exakt förståelse för den strukturella basen av receptoraktivering genom att direkt sondera konformationstillstånd av receptorn. 20, 21 emellertid, tekniker som har den flexibiliteten att införa fluorescerande markörer i GPCRs platsspecifikt är begränsade. Vi är intresserade av att anställa bioorthogonal kemisk modifiering strategier för att underlätta enda molekyl upptäckt (SMD) i GPCR signalering komplex. 22 azidogruppen kan delta i bioorthogonal kemiska sammansättningar såsom Staudinger-Bertozzi ligation, 23, 24 koppar-fri stam-främjade azid- alkyn cykloadditionen (SpAAC) 25 och koppar-katalyseras azid-alkyn cykloadditionen (CuAAC). 26 Vi fokuserar här på Staudinger-Bertozzi ligeringsreaktion som involverar den specifika reaktionen mellan en azid och en fosfin. Vi visar användningen av två olika fosfin-derivat, konjugerade till en peptid-epitop (FLAG-peptid) eller en fluorescerande märkning(Fluorescein) för att uppnå platsspecifik modifiering av GPCR.
Vi har tidigare optimerat förutsättningarna för platsspecifik märkning av rhodopsin AZF varianter med hjälp av röntgenkristallstruktur och dynamiska simuleringar för att välja mål webbplatser som är lösningsmedels utsatta. 27, 28 Vi illustrerade också möjligheten att nå bakgrundsfria märkning av Staudinger- Bertozzi ligering. 29 Vi visar här av den vanliga proceduren för att uppnå fluorescensmärkning av en detergent-solubiliserat receptor som är immobiliserad på en immunaffinitetsmatris och därefter visualiseras genom in-gel-fluorescens. Dessutom visar vi en bra förlängning på denna märkning strategi för att identifiera positioner bli föremål för märkning på en receptor av okänd struktur, CCR5. Detta sker med hjälp av en riktad peptid-epitop tagg strategi som bygger på bioorthogonal modifiering av AZF-GPCR varianter i ett cellbaserat halv hög genomströmning format. 30 DettaMetoden utnyttjar flerstegsdetekteringsegenskaperna hos en cellyt-ELISA för att övervaka märkningshändelser.
De metoder som vi diskuterar här är generella och i princip kan tillämpas på alla GPCR införlivas med AZF hjälp av amber kodon dämpning teknik. I de protokoll som presenteras här vi i detalj de steg som ingår i däggdjurscelluttryck av receptorer införlivas med UAAs såsom AZF med hjälp av onaturliga aminosyror mutagenes metod och deras efterföljande ansökningar för att underlätta strukturella och dynamiska studier av GPCRs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Platsspecifik Genetisk Införande av onaturliga aminosyror i GPCRs
- Bibehåll HEK293T-celler i DMEM (4,5 g / l glukos, 2 mM glutamin) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) vid 37 ° C i en 5% CO2 atmosfär.
- Transfektera cellerna odlas till 60-80% sammanflödet i en 10 cm platta med hjälp av Lipofectamine Plus-reagens.
- Till 750 | il DMEM, tillsätt 10 | il Plus-reagens, 3,5 | ig av GPCR-cDNA (pMT4. Rho eller pcDNA 3,1. CCR5) innehållande den amber-stoppkodon vid en önskad position, 3,5 | ig av suppressor-tRNA-cDNA (pSVB.Yam) och 0,35 | ig av mutant amino-acyl-tRNA-syntetas cDNA för p-azido-L-fenylalanin (pcDNA.RS). Inkubera vid rumstemperatur i 15 min. Utför även en liknande transfektion med användning av vikt GPCR-cDNA (som inte innehåller ett amber-stoppkodon) för att tjäna som en kontroll. Lägg denna blandning till 750 pl av DMEM med 17 pl Lipofectamine. Efter jämvikt 15 min vid rumstemperatur, föratotal volym till 4 ml.
- Aspirera media på 10-cm platta, gäller transfektion blandningen till celler, och gå tillbaka till 37 ° C i 5% CO 2 atmosfär. Efter 4-6 timmar, komplettera celler med 4 ml DMEM innehåller 20% FBS och 1 mM AZF.
