Summary
Nous génétiquement coder l'acide aminé non naturel, p-azido-L-phénylalanine à divers postes ciblés dans les RCPG et de montrer la polyvalence du groupe azido dans différentes applications. Ceux-ci comprennent une technologie de photoréticulation ciblée pour identifier des résidus dans la poche de liaison au ligand d'un GPCR, et spécifique à un site de modification bioorthogonal GPCR avec un peptide marqueur d'épitope ou une sonde fluorescente.
Abstract
Pour faciliter les études structurales et dynamiques du G récepteur couplé à la protéine (GPCR) des complexes de signalisation, de nouvelles approches sont nécessaires pour introduire des sondes ou des étiquettes informatives en récepteurs exprimés qui ne perturbent pas la fonction du récepteur. Nous avons utilisé la technologie de suppression de codon ambre génétiquement coder l'acide aminé non naturel, p-azido-L-phénylalanine (AZF) à différents postes ciblés dans GPCR hétérologue exprimées dans les cellules de mammifères. La polyvalence du groupe azido est illustré ici dans différentes applications d'étudier RCPG dans leur environnement cellulaire natif ou sous détergents conditions solubilisées. Tout d'abord, nous démontrons une technologie à base de cellules photo-réticulation ciblée pour identifier les résidus dans la poche de liaison au ligand de GPCR où un ligand à petite molécule marquée au tritium est réticulé à un acide azido aminé génétiquement codé. Nous démontrons alors modification spécifique au site des RCPG par le bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligature réactionstion qui vise le groupe azido en utilisant des dérivés de phosphine. Nous discutons d'une stratégie générale pour l'étiquetage ciblé peptide épitope de protéines membranaires exprimées dans la culture et sa détection en utilisant une approche basée sur ELISA cellule entière. Enfin, nous montrons que AZF-GPCR peuvent être étiquetés de manière sélective avec des sondes fluorescentes. Les méthodes sont discutés général, en ce qu 'ils peuvent en principe être appliquée à n'importe quelle position d'acide aminé dans toute GPCR exprimé pour interroger les complexes de signalisation actives.
Introduction
Heptahélice G récepteurs couplés aux protéines (RCPG) comprennent une superfamille de protéines de la membrane hautement dynamiques qui assurent la médiation des signaux extracellulaires importantes et variées. Dans le paradigme classique, l'activation du récepteur est couplé à des changements de conformation induites par le ligand. 1, 2 Les récents progrès dans la biologie structurale des RCPG ont permis de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la signalisation transmembranaire. 3-5 Cependant, pour comprendre avec plus de précision chimique du mécanisme fonctionnel et dynamique des structures de signalisation des RCPG, une boîte à outils d'approches sont nécessaires pour incorporer des sondes moléculaires et chimiques d'information pour interroger des complexes de signalisation actifs.
À cette fin, nous avons adapté une méthode de site spécifiquement introduire non ou minimalement sondes perturbateurs dans des récepteurs exprimés sur la base de contre nature acide aminé (SAU) de mutagenèse utilisant codon ambre technologie de suppression précédemment mis au point par Schultz et c. oworkers 6 Nous avons optimisé la méthode de mutagenèse SAU pour obtenir une expression à haut rendement et d'un système de mutagenèse pour les protéines telles que les GPCR, qui sont difficiles à exprimer dans des systèmes hétérologues plus que d'autres cellules de mammifères. L'utilisation d'un suppresseur orthogonal conçu ARNt et évolué aminoacyl-ARNt synthétase pour une SAU spécifique, nous place spécifiquement introduit SAU dans RCPG cibles exprimées. L'incorporation réussie de SAU, la p-acétyl-L-phénylalanine (ACF), p-benzoyl-L-phénylalanine (BZF), et le p-azido-L-phénylalanine (AZF) a été démontrée dans les RCPG modèle - rhodopsine humaine et le récepteur de la chimiokine CC, CCR5. 7, 8
En principe, une SAU peut être génétiquement encodés à n'importe quelle position dans la séquence de la protéine et cette propriété est un outil biochimique inestimable, car elle permet de numériser un seul codon d'un GPCR cible. Nous nous concentrons ici spécifiquement sur la polyvalence de la SAU, AZF, qui a un azi réactivefaire partie. En plus de servir en tant que l'infrarouge (IR) sonde unique, 8, 9 AZF peut aussi servir comme un agent de réticulation photo-activable par réaction avec des amines primaires aliphatiques voisins ou des atomes d'hydrogène. En outre, le groupe azido biologiquement inerte peut participer en tant que poignée chimique sélective en réactions de marquage bioorthogonal. Ici, nous présentons des exemples illustrant les applications utiles de l'incorporation spécifique du site de l'usine AZF en GPCR, comme photoréticulation ciblées pour piéger un complexe récepteur-ligand, et la modification des RCPG par bioorthogonal marquage d'épitope et les stratégies de marquage fluorescent.
