Summary
نحن راثيا ترميز الأحماض الأمينية غير طبيعية، ف azido-L-ألانين في مختلف المناصب المستهدفة في GPCRs وتظهر براعة المجموعة azido في تطبيقات مختلفة. وتشمل هذه التكنولوجيا photocrosslinking المستهدفة لتحديد المخلفات في جيب ملزم يجند من النوع من الاختزال، ومواقع محددة من التعديل bioorthogonal GPCRs مع علامة الببتيد حاتمة أو التحقيق الفلورسنت.
Abstract
لتسهيل الدراسات البنيوية والديناميكية للG-البروتين يقترن مستقبلات (GPCR) يشير المجمعات، ثمة حاجة إلى نهج جديد لتقديم تحقيقات إعلامية أو التسميات في المستقبلات التي أعرب عنها التي لا التشويش على وظيفة مستقبلات. كنا العنبر التكنولوجيا رامزة لقمع وراثيا ترميز الأحماض الأمينية غير طبيعية، ف azido-L-ألانين (ايه زد اف) في العديد من المناصب المستهدفة في GPCRs أعرب heterologously في خلايا الثدييات. ويتضح براعة المجموعة azido هنا في التطبيقات المختلفة لدراسة GPCRs في البيئة الخلوية المحلية أو في ظل ظروف solubilized المنظفات. الأولى، ونحن يبرهن على وجود خلية مقرها استهداف التكنولوجيا photocrosslinking لتحديد المخلفات في جيب ملزم يجند من حيث النوع من الاختزال crosslinked صغيرة جزيء يجند المسمى التريتيوم لترميز وراثيا حمض azido الأمينية. نحن ثم إثبات التعديل في مواقع محددة من GPCRs من قبل bioorthogonal شتاودينغر-Bertozzi ربط REACنشوئها يستهدف مجموعة azido باستخدام المشتقات الفوسفين. نناقش استراتيجية عامة لاستهداف علامات الببتيد حاتمة للبروتينات غشاء أعرب في الثقافة والكشف عنها باستخدام نهج يستند ELISA خلية كاملة. أخيرا، وتبين لنا أن AZF-GPCRs يمكن الموسومة بشكل انتقائي مع تحقيقات الفلورسنت. المنهجيات التي تمت مناقشتها هي عامة، في أن يتمكنوا من حيث المبدأ يمكن تطبيقها على أي موقف الأحماض الأمينية في أي أعربت النوع من الاختزال لاستجواب المجمعات إشارات نشطة.
Introduction
تشمل Heptahelical G مستقبلات البروتين يقترن (GPCRs) والفصيلة من البروتينات الغشاء ديناميكية للغاية التي تتوسط إشارات خارج الخلية الهامة والمتنوعة. في النموذج الكلاسيكي، ويقترن تنشيط مستقبلات مع التغيرات متعلق بتكوين التي يسببها يجند. 1، 2 وقد وفرت التطورات الأخيرة في علم الأحياء الهيكلي للGPCRs البصيرة كبير على الآليات الجزيئية للإشارات عبر الغشاء. 3-5 ومع ذلك، ولكي نفهم بدقة أكبر الكيميائية آلية الوظيفية والهيكلية للديناميات النوع من الاختزال الإشارات، لا بد من أدوات نهج لدمج تحقيقات الجزيئية والكيميائية بالمعلومات لاستجواب المجمعات إشارات نشطة.