- Nästa dag, ersätta tillväxtmediet med DMEM innehållande 10% FBS och 0,5 mM AZF.
- Harvest celler 48 timmar efter transfektion, analysera uttryck eller gå vidare till fototvär eller märkningsförfaranden som beskrivs i följande avsnitt.
- Bekräfta uttryck av GPCR amber-mutant i närvaro av UAA i tillväxtmediet. Vi gör detta genom Western immunoblot upptäckt. Lyse cellpelleten i 1% (vikt / volym) dodecyl-β-D-maltosid (DDM) i 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl under 1 h vid 4 ° C. Centrifugera lysatet vid 16.000 x g och lösa supernatanten under reducerande betingelser med SDS-PAGE. Överföring till ett PVDF-membran och genomföra immunoblotanalys att upptäcka fullängdsreceptoruttryck med hjälp av ee 1D4 mAb (National Cell Culture Center), som känner igen en konstruerad epitop vid C-terminalen i receptorn. 31
2. Mappa en ligandbindningsställe Använda Riktade Photocrosslinking
- 48 h efter transfektion, aspirera media från celler och ersätta med 4 ml 1x Fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Återgå till 37 ° C under 15 min.
- Resuspendera cellerna med 1 x PBS och överför till en Falcon-rör. Centrifugera vid 1500 rpm under 2 min för att pelletera cellerna och aspirera supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i 1 x Hanks buffrad saltlösning innehållande 20 mM HEPES, pH 7,5, 0,2% BSA och den tritierade liganden vid mättnadsbindningskoncentration för den erfordrade längden av tid och temperatur för att se till receptor-ligand-komplexbildning.
- Överför cellsuspensionen till en 24-brunnars eller 96-brunnsplatta för fotoaktivering av AZF vid 365 nm (t.ex. använda en UV-A-lampa) under 15 min vid 4 ° C. Maintain plattan på is för att undvika prov värme och cell-lys.
- Överför cellerna till ett Eppendorf-rör, centrifugera för att pelletera celler, avlägsna supernatanten och fortsätt till analys. Pelletsen kan lagras vid -20 ° C för framtida användning.
- Återsuspendera cellpelletarna i lyseringsbuffert innehållande 1% (vikt / volym) DDM, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 och proteasinhibitorer. Efter 1-h inkubation vid 4 ° C, centrifugera cellysatet i 10 min vid 16000 x g, och för över supernatanten till ett nytt rör.
- Lägg 1D4 mAb-Sepharose 2B-harts till supematanten och inkubera över natten vid 4 ° C för att immunopurify GPCR med användning av den modifierade C-terminalen 1D4 mAb-epitopen. Nästa dag tvättas kulorna flera gånger med lyseringsbuffert. Eluera prover med 1% SDS vid 37 ° C under 1 timme med skakning.
- Överföring av en del av elueringsmedlet till en 15 ml ampull innehållande scintillationsvätska och räkna på en beta-scintillationsräknare för att kvantifiera mängden av specifik bindning av den tritierade liganden till the-receptorn.
- Lös resterande 1D4 mAb renad eluatet genom standard gelelektrofores. Vi använder en 4-12% SDS-PAGE-gel och därefter halvtorr överföring till ett PVDF-membran för immunoblotting. Vi inkluderar även ett körfält med standard protein stege för att vägleda visuell approximation av molekylvikt.
- Blockera PVDF-membranet med 5% mjölk i TBS buffert innehållande 0,05% Tween-20. Probe membranet att bekräfta fullängds receptoruttryck med 1D4 mAb följt av HRP-konjugerad anti-mus IgG sekundär antikropp.
- Behandla med förstärkt kemiluminescens (ECL)-reagens och exponera membranet för autoradiografi-film för att visualisera banden.
- Skär membran med ett rakblad för att separera varje prov körfält, följt av kapning vid specifika molekylviktsmarkörer. Överföringsmembran segment till flaskor innehållande scintillationsvätska. Kvantifiera mängden tritium i varje membransegmentet genom att räkna på en beta-scintillationsräknare.
- Identifiera de positivafototvärbinda med detekteringen av tritium vid den skenbara molekylvikt som är lika med summan av det av GPCR och liganden.