Des réactifs photo-activables ont été utilisées pour étudier les systèmes biologiques depuis les années 1960. 10 Durant cette période, une abondance d'expériences de reticulation récepteur-ligand ont été rapportés pour étudier des complexes de GPCR, dont la plupart impliquaient l'utilisation de ligands de photo-affinité 11, 12 Cependant, ceux-ci. applications sont techniquement limités, car ils Requirla synthèse de l'e de ligands portant un groupe de reticulation. 13-15 En outre, avec le groupement réticulant dans le ligand, il est difficile d'identifier l'emplacement de la réticulation sur le GPCR. L'introduction du site-spécifique groupes photoréticulation que SAU en protéines en utilisant le codon ambre technologie de suppression est un progrès important. 16, 17 Nous avons développé une technique de photoréticulation pour identifier l'interface de fixation sur un récepteur qui est impliqué dans la formation d'un complexe récepteur-ligand dans cellules vivantes en introduisant des groupes photolabiles dans les RCPG. 18, 19 Nous décrivons ici le protocole expérimental et la méthode d'analyse des données pour l'application de cette technologie de photoréticulation ciblée pour identifier le site de liaison d'un ligand à petite molécule, le maraviroc tritiée, sur le CCR5. Ce procédé tire parti de la quantification précise de la poignée sur le ligand radioactif, en plus de conserver la structure chimique du ligand natif.
Des techniques basées sur la fluorescence en charge la compréhension précise de la base structurelle de l'activation du récepteur en sondant directement l'état conformationnel du récepteur. 20, 21 Cependant, les techniques qui possèdent la flexibilité d'introduire des marqueurs fluorescents dans les GPCR sont site spécifiquement limité. Nous sommes intéressés à utiliser des stratégies de modification chimique bioorthogonal pour faciliter la détection de molécule unique (SMD) de GPCR complexes de signalisation. 22 Le groupe azido peut participer à des chimies bioorthogonal tels que Staudinger-Bertozzi ligature, 23, 24 sans cuivre souche promu azoture cycloaddition alcyne (SpAAC) 25 et de l'azoture-alcyne cycloaddition catalysée par le cuivre (CuAAC). 26 Nous nous concentrons ici sur la réaction de ligature Staudinger-Bertozzi qui implique la réaction spécifique entre un azoture et une phosphine. Nous démontrons l'utilisation de deux dérivés de phosphine, les différents conjugués à un épitope de peptide (peptide FLAG) ou un marqueur fluorescent(Fluorescéine) afin de réaliser la modification spécifique d'un site de GPCR.
Nous avons déjà optimisé les conditions d'étiquetage spécifique du site de la rhodopsine variantes AZF en utilisant la structure cristalline aux rayons X et des simulations dynamiques de choisir des sites cibles qui sont exposés au solvant. 27, 28 Nous avons également illustré la faisabilité d'atteindre étiquetage sans fond par Staudinger- ligature Bertozzi. Nous démontrons ici 29 le mode opératoire général utilisé pour réaliser le marquage fluorescent d'un récepteur de détergent solubilisé qui est immobilisé sur une matrice d'immuno-affinité et ensuite visualisés par fluorescence dans le gel. En outre, nous démontrons une extension utile à cette stratégie d'étiquetage pour identifier les positions se prêtant à l'étiquetage sur un récepteur de structure inconnue, CCR5. Ceci est réalisé en utilisant une stratégie de marquage peptide-épitope cible qui repose sur une modification de bioorthogonal AZF-GPCR variants dans un format semi-haut débit à base de cellules. Cette 30méthode exploite les propriétés de détection multi-étapes d'un test ELISA de surface cellulaire pour surveiller les événements en matière d'étiquetage.
Les méthodes que nous discutons ici sont générales et peuvent en principe être appliquées à tout GPCR incorporé avec AZF utilisant le codon ambre technologie de suppression. Dans les protocoles présentés ici nous détaillons les étapes impliquées dans l'expression de cellules de mammifères avec des récepteurs intégrés SAU tels que AZF en utilisant le procédé de mutagenèse de l'acide aminé non naturel et leurs applications ultérieures pour faciliter les études structurales et dynamiques de GPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Une. Incorporation génétique spécifique de site d'acides aminés non naturels dans les RCPG
- Maintenir des cellules HEK293T dans du DMEM (4,5 g / L de glucose, de glutamine 2 mM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5%.
- Transfecter les cellules cultivées à 60-80% de confluence dans une plaque de 10 cm en utilisant le réactif Lipofectamine Plus.
- 750 ul de DMEM, ajouter 10 ul de réactif Plus, 3,5 ug d'ADNc de GPCR (pMT4. Rho ou pcDNA 3.1. CCR5) contenant le codon d'arrêt ambre dans une position souhaitée, 3,5 ug d'ARNt suppresseur ADNc (pSVB.Yam) et 0,35 pg ARNt synthétase mutante de l'ADNc de l'amino-acyl de p-azido-L-phénylalanine (pcDNA.RS). Incuber à température ambiante pendant 15 min. Également effectuer une transfection similaire en utilisant le poids GPCR ADNc (ne contenant pas de codon stop ambre) pour servir de contrôle. Ajouter ce mélange à 750 ul de DMEM avec 17 pi Lipofectamine. Après équilibration de 15 min à température ambiante, porter levolume total de 4 ml.