تحقيقا لهذه الغاية، ونحن تكييفها طريقة لموقع تحديدا إدخال غير الحكومية أو الحد الأدنى تحقيقات إقلاق إلى المستقبلات التي أعرب عنها على أساس الأحماض الأمينية غير طبيعية (UAA) الطفرات باستخدام العنبر كودون تكنولوجيا القمع رائدة من قبل شولتز وجoworkers. 6 ونحن الأمثل منهجية الطفرات UAA لتحقيق التعبير ذات الإنتاجية العالية ونظام الطفرات للبروتينات مثل GPCRs، التي يصعب التعبير عنها في أكثر الأنظمة الأخرى مغاير من خلايا الثدييات. باستخدام القامع المهندسة متعامد الحمض الريبي النووي النقال وتطورت أمينوأسيل-الحمض الريبي النووي النقال الزوج مخلقة لUAA محددة، قدمنا موقع UAAs تحديدا في GPCRs الهدف التعبير عنها. إدماج الناجح لUAAs، ف الاسيتيل-L-ألانين (ACF)، فقد ثبت ف بيروكسايد-L-ألانين (BzF)، وف azido-L-ألانين (ايه زد اف) في GPCRs نموذجنا - رودوبسين والبشرية CC مستقبلات chemokine، CCR5. 7، 8
من حيث المبدأ، وهي UAA يمكن ترميز وراثيا في أي موقف داخل تسلسل البروتين وهذه الخاصية هي أداة لا تقدر بثمن البيوكيميائية، لأنها تتيح احد كودون مسح وGPCR الهدف. ونحن نركز هنا على وجه التحديد على براعة من UAA، ايه زد اف، التي لديها رد الفعل عزيالقيام شاردة. بالإضافة إلى بمثابة الأشعة تحت الحمراء (IR) التحقيق فريدة من نوعها، 8، 9 ايه زد اف يمكن أيضا أن تكون بمثابة photoactivatable عبر رابط نتيجة للتفاعل مع الأمينات الأولية المجاورة أو الهيدروجين الأليفاتية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمجموعة azido خاملة بيولوجيا المشاركة بصفة انتقائية مقبض الكيميائية في التفاعلات وضع العلامات bioorthogonal. نحن هنا تقديم أمثلة توضح التطبيقات المفيدة التأسيس في مواقع محددة من AZF في GPCRs، مثل photocrosslinking تستهدف فخ مجمع مستقبلات يجند، وتعديل GPCRs بواسطة bioorthogonal علامات حاتمة واستراتيجيات وضع العلامات الفلورية.
وقد استخدمت الكواشف Photoactivatable لدراسة النظم البيولوجية منذ 1960s. (10) وفي هذه الفترة، تم الإبلاغ عن وفرة من التجارب يشابك مستقبلات يجند لدراسة المجمعات النوع من الاختزال، ومعظمها ينطوي على استخدام بروابط photoaffinity 11، 12 ومع ذلك، فإن هذه تطبيقات تقتصر من الناحية الفنية، لأنها تحتاج اليهاالتوليف (ه) من بروابط تحمل مجموعة يشابك. 13-15 وعلاوة على ذلك، مع شاردة crosslinker في يجند، فإنه يمثل تحديا لتحديد موقع تشعبي على النوع من الاختزال. إدخال موقع تحديدا الجماعات photocrosslinking كما UAAs إلى بروتينات باستخدام العنبر كودون تكنولوجيا القمع هو النهوض قيمة 16، 17 طورنا تقنية photocrosslinking التعرف على واجهة ملزمة للمستقبلات التي تشارك في تشكيل مجمع مستقبلات يجند في الخلايا الحية من خلال إدخال مجموعات عطوب بالضوء في GPCRs 18، 19 نحن هنا وصف بروتوكول تجريبي وطريقة تحليل البيانات لتطبيق هذه التكنولوجيا photocrosslinking المستهدفة لتحديد موقع ملزمة ليجند جزيء صغير، maraviroc معالج بالتريتيوم، على CCR5. تستفيد هذه الطريقة على تقدير دقيق للمقبض المشعة على يجند، بالإضافة إلى الإبقاء على التركيبة الكيميائية الأم ليجند.