3. Riktade Epitop märkning och cellytan immunadsorberande analys (ELISA)
- 24 h efter transfektion, tvättas cellerna med 1 ml 1 x PBS och trypsinize med 1 ml 0,25% trypsin under 3 min. Komplettera med 9 ml DMEM innehållande 10% FBS och 0,5 mM AZF. Resuspendera celler och räkna celldensiteten. Vi använder en standard hemocytometer.
- Pre-behandling en hög bindande, clear-bottom 96-brunnar med 100 ml av 0,01 mg / ml poly-D-lysin per brunn. Inkubera under 30 minuter vid rumstemperatur, tvätta flera gånger med 1 x PBS och lufttorka.
- Plate 200 | il av de transfekterade cellerna vid en densitet av 6 x Oktober 4-08 x 10 4 celler / brunn på 96-brunnars platta och återvänder till 37 ° C i 5% CO 2 atmosfär.
- Nästa dag förbereda celler för märkning. Tvätta försiktigt tre gånger med 100 l / brunn 1x PBS to avlägsna eventuell AZF innehållande tillväxtmedia. Se till cellerna förblir vidhäftat till exempel genom användning av PBS innehållande Ca2 + och Mg2 +.
- Förbered 50-200 mikroM FLAG-triarylfosfin märkningsreagens i 1x HBSS / PBS från ett lager hålls vid 5-20 mM i PBS. Apply 60 ml till varje brunn (i triplikat för varje amber-mutant) och återgå till 37 ° C under 30 min till 4 tim. Upprätthålla ett antal brunnar utan etikett behandling i 1x HBSS / PBS. Inkludera även en vikt GPCR kontroll att jämföra med AZF-GPCR varianter.
- Tvätta cellerna tre gånger med 100 pl / brunn av blockeringsbuffert, BB (1x PBS, 0,5% BSA), för att avlägsna oreagerad etikett helt.
- Apply 100 | il / brunn av 4% paraformaldehyd (framställd från en 16% stock i 1x PBS) till cellerna. Inkubera under 20 minuter vid rumstemperatur. Tvätta tre gånger med BB.
- Utför standardcellytan ELISA-protokoll för att upptäcka märkt receptor och receptoruttryck. Inkubera med primär antikropp i 1,5 timmar på is följt av sekundär etttibody inkubation vid rumstemperatur under 1 timme.
- Addera 100 pl av anti-FLAG-M2-antikropp (t ex 1:2000 utspädning av antikropp gjord i BB) för att detektera FLAG peptid epitop av FLAG-triarylfosfin märkningsreagens. Också sond icke märkes behandlade brunnar som en negativ kontroll. Lägg anti-CCR5-2D7 (vi använder en 1:500 utspädning) antikropp till en separat uppsättning av brunnar för att bestämma vikt-eller AZF-GPCR cellytexpression.
- Tvätta cellerna tre gånger med BB, och inkubera med 100 | il av HRP-konjugerad anti-mus IgG sekundär antikropp (1:2000 utspädning).
- Tvätta försiktigt celler fem gånger med BB. Addera 50 pl detektions buffert: Amplex Red, 20 mM H 2 O 2, 1x PBS (1:10:90-förhållande) och inkubera i 15 min vid rumstemperatur. Samla spektraldata på en fluorescens flerbrunnsplattläsare vid λ ex = 530 och λ em = 590.
4. Bioorthogonal Fluorescerande märkning av en GPCR
- Lyse10 7 skördade celler som uttrycker wt eller AZF-Rhodopsin varianterna 1 ml solubiliserings-buffert innehållande 1% (vikt / volym) DM, 50 mM HEPES eller Tris-HCl, pH 6,8, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2 och proteasinhibitorer för en h vid 4 ° C. Centrifugera cellysatet vid 15.000 xg under 10 min och samla in supernatanten fraktionen.
- Tillsätt 100 l 1D4-mAb sepharose 2B-harts för att fånga receptorn med hjälp av konstruerade C-terminalen 1D4 epitop. Inkubera under 12 h vid 4 ° C. Tvätta hartset tre gånger med 0,1% (vikt / volym) DDM i 0,1 M natriumfosfatbuffert, pH 7,3.