- Aspirer le milieu sur plaque de 10 cm, appliquer le mélange de transfection à des cellules, et le retour à 37 ° C dans 5% de CO2 atmosphère. Après 4-6 heures, compléter cellules avec 4 ml de DMEM contenant 20% de FBS et 1 mM AZF.
- Le jour suivant, remplacer le milieu de croissance avec du milieu DMEM contenant 10% de FBS et 0,5 mM AZF.
- Récupération des cellules 48 heures après la transfection, pour analyser l'expression ou de procéder à des procédures de photoréticulation ou d'étiquetage décrites dans les sections suivantes.
- Confirmer l'expression du mutant ambre GPCR en présence de la SAU dans le milieu de croissance. Nous faisons cela par détection Western blot. Lyse du culot cellulaire dans 1% (p / v) de dodécyl-β-D-maltoside (DDM) dans 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 100 mM pendant 1 heure à 4 ° C. Centrifuger le lysat à 16 000 xg et résoudre le surnageant dans des conditions réductrices par SDS-PAGE. Transférer sur une membrane de PVDF et effectuer des analyses d'immuno-empreinte pour détecter l'expression du récepteur de pleine longueur à l'aide ee 1D4 mAb (Cellule Nationale Culture Center), qui reconnaît un épitope d'ingénierie à l'extrémité C-terminale du récepteur. 31
2. Cartographie d'un site de liaison de ligand Utilisation ciblée Photoréticulation
- 48 heures après la transfection, les médias d'aspiration à partir de cellules et les remplacer par 4 ml 1x tampon phosphate salin (PBS). Revenir à 37 ° C pendant 15 min.
- Remettre en suspension les cellules avec PBS 1x et transférer dans un tube Falcon. Centrifuger à 1500 rpm pendant 2 min pour sédimenter les cellules et aspirer le surnageant.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans une solution saline tamponnée de Hank contenant 1x mM HEPES, pH 7,5, BSA à 0,2% et le ligand tritié à la concentration de saturation de liaison pour la longueur nécessaire de temps et de température pour assurer la formation du complexe récepteur-ligand 20.
- Transférer la suspension cellulaire à une plaque à 24 puits ou à 96 puits pour la photoactivation de la AZF à 365 nm (par exemple, en utilisant une lampe UV-A) pendant 15 min à 4 ° C. Maintain la plaque sur de la glace afin d'éviter le chauffage de l'échantillon et de la lyse cellulaire.
- Transférer les cellules à un tube Eppendorf, centrifugeuse pour sédimenter les cellules, éliminer le surnageant et procéder à l'analyse. Les pastilles peuvent être stockées à -20 ° C pour une utilisation ultérieure.
- Remettre en suspension les culots cellulaires dans du tampon de lyse contenant 1% (p / v) DDM, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 et des inhibiteurs de protéase. Après 1 heure d'incubation à 4 ° C, centrifuger le lysat cellulaire pendant 10 min à 16 000 xg, et transférer le surnageant dans un nouveau tube.
- Ajouter 1D4 résine mAb-Sepharose 2B au surnageant et laisser incuber pendant une nuit à 4 ° C à immunopurifier l'GPCR en utilisant l'extrémité C-terminale mAb 1D4 épitope d'ingénierie. Le lendemain, les billes laver plusieurs fois avec du tampon de lyse. Échantillons élue avec 1% de SDS à 37 ° C pendant 1 h sous agitation.
- Transférer une partie de l'éluant à un flacon contenant 15 ml de fluide de scintillation et de compter sur un compteur à scintillation bêta pour quantifier la quantité de liaison spécifique du ligand tritié aux erécepteur d'e.
- Résoudre le restant 1D4 mAb éluant purifié par électrophorèse sur gel standard. Nous utilisons un gel SDS-PAGE 4-12% puis transfert semi-sec sur une membrane de PVDF pour immunoblot. Nous incluons également une voie avec échelle de protéine standard pour guider approximation visuelle de poids moléculaire.
- Bloquer la membrane de PVDF avec 5% de lait dans du tampon TBS contenant 0,05% de Tween-20. Sonder la membrane afin de confirmer l'expression des récepteurs de pleine longueur avec l'AcM 1D4 suivi d'un anticorps secondaire anti-IgG de souris conjugué à la HRP.
- Traiter avec chimioluminescence amplifiée (ECL) de réactif et exposer la membrane à autoradiographie film visualiser les bandes.
- Couper la membrane avec une lame de rasoir pour séparer chaque voie échantillon, suivie d'une découpe au niveau des marqueurs spécifiques de poids moléculaire. Transférer les segments de membrane dans des flacons contenant un liquide de scintillation. Quantifier la quantité de tritium dans chaque segment de membrane par comptage sur un compteur à scintillation bêta.
- Identifier le positifune photo-détection avec le tritium à la masse moléculaire apparente égale à la somme de celle des GPCR et le ligand.
3. Ciblée épitope de l'étiquetage et de surface cellulaire immuno-enzymatique (ELISA)
- 24 heures après la transfection, laver les cellules avec 1 ml de PBS 1x et trypsiniser avec 1 ml de 0,25% de trypsine pendant 3 min. Compléter avec 9 ml de DMEM contenant 10% de FBS et 0,5 mM AZF. Remettre les cellules et compter la densité cellulaire. Nous utilisons un hémocytomètre standard.