التقنيات المعتمدة مضان دعم فهم دقيق لأساس الهيكلية للتنشيط مستقبلات عن طريق التحقيق مباشرة بتكوين الدولة من مستقبلات 20، 21 ومع ذلك، وتقنيات امتلاك المرونة اللازمة لإدخال العلامات الفلورية في GPCRs هي موقع على وجه التحديد محدودة. ونحن مهتمون في توظيف استراتيجيات التعديل الكيميائي لتيسير كشف bioorthogonal واحدة جزيء (SMD) من النوع من الاختزال المجمعات الإشارة. يمكن 22 المجموعة azido المشاركة في كيمياء bioorthogonal مثل شتاودينغر-Bertozzi ربط، 23، 24 خالية من النحاس وروجت سلالة أزيد- إضافة حلقية آلكاين (SpAAC) 25 والمحفزة النحاس وأزيد آلكاين إضافة حلقية (CuAAC) 26 ونحن نركز هنا على ربط رد فعل شتاودينغر-Bertozzi التي تنطوي على ردة فعل معينة بين أزيد والفوسفين. ونحن لشرح استخدام اثنين من المشتقات الفوسفين مختلفة، مترافق إلى حاتمة الببتيد (FLAG الببتيد) أو تسمية الفلورسنت(فلوريسئين) لتحقيق تعديل في مواقع محددة من GPCRs.
نحن الأمثل سابقا الظروف لوضع العلامات الخاصة بكل موقع من رودوبسين ايه زد اف المتغيرات باستخدام التركيب البلوري للأشعة السينية والمحاكاة الديناميكية لاختيار المواقع المستهدفة التي هي المذيبات يتعرض 27، 28 ونحن أيضا يتضح جدوى لتحقيق وضع العلامات خالية من الخلفية بواسطة شتاودينغر- Bertozzi ربط 29 نظهر هنا للإجراءات العامة المستخدمة لتحقيق وضع العلامات الفلورية من مستقبلات المنظفات solubilized الذي يجمد على مصفوفة immunoaffinity وبعد ذلك تصور من قبل مضان في هلام. بالإضافة إلى ذلك، علينا أن نبرهن على تمديد مفيدة عن هذه الاستراتيجية ووضع العلامات لتحديد مواقف قابلة للوضع العلامات على مستقبلات الهيكل غير معروف، CCR5. ويتم ذلك من يستخدم إستراتيجية علامات الببتيد حاتمة المستهدفة التي تعتمد على تعديل bioorthogonal من AZF-النوع من الاختزال المتغيرات في شكل شبه عالية الإنتاجية المستندة إلى الخلايا. هذا 30طريقة يستغل متعددة الخطوات خصائص الكشف عن ELISA سطح الخلية لرصد الأحداث ووضع العلامات.
المنهجيات نناقش هنا هي عامة ومن حيث المبدأ يمكن تطبيقه على أي النوع من الاختزال تدمج مع ايه زد اف باستخدام العنبر كودون تكنولوجيا القمع. في البروتوكولات المعروضة هنا نحن بالتفصيل الخطوات المتبعة في التعبير خلايا الثدييات مستقبلات تدمج مع UAAs مثل ايه زد اف باستخدام طريقة غير طبيعية من الأحماض الأمينية الطفرات وتطبيقاتها اللاحقة لتسهيل الدراسات البنيوية والديناميكية للGPCRs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التأسيس الوراثية موقع معين من الأحماض الأمينية غير طبيعي في GPCRs
- الحفاظ على خلايا HEK293T في DMEM (4.5 غرام / لتر من الجلوكوز، 2 مم الجلوتامين) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي.
- بالنقل الخلايا نمت لالتقاء 60-80٪ في لوحة 10 سم باستخدام Lipofectamine زائد كاشف.