- Lägg 0,1 mM fluorescein-fosfin i en total volym av 0,3 till 0,5 ml för att märka receptorn immobiliserad på immunaffinitetsmatris (1D4-mAb Sepharose 2B). Inkubera under 12 h vid rumstemperatur. Centrifugera och ta bort supernatanten. Tvätta hartset för att avlägsna oreagerad etikett.
- Eluera den märkta receptorn med 100 ml elueringsbuffert innehållande 0,1% (vikt / volym) DDM och 0,33 mg / ml nonapeptid (C9-peptiden mot 1D4 epitopen)i 2 mM fosfatbuffert, pH 6,0 genom inkubation på is under en timme.
- Lös märkta prover genom SDS-PAGE under reducerande betingelser. Tvätta geler kort i PBS och sedan visualisera märkning av AZF-GPCR av i-gel fluorescens. Använd till exempel en konfokala fluorescens scanner med en 488-nm våglängd laser för att upptäcka receptor modifierad med fluorescein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi använde onaturliga aminosyror mutagenes metod för att platsspecifikt introducera molekylära sonder till en GPCR med hjälp av amber kodon dämpning teknik. Systemet i Figur 1 visar de framträdande stegen i metoden och de olika tillämpningar av att införliva det mångsidiga UAA, p-azido-L-fenylalanin (AZF), i GPCRs. Uttryck av AZF-GPCR i däggdjursceller möjliggör riktade fototvär till ligander, och riktade peptid-epitop märkning eller fluorescerande ändringar i GPCR via bioorthogonal märkning kemier.
Den fototvär teknik kan användas för att undersöka de strukturella aspekterna av GPCR-ligand-komplex i levande celler (Figur 1a). Representativa data som erhållits från ett sådant experiment visas i figur 2. 19 Här har vi använt en radioaktivt märkt småmolekylära liganden tritierad maravirok, att identifiera dess bindnings site på CCR5. I detta exempel är UV-strålning på celler som uttrycker AZF-CCR5-varianter förinkuberades med tritierat maravirok resulterar i kovalent tvärbundna komplex som kan identifieras med användning av den känsliga radioaktiv etikett på liganden. Bland de flera positioner på CCR5 testas, I28azF och W86azF kunde fototvärbinda till tritium maraviroc som avbildas med betydligt högre scintillation räknas (röda staplar, bottenpanel, figur 2). Den vikt-receptom visade ingen tvärbindning till den radioaktiva liganden.
Bioorthogonal märknings kemier kan användas för att platsspecifikt modifiera AZF-GPCR-varianter. Vi använde Staudinger-Bertozzi ligation kemi för att märka två GPCR: CCR5-och rhodopsin hjälp fosfin derivat (schema 1). En strategi innebär den riktade epitop taggning av en GPCR i levande celler med hjälp av en peptid-konjugerad etikett (Figur 1b). Vi visar ett sådant experiment, i vilka en FLAG-peptide-triarylfosfin märkningsreagens används för att platsspecifikt och selektivt modifiera AZF-CCR5-varianter. I figur 3 visar vi representativa uppgifter från en känslig och flera steg ELISA upptäckt strategi som används för att identifiera positioner som är märkta med FLAG-peptiden. 30 Bland de positioner på CCR5 undersökts har samtliga AZF-CCR5 varianter uttrycks på cellytan (röd barer, Figur 3) och ungefär hälften av dem framgångsrikt genomgick riktade epitop tagging (blå staplar, figur 3). wt CCR5 tjänade som en negativ kontroll för epitop taggning, som uppvisas av avsaknaden av anti-FLAG-signal. I en alternativ strategi, märkt vi detergent-solubiliserade AZF-GPCR immobiliserad på en immunaffinitetsmatris, såsom anti-1D4 mAb konjugerat till Sepharose 2B-harts, med en fluorofor-konjugerad etikett (Figur 1c). Den i-gel-fluorescensbild som visas i figur 4 demonstrerar den framgångsrika fluorescerandemärkning av GPCR, rhodopsin, vid tre olika positioner som införlivats med AZF av Staudinger-Bertozzi ligation med hjälp av en fosfin derivat av fluorescein. 29 Som väntat wt rodopsin visade ingen bakgrunds märkning som ses av frånvaron av ett fluorescerande band vid den förväntade molekylvikten för receptorn.