- Pré-traiter, une plaque de 96 puits à fond transparent de haute liaison avec 100 ml de 0,01 mg / ml de poly-D-lysine par puits. Incuber pendant 30 min à température ambiante, laver à plusieurs reprises avec du PBS 1x et sécher à l'air.
- Plate 200 ul de cellules transfectées à une densité de 6 x 4 au 8 octobre x 10 4 cellules / puits à la plaque de 96 puits et retour à 37 ° C dans 5% de CO2 atmosphère.
- Le lendemain, préparer des cellules pour l'étiquetage. Lavez délicatement trois fois avec 100 pl / puits de PBS 1x to éliminer tout contenant un milieu de croissance AZF. S'assurer cellules restent collées, par exemple, à l'aide de PBS contenant Ca 2 + et Mg 2 +.
- Préparer 50-200 pM FLAG-triarylphosphinique réactif de marquage en 1x HBSS / PBS d'un stock maintenu à 5-20 mM dans du PBS. Appliquer 60 ml à chaque puits (en triple exemplaire pour chaque mutant ambre) et retour à 37 ° C pendant 30 min à 4 h. Maintenir un ensemble de puits sans traitement de l'étiquette en 1x HBSS / PBS. Inclure aussi un contrôle de GPCR de poids à comparer avec des variantes AZF-GPCR.
- Laver les cellules trois fois avec 100 pl / puits de tampon de blocage, BB (1 x PBS, 0,5% BSA), pour éliminer complètement l'étiquette qui n'a pas réagi.
- Appliquer 100 pl / puits de paraformaldéhyde 4% (préparé à partir d'un stock de 16% en 1x PBS) pour les cellules. Incuber pendant 20 min à température ambiante. Laver trois fois avec BB.
- Exécuter le protocole de test ELISA de surface cellulaire standard pour détecter le récepteur marqué et l'expression du récepteur. Incuber avec l'anticorps primaire pendant 1,5 heure sur la glace suivie d'un secondairetibody incubation à température ambiante pendant 1 heure.
- Ajouter 100 ul d'anticorps anti-FLAG M2 (par exemple, dilution 1:2000 de l'anticorps fabriqué en BB) pour détecter FLAG épitope peptidique du réactif de marquage FLAG-triarylphosphine. Sonder aussi non-étiquette puits traités comme contrôle négatif. Ajouter anti-CCR5 2D7 (nous utilisons une dilution 1:500) anticorps à un ensemble distinct de puits afin de déterminer en poids ou AZF-GPCR expression à la surface cellulaire.
- Laver les cellules trois fois avec du BB, et incuber avec 100 pi d'anticorps secondaire anti-IgG de souris conjugué à HRP (1:2000 dilution).
- Laver soigneusement les cellules cinq fois avec BB. Ajouter 50 ul de tampon de détection: Amplex Red, 20 mM de H 2 O 2, 1x PBS (rapport 1:10:90) et incuber 15 min à température ambiante. Recueillir des données spectrales sur un lecteur de plaques multi-puits fluorescence à λ = 530 ex et λ em = 590.
4. Bioorthogonal Marquage fluorescent d'un GPCR
- Lyse10 7 cellules récoltées exprimant poids ou AZF-rhodopsine variantes dans 1 ml de tampon de solubilisation contenant 1% (p / v) de DM, HEPES 50 mM ou de Tris-HCl, pH 6,8, NaCl 100 mM, CaCl2 1 mM et des inhibiteurs de protéase pour une hr à 4 ° C. Centrifuger le lysat cellulaire à 15 000 xg pendant 10 minutes et recueillir la fraction de surnageant.
- Ajouter 100 ul 1D4-mAb résine Sepharose 2B pour capturer récepteur utilisant le C-terminale 1D4 épitope ingénierie. Incuber pendant 12 heures à 4 ° C. Laver la résine à trois reprises avec 0,1% (p / v) DDM dans 0,1 M de tampon phosphate de sodium, pH 7,3.
- Ajouter 0,1 mM fluorescéine-phosphine dans un volume total de 0,3 à 0,5 ml d'étiqueter récepteur immobilisé sur la matrice d'immuno-affinité (mAb 1D4-Sepharose 2B). Incuber pendant 12 heures à température ambiante. Centrifugeuse et enlever le surnageant. Laver la résine pour enlever l'étiquette n'a pas réagi.
- Éluer le récepteur marqué avec 100 ml de tampon d'élution contenant 0,1% (p / v) de DDM et 0,33 mg / ml nonapeptide (C9 peptide contre l'épitope 1D4)dans un tampon phosphate 2 mM, pH 6,0 par incubation sur de la glace pendant 1 heure.