- إلى 750 ميكرولتر DMEM، إضافة 10 ميكرولتر كاشف زائد، 3.5 ميكروغرام من [كدنا] النوع من الاختزال (pMT4. رو أو pcDNA 3.1. CCR5) التي تحتوي على العنبر وقف رامزة في الموضع المطلوب، 3.5 ميكروغرام من الحمض الريبي النووي النقال القامع كدنا] (pSVB.Yam) و 0.35 ميكروغرام من متحولة الأمينية أسيل الحمض الريبي النووي النقال مخلقة [كدنا] لف azido-L-ألانين (pcDNA.RS). يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. أداء أيضا ترنسفكأيشن مماثلة باستخدام وزن النوع من الاختزال كدنا] (لا تحتوي على وقف كودون العنبر) لتكون بمثابة السيطرة. إضافة هذا الخليط إلى 750 ميكرولتر من DMEM مع 17 ميكرولتر Lipofectamine. بعد توازنه 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وجلبالحجم الإجمالي إلى 4 مل.
- تطبيق وسائل الاعلام نضح في 10 سم لوحة، وخليط ترنسفكأيشن إلى الخلايا، والعودة إلى 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي. بعد 4-6 ساعة، تكملة الخلايا مع 4 مل DMEM تحتوي على 20٪ FBS و 1 ملي ايه زد اف.
- في اليوم التالي، واستبدال وسائط النمو مع DMEM تحتوي على 10٪ FBS و 0.5 ملي ايه زد اف.
- خلايا الحصاد 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، لتحليل التعبير أو الشروع في إجراءات photocrosslinking أو وضع العلامات الموضحة في المقاطع التالية.
- تأكيد التعبير عن العنبر متحولة النوع من الاختزال في وجود UAA في وسائل الإعلام النمو. ونحن نفعل ذلك من خلال الكشف طخة مناعية الغربية. ليز بيليه خلية في 1٪ (ث / ت) دوديسيل-β-D-مالتوزيد (DDM) في 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 100 ملي مول كلوريد الصوديوم لمدة 1 ساعة في 4 درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي لالمحللة في 16،000 XG وطاف حل في إطار الحد من الظروف التي كتبها SDS-PAGE. نقل إلى غشاء PVDF وإجراء تحليل لطخة مناعية للكشف عن كامل طول مستقبلات التعبير باستخدام ال31 ه 1D4 خريطة موقع (مركز زراعة الخلايا الوطني)، الذي يعترف حاتمة هندسيا في C-محطة من مستقبلات.
2. تعيين موقع ملزم يجند طريق المستهدفة Photocrosslinking
- 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، ووسائل الإعلام نضح من الخلايا واستبدالها مع 4 مل 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). العودة إلى 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- resuspend الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X ونقل إلى أنبوب فالكون. أجهزة الطرد المركزي في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة لخلايا بيليه ونضح طاف.
- resuspend الكرية خلية في التخزين المؤقت محلول الملح 1X هانك تحتوي على 20 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.5، 0.2٪ BSA ويجند معالج بالتريتيوم في تشبع تركيز ملزمة لطول المطلوب من الوقت ودرجة الحرارة لضمان تشكيل مستقبلات يجند المعقدة.
- نقل تعليق خلية إلى 24 أو 96 جيدا جيدا لوحة لتنشيط ضوئي من 365 نانومتر في ايه زد اف (مثل استخدام الأشعة فوق البنفسجية مصباح) لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. Maintaiن لوحة على الجليد لتجنب التدفئة العينة وتحلل الخلية.
- نقل الخلايا إلى أنبوب إيبندورف، أجهزة الطرد المركزي لخلايا بيليه، وإزالة طاف، والشروع في التحليل. ويمكن تخزين الكريات في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
- resuspend والكريات خلية في تحلل العازلة التي تحتوي على 1٪ (ث / ت) DDM، 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5 ومثبطات الأنزيم البروتيني. بعد حضانة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية، وأجهزة الطرد المركزي المحللة خلية لمدة 10 دقيقة في 16،000 x ج، ونقل طاف لأنبوب جديد.
- إضافة خريطة موقع 1D4-2B sepharose و الراتنج لطاف واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية لimmunopurify النوع من الاختزال باستخدام المهندسة C-محطة 1D4 خريطة موقع حاتمة. اليوم التالي تغسل حبات عدة مرات مع العازلة تحلل. عينات أزل مع 1٪ SDS عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع اهتزاز.