Schema 1. Den Staudinger-Bertozzi ligeringsreaktionen mellan en triarylfosfin och en azid för bildning av en stabil amid bunden addukt.
Figur 1. Schema illustrerande ställesspecifik inkorporering av ett UAA (AZF) och dess tillämpningar för att s . Tudy GPCRs Platsspecifik UAA mutagenes åstadkoms genom samtransfektion av tre skilda plasmider i däggdjursceller som bär: en utvecklad ortogonal aminoacyl-tRNA-syntetas är specifik för UAA, en ortogonal suppressor-tRNA som känner igen ett amber-stoppkodon (UAG) och genen som kodar för GPCR innehåller en TAG-mutation vid ett önskat läge. Celler odlade i närvaro av UAA uttrycka en fullängds GPCR med ett platsspecifikt introducerade AZF. Dessa celler kan sedan vara (a) inkuberas med ligand och aktiverades med UV-ljus för att identifiera tvärbindningar mellan en GPCR och dess ligand, (b) användas för att sätesspecifikt epitop-taggen en GPCR i odling med en peptid-konjugerad kemisk etikett, eller (c) solubiliseras för att rena GPCR: er, vilka sedan bioorthogonally modifierade med en fluorescerande markör under förhållanden där receptorn är immobiliserad på en antikropp-konjugerad Sepharose-harts.0588/50588fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild
Figur 2. Riktad fototvär av en GPCR till en tritierad ligand. Visas här är de representativa resultat från ett tvärbindningsexperiment mellan AZF-CCR5-varianter och en tritiummärkt liten molekyl ligand, maraviroc. Topplatta: Västra immunoblot genereras efter ett typiskt experiment, visar uttrycket av de testade AZF-CCR5-varianter. De färgade segment markerar var PVDF membranet klipptes för scintillationsräkning och motsvarar de detekterade scintillation räknas plottade i stapeldiagrammet i den nedre panelen. Den röda segmentet representerar den förväntade molekylmassa (ca 40 kDa) av kovalenta tvärbundna komplex mellan receptorn och liganden. Denrefore skulle vi förvänta oss att detektera tritium i dessa segment endast när AZF införes vid en position i den receptor som är i omedelbar närhet av den ligandbindande fickan och kan bilda en kovalent tvärbindning med liganden. Omtryckt (anpassad) med tillstånd från Grunbeck, A., et al. Genetiskt kodade foto tvärbindare kartlägga bindningsstället hos en allosterisk drogen på en G-proteinkopplad receptor. ACS Chemical Biology 7, 967-972 (2012). Copyright (2012) American Chemical Society. Klicka här för att visa en större bild
Figur 3. ELISA-detektion av riktade epitop-taggning av en GPCR Topplatta:. Cellyteexpression av HEK 293T cells uttrycker AZF-CCR5-varianter och wt och skentransfekterade kontroller sonderade med anti-CCR5 mAb 2D7 med hela cell-baserade ELISA (röda staplar). Bottenplatta: Celler från samma transfektion behandlades med 0,05 mM FLAG-triarylfosfin i 1 h i levande celler och kvantifierades sedan genom efterföljande ELISA med användning av anti-FLAG-M2-mAb för att bestämma utsträckningen av peptid-epitop-märkning vid varje position (blå staplar) . Felstaplar representerar standardfelet för medelvärdet för två eller flera likadana datauppsättningar. Omtryckt (anpassad) med tillstånd från Naganathan, S., et al. Platsspecifik epitop taggning av GPCR genom bioorthogonal modifiering av en genetiskt kodad onaturlig aminosyra Biokemi DOI:. 10.1021/bi301292h (2013). Copyright (2013) American Chemical Society. Klicka här för att visa en större bild
Figur 4. Fluorescerande märkning av rhodopsin AZF införlivas på olika positioner. WT och AZF-rhodopsin mutanter immobiliserade på en immunoaffinitetsmatris märkt med fluorescein-fosfin. Renade prover separerade med 4-12% SDS-PAGE och i-gel-fluorescens bild som visas togs med en konfokal 488-nm laser fluorescens scanner med hjälp av ett emissionsfilter set optimerad för fluorescein detektering. Figur anpassad från Huber, T., et al. Bioorthogonal märkning av funktionella G-proteinkopplade receptorer på genetiskt kodade azidogrupper. lämnats in (2013). Klicka här för att visa en större bild
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver här en lämplig metod för platsspecifik inkorporering av en reaktiv sond, AZF, i GPCRs och demonstrera tre användbara tillämpningar av detta verktyg för att studera struktur och dynamik av GPCRs. Vår metod för att platsspecifikt införliva UAAs kringgår ett grundläggande problem med en alternativ strategi som bygger på kemisk märkning 32, 33 eller fästa fototvärbindare 34 till en enda tillgänglig cystein mutant. Även kemier som riktar cystein tiolgrupper har använts för att fästa fluorescerande prober, nödvändiggör en sådan strategi för generering av en cystein-fritt protein bakgrund. Detta kan vara begränsande eftersom alla GPCRs har mer än en cystein, av vilka många kan vara avgörande för att upprätthålla god receptorfunktionen. Därför är det är möjligt att införa ett UAA som är mottaglig för kemisk modifiering eller kan aktiveras av UV-ljus mycket attraktiva.