- Résoudre les échantillons marqués par SDS-PAGE dans des conditions réductrices. Laver gels brièvement dans du PBS, puis visualiser l'étiquetage des AZF-GPCR par fluorescence dans le gel. Par exemple, en utilisant un scanner à fluorescence confocal avec un laser de longueur d'onde 488 nm pour détecter les récepteurs modifiés avec de la fluorescéine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nous avons employé la méthode de mutagenèse d'acide aminé non naturel spécifique de site pour introduire des sondes moléculaires dans un GPCR en utilisant le codon ambre technologie de suppression. Le schéma de la figure 1 présente les étapes marquantes de la méthodologie et les différentes applications de l'intégration de la SAU polyvalent, p-azido-L-phénylalanine (AZF), dans les RCPG. Expression de AZF-GPCR dans des cellules de mammifères permet photoréticulation ciblé à des ligands, et le marquage peptide épitope ou modifications fluorescentes d'un GPCR cible via chimies d'étiquetage bioorthogonal.
La technique de photoréticulation peut être utilisé pour étudier les aspects structurels de complexes ligand-GPCR dans des cellules vivantes (Figure 1a). Des données représentatives obtenues à partir d'une telle expérience est montré à la figure 2. 19 Ici, nous avons utilisé un ligand marqué à petite molécule radioactive, le maraviroc tritiée, d'identifier son sit liaisone sur le CCR5. Dans cet exemple, une irradiation UV sur des cellules exprimant CCR5-AZF variants pré-incubé avec les résultats de maraviroc tritiée dans les complexes réticulés de manière covalente qui peuvent être identifiés à l'aide du marqueur radioactif sensible sur le ligand. Parmi les plusieurs positions sur CCR5 testé, I28azF et W86azF ont pu une photo-au maraviroc tritiée comme le montre avec les chiffres sensiblement plus élevés de scintillation (barres rouges, panneau inférieur, figure 2). Le récepteur de poids n'a montré aucune reticulation au ligand radioactif.
Chimies d'étiquetage bioorthogonal peuvent être utilisés pour modifier spécifiquement site variantes AZF-GPCR. Nous avons utilisé la ligature chimie Staudinger-Bertozzi pour marquer deux GPCR: CCR5 et rhodopsine utilisant des dérivés de phosphine (Schéma 1). Une stratégie implique le marquage d'épitope cible d'un GPCR dans des cellules vivantes à l'aide d'une étiquette de peptide conjugué (figure 1b). Nous démontrons une telle expérience, dans laquelle une de peptide FLAGe-triarylphosphinique réactif de marquage est utilisé pour spécifique au site et modifier sélectivement variantes AZF-CCR5. Dans la figure 3, nous affichons des données représentatives d'une stratégie de détection ELISA sensible et multi-étape permet d'identifier les postes qui sont marqués avec le peptide FLAG. 30 Parmi les positions sur CCR5 enquête, toutes les variantes AZF-CCR5 ont été exprimées à la surface des cellules (rouge barres, Figure 3) et environ la moitié d'entre eux a subi avec succès l'épitope cible de marquage (barres bleues, figure 3). poids CCR5 a servi de témoin négatif pour épitope marquage, présentée par l'absence de signal anti-FLAG. Dans une autre stratégie, nous avons appelé AZF-GPCR détergentes solubilisé immobilisés sur une matrice d'immuno-affinité, comme les anti-1D4 Acm conjugués à de la résine de sépharose 2B, avec un marqueur conjugué à un fluorophore (figure 1c). L'image de la fluorescence in-gel représenté à la figure 4 illustre le succès fluorescentl'étiquetage du GPCR, la rhodopsine, à trois positions différentes incorporés avec AZF par la ligation de Staudinger-Bertozzi l'aide d'un dérivé de phosphine de la fluorescéine. 29 Comme prévu, la rhodopsine de poids n'a montré aucun marquage d'arrière-plan tel que vu par l'absence d'une bande fluorescente à l'attendu poids moléculaire du récepteur.
Schéma 1. La réaction de ligation de Staudinger-Bertozzi entre une triarylphosphine et d'un azoture pour former un produit d'addition de liaison amide stable.