- نقل جزء من شاطف إلى 15 مل قارورة تحتوي على السائل التلألؤ والاعتماد على عداد التلألؤ بيتا لقياس كمية ملزمة محددة من يجند معالج بالتريتيوم إلى عشرةه مستقبلات.
- حل المتبقية 1D4 ماب شاطف تنقيته بواسطة معيار الكهربائي للهلام. نستخدم 4-12٪ هلام SDS-PAGE ثم نقل شبه جافة لغشاء PVDF لimmunoblotting. نحن تشمل أيضا حارة مع معيار البروتين سلم لتوجيه التقريب البصري من الوزن الجزيئي.
- منع غشاء PVDF مع الحليب 5٪ في المخزن TBS تحتوي على 0.05٪ توين 20. بحث الغشاء لتأكيد كامل طول مستقبلات التعبير مع 1D4 ماب تليها HRP، مترافق المضادة للماوس مفتش الأضداد الثانوية.
- علاج مع تعزيز لمعان كيميائي (ECL) كاشف وفضح غشاء لتصوير الإشعاع الذاتي لتصور فيلم العصابات.
- قطع الغشاء بشفرة حلاقة لفصل كل حارة العينة، تليها قطع عند علامات محددة الوزن الجزيئي. نقل شرائح الغشاء إلى قارورة تحتوي على السائل التلألؤ. تحديد كمية التريتيوم في كل جزء الغشاء عن طريق عد على عداد بيتا التلألؤ.
- تحديد إيجابيةphotocrosslink مع الكشف عن التريتيوم في الكتلة الجزيئية واضح يساوي مجموع تلك من النوع من الاختزال ويجند.
3. استهدفت توصيف حاتمة وخلية السطح انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA)
- 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وغسل الخلايا مع 1 مل برنامج تلفزيوني 1X ويعرض للتريبسين مع 1 مل 0.25٪ التربسين لمدة 3 دقائق. تكملة مع 9 مل DMEM تحتوي على 10٪ FBS و 0.5 ملي ايه زد اف. الخلايا resuspend وحساب كثافة الخلية. نستخدم عدادة الكريات القياسية.
- قبل علاج، واضحة من أسفل لوحة 96 جيدا عالية ملزم مع 100 مل من 0.01 ملغ / مل بولي-D-يسين لكل بئر. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ويغسل مرارا مع برنامج تلفزيوني 1X والهواء الجاف.
- لوحة 200 ميكرولتر من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل في مناطق ذات كثافة من 6 × 04 حتي 08 أكتوبر × 10 4 خلية / جيدا لوحة 96 جيدا والعودة إلى 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي.
- اليوم التالي إعداد الخلايا لوصفها. بلطف يغسل ثلاث مرات مع 100 ميكرولتر / جيد برنامج تلفزيوني 1X رس إزالة أي ايه زد اف تحتوي على وسائط النمو. ضمان بقاء الخلايا الالتزام، على سبيل المثال، باستخدام برنامج تلفزيوني يحتوي على الكالسيوم 2 + 2 + والمغنيسيوم.
- إعداد 50-200 ميكرومتر FLAG-triarylphosphine وضع العلامات الكاشف في 1X HBSS / برنامج تلفزيوني من مخزون الحفاظ على 5-20 ملم في برنامج تلفزيوني. تطبيق 60 مل إلى كل بئر (في ثلاث نسخ لكل متحولة العنبر) والعودة إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى 4 ساعات. الحفاظ على مجموعة من الآبار دون علاج التسمية في 1X HBSS / برنامج تلفزيوني. وتشمل أيضا التحكم بالوزن النوع من الاختزال للمقارنة مع المتغيرات AZF-النوع من الاختزال.
- غسل الخلايا 3 مرات مع 100 ميكرولتر / جيد من عرقلة العازلة، BB (1X PBS، 0.5٪ BSA)، لإزالة التسمية غير المتفاعل تماما.