Den kovalenta reaktionen av en Photoactivatable tvärbindaren med en målmolekyl är beroende av avstånd och angränsande sidokedjor. Därför kan dessa sönder användas för att identifiera interaktioner som är inom ett visst avstånd från tvärbindningsmedlet, till exempel, är bensofenon-baserade tvärbindningsmedel föreslagits att ha en distansberoende 3 Å.. 35 Tidigare introducerade vi både AZF och BZF ett UAA innehåller en bensofenon reaktiv grupp, för att identifiera rester i en GPCR som ligger inom ett definierat avstånd från en fluorescein eller tritiummärkt ligand. 18, 19 Det allmänna tillämpligheten av denna teknik beror enbart på tillgången på sådana märkta ligander och generering av bärnsten mutanter av en mål-GPCR. Dessutom, i teorin denna riktade fototvär teknik kan tillämpas för att identifiera interaktioner mellan GPCRs och deras andra bindande partner, exempelvis en G-protein-eller β-arrestin. Data som erhållits från dessa tvärbindningsstudier kan användas för att skapa mer korrekta molecular modeller av GPCR signaleringskomplex.
Flera bioorthogonal kemiska reaktioner har beskrivits i litteraturen att möjliggöra platsspecifik modifiering av UAA rester. Den UAA, AcF till exempel har en keto grupp som kan delta i hydrazon eller oxim ligeringsreaktioner. 36, 37 Vi har tidigare jämfört ändring av ketogrupper och azidogrupper med biotinylerade och fluorescein konjugerade reagenser. 29 Våra observationer visade att azido grupp AZF är verkligen mer bioorthogonal än sin keto motsvarighet. Därför därefter fokuserat vi på användningen av Staudinger-Bertozzi ligering för att modifiera två GPCRs med en peptid epitopmärkning eller en fluorescerande märkning. Det är dock anmärkningsvärt att Staudinger-Bertozzi ligation uppvisar sub-stökiometriska 38 och dåliga kinetiska egenskaper märkning. Dessutom fosfiner är mycket mottagliga för luftoxidering. 25 Vi har observerat att den Staudinger-Bertozzi ligering uppnår endast 30% märkning efter inkubation i 12 timmar vid rumstemperatur. 29 Av dessa skäl har vi för närvarande utvärderar alternativa märkningskemi såsom CuAAC och SpAAC till plats-specifikt märka AZF-GPCR.
Om än nackdelarna med Staudinger-Bertozzi ligeringsreaktioner visar vi här att använda en live-cell-peptid-epitop tagg strategi för att identifiera positioner på ett mål GPCR som är tillgängliga för framtida fluorescerande märkning. Dessutom har denna epitop taggstrategi många andra användbara program, till exempel, att införa en epitopmärkning på en enda modifierad rest i motsats till att sätta in hela epitop genom att ersätta inhemska sekvenser. Denna egenskap är av särskild betydelse med GPCRs sedan modifiera längden och sekvensen av starkt konserverade slingsegment kan dramatiskt förändra funktion. Slutligen, vi illustrerade också här de proof-of-concept experiment för att märka GPCRs med fluoroforer, makung dem lämpliga för enda molekyl upptäckt experiment.