Figure 1. Schéma illustrant l'incorporation spécifique du site d'un SAU (AZF) et ses applications à l . Tudy GPCR SAU mutagenèse spécifique du site est réalisé par co-transfection de trois plasmides séparés dans des cellules de mammifères qui portent: un amino orthogonal acyl-ARNt synthétase évolué spécifique pour la SAU, un ARNt suppresseurs orthogonaux qui reconnaît un codon stop ambre (UAG) et le gène codant pour le GPCR contenant une mutation de TAG dans une position souhaitée. Les cellules cultivées en présence de la SAU expriment un GPCR pleine longueur avec un AZF site spécialement mis en place. Ces cellules peuvent ensuite être (a) à incuber avec un ligand et activées par la lumière UV pour identifier les liaisons de réticulation entre un RCPG et son ligand, (b) utilisés pour le site-spécifique épitope tag un GPCR en culture avec un marqueur chimique-peptide conjugué, ou (c) à purifier solubilisé GPCR, qui sont ensuite bioorthogonally modifiés avec un marqueur fluorescent dans des conditions où le récepteur est immobilisé sur une résine sépharose-anticorps conjugué.0588/50588fig1highres.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir l'image
Figure 2. Photoréticulation ciblée d'un GPCR à un ligand tritié. Affichés ici sont les résultats représentatifs d'une expérience de réticulation entre les variantes AZF-CCR5 et une petite molécule ligand marqué au tritium, le maraviroc. Panneau supérieur: Le Western blot généré après une expérience typique, montrant l'expression des variants AZF-CCR5 testés. Les segments colorés mettent en évidence lorsque la membrane de PVDF a été coupé pour le comptage à scintillation et correspondent aux chiffres de scintillation détectée tracées dans le graphique à barres dans le panneau inférieur. Le segment rouge représente la masse moléculaire attendue (environ 40 kDa) du complexe réticulé covalente entre le récepteur et le ligand. LaRefore, on pourrait s'attendre à détecter le tritium dans les segments uniquement lorsque AZF est introduit à une position dans le récepteur qui est à proximité immédiate de la poche de liaison au ligand et qui peut former une réticulation covalente avec le ligand. Reproduit (adapté) avec la permission de Grünbeck, A., et al. Codés génétiquement photo-cross-linkers carte du site de liaison d'un médicament allostérique sur un récepteur couplé à une protéine G. ACS Chemical Biology 7, 967-972 (2012). Droits d'auteur (2012) de l'American Chemical Society. Cliquez ici pour agrandir l'image
Figure 3. ELISA de détection de cible épitope marquage d'un panneau GPCR Top:. L'expression de surface cellulaire des cellules HEK 293T cells exprimant variantes AZF-CCR5 et les contrôles wt et maquettes transfectées sondées avec anti-CCR5 mAb 2D7 en utilisant l'ensemble ELISA à base de cellules (barres rouges). Panneau inférieur: Des cellules provenant de la même transfection ont été traités avec 0,05 mM de FLAG-triarylphosphine pendant 1 h dans des cellules vivantes, puis quantifiées par ELISA subséquent utilisant des anticorps anti-FLAG M2 mAb pour déterminer l'étendue de peptide-épitope de marquage dans chaque position (barres bleues) . Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne de deux ou plusieurs ensembles de données répliqués. Reproduit (adapté) avec la permission de Naganathan, S., et al. Épitope spécifique d'un site de marquage par modification de GPCR bioorthogonal d'un acide aminé non naturel codé génétiquement Biochemistry DOI:. 10.1021/bi301292h (2013). Droits d'auteur (2013) de l'American Chemical Society. Cliquez ici pour agrandir l'image
Figure 4. D'étiquetage fluorescent de la rhodopsine AZF incorporé à divers postes. WT et mutants AZF-rhodopsine immobilisés sur une matrice d'immuno-marqué à la fluorescéine-phosphine. Échantillons purifiés ont été séparés par 4 à 12% de SDS-PAGE et l'image de fluorescence dans le gel montré a été prise avec un 488-nm scanner de fluorescence confocale à balayage laser en utilisant un ensemble de filtres d'émission optimisés pour la détection de la fluorescéine. Figure adaptée de Huber, T., et al. Étiquetage bioorthogonal de G récepteurs couplés aux protéines fonctionnelles à des groupes azido codés génétiquement. soumis (2013). Cliquez ici pour agrandir l'image
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nous décrivons ici une méthode robuste pour incorporation spécifique du site d'une sonde réactive, AZF, en RCPG et démontrons trois applications utiles de cet outil pour étudier la structure et la dynamique des RCPG. Notre méthode de site spécifiquement incorporer SAU contourne un problème fondamental d'une stratégie alternative basée sur l'étiquetage chimique 32, 33 ou 34 photoréticulants fixer à un seul mutant cystéine accessible. Bien que, chimies qui ciblent des groupes thiol cysteine ont été utilisés pour fixer des sondes fluorescentes, une telle stratégie implique la génération d'une protéine de fond libres de cysteine. Ceci peut être limitative puisque tous les GPCR possèdent plus d'une cysteine, dont beaucoup peuvent être essentielles pour maintenir la fonction du récepteur correspondant. Par conséquent, la possibilité d'introduire une SAU qui se prête à une modification chimique ou peut être activé par la lumière UV est extrêmement attractif.
La réaction covalente d'un photoactivatable réticulant avec une molécule cible est dépendante de la distance et voisine des chaînes latérales. Par conséquent, ces sondes peuvent être utilisées pour identifier les interactions qui sont à une distance donnée de l'agent de réticulation, par exemple, des agents de réticulation à base de benzophénone sont suggéré d'avoir une dépendance à distance de 3 Å. 35 Auparavant, nous introduit à la fois AZF et BZF, un SAU contenant un groupe réactif de la benzophénone, pour identifier les résidus dans un RCPG qui sont à l'intérieur d'une distance définie à partir d'une fluorescéine ou marqué au tritium ligand. 18, 19 L'application générale de cette technique ne dépend que de la disponibilité de tels ligands marqués et la génération de mutants d'ambre d'un GPCR cible. En outre, en théorie, cette technique de photoréticulation ciblé peut être appliquée pour identifier les interactions entre les GPCR et leurs autres partenaires de liaison, par exemple une protéine G ou β-arrestine. Les données obtenues à partir de ces études de reticulation peuvent être utilisés pour créer mo plus précisemodèles moléculaire de complexes de signalisation des RCPG.