- تطبيق 100 ميكرولتر / جيد من 4٪ بارافورمالدهيد (أعدت من الأسهم 16٪ في برنامج تلفزيوني 1X) إلى الخلايا. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يغسل ثلاث مرات مع BB.
- تنفيذ معيار بروتوكول ELISA سطح الخلية للكشف عن مستقبلات مستقبلات صفت والتعبير. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية ل1.5 ساعة على الجليد تليها الثانويةالحضانة tibody في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- إضافة 100 ميكرولتر من مكافحة FLAG M2 الأجسام المضادة (مثل 1:2،000 التخفيف من الأجسام المضادة المحرز في BB) للكشف عن FLAG الببتيد حاتمة من FLAG-triarylphosphine وضع العلامات كاشف. كما بحث غير تسمية الآبار تعامل على أنها سيطرة سلبية. إضافة لمكافحة CCR5 2D7 (نستخدم 1:500 تمييع) الأجسام المضادة لمجموعة منفصلة من الآبار لتحديد وزن أو AZF-النوع من الاختزال التعبير سطح الخلية.
- غسل الخلايا ثلاث مرات مع BB، واحتضان مع 100 ميكرولتر من برنامج الصحة الإنجابية، مترافق المضادة للماوس مفتش الأضداد الثانوية (1:2،000 التخفيف).
- غسل خلايا بعناية خمس مرات مع BB. إضافة 50 ميكرولتر العازلة الكشف: Amplex الأحمر، 20 ملي H 2 O 2، برنامج تلفزيوني 1X (نسبة 1:10:90)، واحتضان 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. جمع البيانات الطيفية على مضان متعددة كذلك قارئ لوحة في السابق λ = 530 م وλ = 590.
4. Bioorthogonal الفلورسنت وصفها من GPCR
- ليز10 7 خلايا تحصد معربا عن بالوزن أو AZF-رودوبسين المتغيرات في 1 مل الانحلالية العازلة التي تحتوي على 1٪ (ث / ت) DM، 50 ملي HEPES أو تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 6.8، 100 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 مم CaCl 2 ومثبطات الأنزيم البروتيني ل1 ساعة عند 4 درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي في الخلية المحللة في 15،000 x ج لمدة 10 دقيقة، وجمع الكسر طاف.
- إضافة 100 ميكرولتر 1D4-MAB الراتنج sepharose و 2B لالتقاط مستقبلات باستخدام المهندسة C محطة 1D4 حاتمة. احتضان لمدة 12 ساعة في 4 درجات مئوية. غسل الراتنج ثلاث مرات مع 0.1٪ (ث / ت) في DDM 0.1 M العازلة فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.3.
- إضافة 0.1 ملي فلوريسئين-الفوسفين في إجمالي حجم 0،3-0،5 مل لتسمية مستقبلات يجمد على مصفوفة immunoaffinity (1D4-MAB sepharose و 2B). احتضان لمدة 12 ساعة في درجة حرارة الغرفة. أجهزة الطرد المركزي وإزالة طاف. غسل الراتنج لإزالة التسمية غير المتفاعل.
- أزل مستقبلات المسمى مع العازلة 100 مل شطف تحتوي على 0.1٪ (ث / ت) DDM و 0.33 ملغ / مل ببتيد تساعي (C9 الببتيد ضد حاتمة 1D4)في 2 ملي العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 6.0 قبل الحضانة على الجليد لمدة 1 ساعة.