Sammanfattningsvis är AZF ett mångsidigt verktyg för studium av struktur och funktion av GPCR. Vi har visat att AZF är platsspecifikt införlivas GPCR uttrycks i däggdjursceller med användning av amber-kodonet skyddssystemet. Detta gör det möjligt för modifiering av en GPCR på bara en enda position. Strukturen och funktionen av den märkta receptorn kan sedan utvärderas antingen i den nativa plasmamembranmiljö eller i en tvättmedelslösning. Vi är nu redo att undersöka GPCR signaleringskomplex med flexibiliteten hos AZF sonden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar generöst stöd av flera stiftelser och filantropiska givare (se SakmarLab.org).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid pSVB. Yam | (Ye et al., 2008) | ||
| Plasmid pcDNA.RS for azF | (Ye et al., 2009) | ||
| Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5 | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position | ||
| HEK 293T cells | Adherent cells | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 10566 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14200 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Lipofectamine Plus | Invitrogen | Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015 |
|
| p-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | 6162 | |
| Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials | |||
| Maxima ML-3500S UV-A lamp | Spectronics Corporation | azF is activated by 365-nm light | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14065 | |
| HEPES | Irvine Scientific | 9319 | |
| Bovine serum albumin | Roche | 3117405001 | |
| Tritium-labeled ligand | From collaborator (Grunbeck et al., 2012) | ||
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| 1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166 | |
| NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Trans-Blot SD apparatus | Biorad | Apparatus for semi-dry transfer | |
| Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Non-fat powered milk | Fisher Scientific | NC9934262 | |
| Tween-20 | Aldrich | 274348 | |
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | Scintillation fluid |
| Scintillation vials | Fisher Scientific | 333726 | |
| LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter | Perkin Elmer | Beta-Scintillation counter | |
| Anti-rhodopsin 1D4 mAb | National Cell Culture Center | custom | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG | KPL, Inc. | 474-1806 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
| Hyblot CL AR film | Denville | E3018 | |
| Table 2. Targeted photocrosslinking materials | |||
| 0.25% Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
| FLAG-triarylphosphine | Sigma | GPHOS1 | |
| M2 FLAG mAb | Sigma | F1804 | |
| anti-CCR5 2D7 mAb | BD Biosciences | 555990 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| 96-well plate | Costar | 3601 | Clear bottom, high binding EIA/RIA |
| Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium) | Gibco | 14040 | |
| 16% Paraformaldehyde | EMS | 28908 | |
| HRP-conjugated | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| anti-rabbit IgG | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 | |
| Hydrogen peroxide | DE Healthcare Products | 97-93399 | |
| CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader | Perseptive Biosystems | ||
| Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials | |||
| Fluorescein-phosphine | (Huber et al., submitted 2012) | ||
| Nonapeptide (C9 peptide) | AnaSpec | 62190 | Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH |
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner | GE Healthcare | discontinued | Scanner with 488-nm wavelength laser |
| Table 4. Fluorescent labeling materials |
References
- Huber, T., Menon, S., Sakmar, T. P. Structural basis for ligand binding and specificity in adrenergic receptors: Implications for GPCR-targeted drug discovery. Biochemistry. 47, 11013-11023 (2008).
- Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current opinion in structural biology. 21, 567-572 (2011).
- Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Wu, B., et al. Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists. Science. 330, 1066-1071 (2010).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301, 964-967 (2003).
- Ye, S., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. The Journal of biological chemistry. 283, 1525-1533 (2008).
- Ye, S., Huber, T., Vogel, R., Sakmar, T. P. FTIR analysis of GPCR activation using azido probes. Nature chemical biology. 5, 397-399 (2009).
- Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464, 1386-1389 (2010).
- Singh, A., Thornton, E. R., Westheimer, F. H. The photolysis of diazoacetylchymotrypsin. The Journal of biological chemistry. 237, 3006-3008 (1962).
- Nakayama, T. A., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bovine rhodopsin determined by cross-linking using a photoactivatable analog of 11-cis-retinal. The Journal of biological chemistry. 265, 15762-15769 (1990).