Plusieurs réactions chimiques bioorthogonal ont été décrits dans la littérature qui permettent la modification spécifique d'un site de résidus UAA. La SAU, ACF, par exemple, possède un groupe cétone qui peut participer à hydrazone ou oxime ligature réactions. 36, 37 Nous avons précédemment comparé la modification des groupes céto et des groupes azido avec des réactifs conjugués biotinylés et la fluorescéine. 29 Nos observations indiquent que l'azido groupe d'AZF est vraiment plus bioorthogonal que son homologue cétone. Par conséquent, nous ensuite mis l'accent sur l'utilisation de la ligature Staudinger-Bertozzi à modifier deux GPCR avec une étiquette d'épitope peptidique ou un marqueur fluorescent. Il est à noter, cependant, que la ligature Staudinger-Bertozzi présente sous-stoechiométriques 38 et pauvres propriétés cinétiques de l'étiquetage. En outre, les phosphines sont très sensibles à l'oxydation de l'air. 25 Nous avons observé que la Staudinger-Beligature rtozzi n'atteint 30% étiquetage après une incubation de 12 heures à la température ambiante. 29 Pour ces raisons, nous sommes actuellement à l'évaluation des chimies d'étiquetage alternatives telles que CuAAC et SpAAC de site spécifiquement étiqueter AZF-GPCR.
Quoique les inconvénients des réactions de ligature Staudinger-Bertozzi, nous démontrons ici l'utilisation d'un peptide-épitope de stratégie de marquage des cellules vivantes afin d'identifier des positions sur un GPCR cible qui sont accessibles pour l'avenir marquage fluorescent. De plus, cette stratégie de marquage d'épitope a de nombreuses autres applications utiles, telles que l'introduction d'un marqueur d'épitope d'un seul résidu modifié en contraste avec l'insertion de la totalité de l'épitope en remplaçant les séquences natives. Cette fonction est d'une importance spécifique avec GPCR depuis la modification de la longueur et la séquence des segments de boucle hautement conservées pourrait considérablement modifier la fonction. Enfin, nous avons également illustré ici les expériences de validation de concept à étiqueter GPCR avec des fluorophores, maroi leur convient pour des expériences de détection de molécule unique.
En conclusion, AZF est un outil polyvalent pour l'étude de la structure et la fonction des RCPG. Nous avons montré que AZF est spécifique au site incorporés dans les RCPG exprimés dans des cellules de mammifère en utilisant le codon ambre système de suppression. Cela permet la modification d'un GPCR à seulement une seule position. La structure et la fonction du récepteur marqué peuvent ensuite être évaluées, soit dans l'environnement natif de la membrane plasmique ou dans une solution détergente. Nous sommes maintenant prêts à étudier des complexes de signalisation des RCPG avec la souplesse de la sonde AZF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions le généreux soutien de plusieurs fondations et donateurs philanthropiques (voir SakmarLab.org).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid pSVB. Yam | (Ye et al., 2008) | ||
| Plasmid pcDNA.RS for azF | (Ye et al., 2009) | ||
| Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5 | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position | ||
| HEK 293T cells | Adherent cells | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 10566 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14200 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Lipofectamine Plus | Invitrogen | Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015 |
|
| p-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | 6162 | |
| Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials | |||
| Maxima ML-3500S UV-A lamp | Spectronics Corporation | azF is activated by 365-nm light | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14065 | |
| HEPES | Irvine Scientific | 9319 | |
| Bovine serum albumin | Roche | 3117405001 | |
| Tritium-labeled ligand | From collaborator (Grunbeck et al., 2012) | ||
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| 1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166 | |
| NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Trans-Blot SD apparatus | Biorad | Apparatus for semi-dry transfer | |
| Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Non-fat powered milk | Fisher Scientific | NC9934262 | |
| Tween-20 | Aldrich | 274348 | |
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | Scintillation fluid |
| Scintillation vials | Fisher Scientific | 333726 | |
| LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter | Perkin Elmer | Beta-Scintillation counter | |
| Anti-rhodopsin 1D4 mAb | National Cell Culture Center | custom | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG | KPL, Inc. | 474-1806 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
| Hyblot CL AR film | Denville | E3018 | |
| Table 2. Targeted photocrosslinking materials | |||
| 0.25% Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
| FLAG-triarylphosphine | Sigma | GPHOS1 | |
| M2 FLAG mAb | Sigma | F1804 | |
| anti-CCR5 2D7 mAb | BD Biosciences | 555990 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| 96-well plate | Costar | 3601 | Clear bottom, high binding EIA/RIA |
| Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium) | Gibco | 14040 | |
| 16% Paraformaldehyde | EMS | 28908 | |
| HRP-conjugated | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| anti-rabbit IgG | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 | |
| Hydrogen peroxide | DE Healthcare Products | 97-93399 | |
| CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader | Perseptive Biosystems | ||
| Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials | |||
| Fluorescein-phosphine | (Huber et al., submitted 2012) | ||
| Nonapeptide (C9 peptide) | AnaSpec | 62190 | Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH |
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner | GE Healthcare | discontinued | Scanner with 488-nm wavelength laser |
| Table 4. Fluorescent labeling materials |
References
- Huber, T., Menon, S., Sakmar, T. P. Structural basis for ligand binding and specificity in adrenergic receptors: Implications for GPCR-targeted drug discovery. Biochemistry. 47, 11013-11023 (2008).
- Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current opinion in structural biology. 21, 567-572 (2011).
- Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Wu, B., et al. Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists. Science. 330, 1066-1071 (2010).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301, 964-967 (2003).
- Ye, S., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. The Journal of biological chemistry. 283, 1525-1533 (2008).
- Ye, S., Huber, T., Vogel, R., Sakmar, T. P. FTIR analysis of GPCR activation using azido probes. Nature chemical biology. 5, 397-399 (2009).
- Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464, 1386-1389 (2010).
- Singh, A., Thornton, E. R., Westheimer, F. H. The photolysis of diazoacetylchymotrypsin. The Journal of biological chemistry. 237, 3006-3008 (1962).
- Nakayama, T. A., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bovine rhodopsin determined by cross-linking using a photoactivatable analog of 11-cis-retinal. The Journal of biological chemistry. 265, 15762-15769 (1990).
- Chen, Q., Pinon, D. I., Miller, L. J., Dong, M. Molecular basis of glucagon-like peptide 1 docking to its intact receptor studied with carboxyl-terminal photolabile probes. The Journal of biological chemistry. 284, 34135-34144 (2009).
- Huang, K. S., Radhakrishnan, R., Bayley, H., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bacteriorhodopsin as studied by cross-linking using a photosensitive analog of retinal. The Journal of biological chemistry. 257, 13616-13623 (1982).
- Zoffmann, S., Turcatti, G., Galzi, J., Dahl, M., Chollet, A. Synthesis and characterization of fluorescent and photoactivatable MIP-1alpha ligands and interactions with chemokine receptors CCR1 and CCR5. Journal of medicinal chemistry. 44, 215-222 (2001).
- Janz, J. M., et al. Direct interaction between an allosteric agonist pepducin and the chemokine receptor CXCR4. Journal of the American Chemical Society. 133, 15878-15881 (2011).
- Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11020-11024 (2002).
- Hino, N., et al. Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid. Nature. 2, 201-206 (2005).
- Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50, 3411-3413 (2011).
- Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS chemical biology. 7, 967-972 (2012).
- Dunham, T. D., Farrens, D. L. Conformational changes in rhodopsin. Movement of helix f detected by site-specific chemical labeling and fluorescence spectroscopy. The Journal of biological chemistry. 274, 1683-1690 (1999).
- Maurel, D., et al. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nature. 5, 561-567 (2008).
- Huber, T., Sakmar, T. P. Escaping the flatlands: new approaches for studying the dynamic assembly and activation of GPCR signaling complexes. Trends in pharmacological sciences. 32, 410-419 (2011).
- Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
- Kiick, K. L., Saxon, E., Tirrell, D. A., Bertozzi, C. R. Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 19-24 (2002).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted [3 + 2] azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems. Journal of the American Chemical Society. 126, 15046-15047 (2004).
- Kolb, H. C., Sharpless, K. B. The growing impact of click chemistry on drug discovery. Drug discovery today. 8, 1128-1137 (2003).
- Huber, T., Botelho, A. V., Beyer, K., Brown, M. F. Membrane Model for the G-Protein-Coupled Receptor Rhodopsin: Hydrophobic Interface and Dynamical Structure. Biophys. J. 84, 2078-2100 (2004).
- Okada, T., et al. The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 Å crystal structure. J. Mol. Biol. 342, 571-583 (2004).
- Huber, T., Tian, H., Ye, S., Naganathan, S., Kazmi, M. A., Duarte, T., Sakmar, T. P. Bioorthogonal labeling of functional G protein-coupled receptors at genetically encoded azido groups. , submitted (2013).
- Naganathan, S., Ye, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Site-specific epitope tagging of GPCRs by bioorthogonal modification of a genetically-encoded unnatural amino acid. Biochemistry. , (2013).
- Molday, R. S., MacKenzie, D. Monoclonal antibodies to rhodopsin: characterization, cross-reactivity, and application as structural probes. Biochemistry. 22, 653-660 (1983).
- Gether, U., et al. Agonists induce conformational changes in transmembrane domains III and VI of the beta2 adrenoceptor. The EMBO journal. 16, 6737-6747 (1997).
- Hubbell, W. L., Altenbach, C., Hubbell, C. M., Khorana, H. G. Rhodopsin structure, dynamics, and activation: A perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking. Advances in Protein Chemistry; Membrane Proteins. 63, 243-290 (2003).
- Cai, K., Itoh, Y., Khorana, H. G. Mapping of contact sites in complex formation between transducin and light-activated rhodopsin by covalent crosslinking: use of a photoactivatable reagent. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4877-4882 (2001).
- Dorman, G., Prestwich, G. D. Benzophenone photophores in biochemistry. Biochemistry. 33, 5661-5673 (1994).
- Zhang, Z., et al. A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo. Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).
- Dirksen, A., Hackeng, T. M., Dawson, P. E. Nucleophilic catalysis of oxime ligation. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7581-7584 (2006).
- Yanagisawa, T., et al. Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification. Chemistry & biology. 15, 1187-1197 (2008).