- لحل عينات صفت من قبل SDS-PAGE تحت ظروف الحد. غسل المواد الهلامية لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني ومن ثم تصور وسم ايه زد اف-النوع من الاختزال بواسطة مضان في هلام. على سبيل المثال، استخدام الماسح الضوئي مضان مبائر مع 488 نانومتر طول الموجة الليزر للكشف عن مستقبلات تعديل مع فلوريسئين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدمنا منهجية الطفرات الأحماض الأمينية غير طبيعي للموقع تحديدا تقديم تحقيقات الجزيئية إلى النوع من الاختزال باستخدام العنبر كودون تكنولوجيا القمع. المخطط في الشكل 1 يحدد الخطوات البارزة لمنهجية وتطبيقات مختلفة من دمج UAA تنوعا، ف azido-L-ألانين (ايه زد اف)، في GPCRs. التعبير عن AZF-GPCRs في خلايا الثدييات تمكن استهدفت photocrosslinking إلى بروابط، وتستهدف وضع علامات الببتيد حاتمة أو تعديلات لفلوري النوع من الاختزال كيمياء عبر وضع العلامات bioorthogonal.
تقنية photocrosslinking يمكن استخدامها للتحقيق في الجوانب الهيكلية للمجمعات GPCR يجند في الخلايا الحية (الشكل 1A). وأظهرت البيانات التي تم الحصول عليها من ممثل واحد من هذه التجربة في الشكل 2. 19 هنا استخدمنا المشعة المسمى يجند جزيء صغير، maraviroc معالج بالتريتيوم، لتحديد الاعتصام ملزمة لهاه على CCR5. في هذا المثال، الأشعة فوق البنفسجية على الخلايا معربا عن AZF-CCR5 المتغيرات المحتضنة مسبقا مع النتائج maraviroc معالج بالتريتيوم في المجمعات crosslinked تساهميا التي يمكن تحديدها باستخدام علامة مشعة الحساسة على يجند. من بين العديد من المناصب على CCR5 اختبارها، وكانت I28azF وW86azF قادرة على photocrosslink لmaraviroc معالج بالتريتيوم كما هو مبين مع أعلى بكثير التهم التلألؤ (الحانات الحمراء، لوحة القاع، الشكل 2). أظهرت مستقبلات بالوزن لا يشابك ليجند المشعة.
كيمياء وضع العلامات Bioorthogonal يمكن استخدامها لموقع تحديدا تعديل المتغيرات AZF-النوع من الاختزال. نحن العاملين في ربط الكيمياء شتاودينغر-Bertozzi لتسمية اثنين GPCRs: CCR5 ورودوبسين باستخدام المشتقات الفوسفين (مخطط 1). يتضمن استراتيجية واحدة للعلامات حاتمة المستهدفة من النوع من الاختزال في الخلايا الحية باستخدام التسمية الببتيد مترافق (الشكل 1B). علينا أن نظهر واحدة من هذه التجربة، التي لpeptid FLAGيستخدم البريد الإلكتروني triarylphosphine وضع العلامات كاشف للموقع تحديدا وتعديل انتقائي المتغيرات AZF-CCR5. في الشكل 3 نعرضها بيانات تمثيلية من استراتيجية الكشف عن ELISA حساسة ومتعددة الخطوة تستخدم لتحديد المواقف التي يتم تمييزها مع الببتيد FLAG 30 من بين المواقف بشأن CCR5 التحقيق فيها، وأعرب عن كافة المتغيرات AZF-CCR5 على سطح الخلية (أحمر الحانات، والشكل 3) ونصفها تقريبا خضع بنجاح حاتمة استهدفت الجغرافية (أشرطة زرقاء، الشكل 3). وزن CCR5 بمثابة السيطرة السلبية لحاتمة الجغرافية، التي أظهرتها عدم وجود إشارة لمكافحة FLAG. في استراتيجية بديلة، ونحن المسمى المنظفات solubilized AZF-GPCRs يجمد على مصفوفة immunoaffinity، مثل مكافحة 1D4 خريطة موقع مترافق إلى سيفاروز الراتنج 2B، مع تسمية fluorophore مترافق (الشكل 1C). الصورة في جل مضان هو مبين في الشكل 4 يوضح الفلورسنت ناجحةوضع العلامات من النوع من الاختزال، رودوبسين، في ثلاثة مواقع مختلفة تدمج مع AZF من ربط شتاودينغر-Bertozzi باستخدام مشتق من الفوسفين فلوريسئين 29 وكما كان متوقعا، أظهر رودوبسين بالوزن أي وضع العلامات الخلفية كما يراها عدم وجود الفرقة الفلورسنت في المتوقع الوزن الجزيئي للمستقبلات.