- Chen, Q., Pinon, D. I., Miller, L. J., Dong, M. Molecular basis of glucagon-like peptide 1 docking to its intact receptor studied with carboxyl-terminal photolabile probes. The Journal of biological chemistry. 284, 34135-34144 (2009).
- Huang, K. S., Radhakrishnan, R., Bayley, H., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bacteriorhodopsin as studied by cross-linking using a photosensitive analog of retinal. The Journal of biological chemistry. 257, 13616-13623 (1982).
- Zoffmann, S., Turcatti, G., Galzi, J., Dahl, M., Chollet, A. Synthesis and characterization of fluorescent and photoactivatable MIP-1alpha ligands and interactions with chemokine receptors CCR1 and CCR5. Journal of medicinal chemistry. 44, 215-222 (2001).
- Janz, J. M., et al. Direct interaction between an allosteric agonist pepducin and the chemokine receptor CXCR4. Journal of the American Chemical Society. 133, 15878-15881 (2011).
- Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11020-11024 (2002).
- Hino, N., et al. Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid. Nature. 2, 201-206 (2005).
- Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50, 3411-3413 (2011).
- Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS chemical biology. 7, 967-972 (2012).
- Dunham, T. D., Farrens, D. L. Conformational changes in rhodopsin. Movement of helix f detected by site-specific chemical labeling and fluorescence spectroscopy. The Journal of biological chemistry. 274, 1683-1690 (1999).
- Maurel, D., et al. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nature. 5, 561-567 (2008).
- Huber, T., Sakmar, T. P. Escaping the flatlands: new approaches for studying the dynamic assembly and activation of GPCR signaling complexes. Trends in pharmacological sciences. 32, 410-419 (2011).
- Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
- Kiick, K. L., Saxon, E., Tirrell, D. A., Bertozzi, C. R. Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 19-24 (2002).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted [3 + 2] azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems. Journal of the American Chemical Society. 126, 15046-15047 (2004).
- Kolb, H. C., Sharpless, K. B. The growing impact of click chemistry on drug discovery. Drug discovery today. 8, 1128-1137 (2003).
- Huber, T., Botelho, A. V., Beyer, K., Brown, M. F. Membrane Model for the G-Protein-Coupled Receptor Rhodopsin: Hydrophobic Interface and Dynamical Structure. Biophys. J. 84, 2078-2100 (2004).
- Okada, T., et al. The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 Å crystal structure. J. Mol. Biol. 342, 571-583 (2004).
- Huber, T., Tian, H., Ye, S., Naganathan, S., Kazmi, M. A., Duarte, T., Sakmar, T. P. Bioorthogonal labeling of functional G protein-coupled receptors at genetically encoded azido groups. , submitted (2013).
- Naganathan, S., Ye, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Site-specific epitope tagging of GPCRs by bioorthogonal modification of a genetically-encoded unnatural amino acid. Biochemistry. , (2013).
- Molday, R. S., MacKenzie, D. Monoclonal antibodies to rhodopsin: characterization, cross-reactivity, and application as structural probes. Biochemistry. 22, 653-660 (1983).
- Gether, U., et al. Agonists induce conformational changes in transmembrane domains III and VI of the beta2 adrenoceptor. The EMBO journal. 16, 6737-6747 (1997).
- Hubbell, W. L., Altenbach, C., Hubbell, C. M., Khorana, H. G. Rhodopsin structure, dynamics, and activation: A perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking. Advances in Protein Chemistry; Membrane Proteins. 63, 243-290 (2003).
- Cai, K., Itoh, Y., Khorana, H. G. Mapping of contact sites in complex formation between transducin and light-activated rhodopsin by covalent crosslinking: use of a photoactivatable reagent. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4877-4882 (2001).
- Dorman, G., Prestwich, G. D. Benzophenone photophores in biochemistry. Biochemistry. 33, 5661-5673 (1994).
- Zhang, Z., et al. A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo. Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).
- Dirksen, A., Hackeng, T. M., Dawson, P. E. Nucleophilic catalysis of oxime ligation. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7581-7584 (2006).
- Yanagisawa, T., et al. Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification. Chemistry & biology. 15, 1187-1197 (2008).