مخطط 1. وربط رد فعل شتاودينغر-Bertozzi بين triarylphosphine وأزيد لتشكيل مستقرة مرتبطة أميد معقد إضافي.
الشكل 1. مخطط يوضح التأسيس في مواقع محددة من UAA (ايه زد اف) وتطبيقاتها ليالي ويتحقق tudy GPCRs UAA الطفرات مواقع محددة من قبل المشارك ترنسفكأيشن من ثلاثة البلازميدات منفصلة في خلايا الثدييات التي تحمل: وتطورت الأمينية متعامد أسيل-الحمض الريبي النووي النقال مخلقة محددة لUAA، وهو الحمض الريبي النووي النقال القامع متعامد تعترف العنبر وقف كودون (UAG) ، والجينات التي تشفر النوع من الاختزال التي تحتوي على طفرة TAG في الموضع المطلوب. الخلايا المزروعة في وجود UAA تعبير عن GPCR طول كامل مع ايه زد اف عرض موقع على وجه التحديد. هذه الخلايا يمكن أن تكون ثم (أ) حضنت مع يجند وتفعيلها مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية لتحديد crosslinks بين النوع من الاختزال ويجند لها، (ب) تستخدم لموقع على وجه التحديد حاتمة علامة على النوع من الاختزال في الثقافة مع التسمية الكيميائية الببتيد مترافق، أو (ج) solubilized لتنقية GPCRs، والتي يتم بعد ذلك تعديل bioorthogonally مع تسمية الفلورسنت تحت ظروف حيث يجمد مستقبلات على الراتنج sepharose و الضد مترافق.0588/50588fig1highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر
الشكل 2. photocrosslinking المستهدفة من النوع من الاختزال ليجند معالج بالتريتيوم. عرضه هنا هي نتائج ممثلة من التجربة يشابك بين المتغيرات AZF-CCR5 وجزيء صغير يجند المسمى التريتيوم، maraviroc. اللوحة العلوية: إن طخة مناعية الغربية ولدت بعد تجربة نموذجية، والتي تبين التعبير عن اختبار المتغيرات AZF-CCR5. شرائح ملونة تسليط الضوء حيث تم قطع الغشاء PVDF لالتلألؤ العد وتتوافق مع التهم التلألؤ الكشف عن المرسومة في الرسم البياني شريط في أسفل لوحة. يمثل الجزء الأحمر في الكتلة الجزيئية المتوقع (حوالي 40 كيلو دالتون) من مجمع crosslinked التساهمية بين مستقبلات يجند و. الrefore، فإننا نتوقع لكشف التريتيوم في تلك الشرائح فقط عندما يتم إدخال ايه زد اف في موقف في مستقبلات التي هي على مقربة من الجيب ملزم يجند ويمكن تشكيل تشعبي التساهمية مع يجند. طبع (مقتبس) بإذن من Grunbeck، A.، وآخرون. المرمزة وراثيا الصورة عبر أدوات الربط خريطة الموقع ملزمة من المخدرات تفارغي على G-يقترن مستقبلات البروتين. البيولوجيا الكيميائية ACS 7، 967-972 (2012). حقوق التأليف والنشر (2012) الجمعية الكيميائية الأمريكية. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر
الرقم 3. الكشف عن ELISA المستهدفة حاتمة الجغرافية لوحة النوع من الاختزال الأعلى: التعبير سطح خلية كلوة الجنين البشري 293T سلليرة سورية معربا عن المتغيرات AZF-CCR5 والضوابط بالوزن وهمية transfected بحث مع مكافحة CCR5 خريطة موقع 2D7 باستخدام ELISA كله قائم على خلية (الحانات الحمراء). اللوحة السفلية: تم علاج خلايا من نفس ترنسفكأيشن مع 0.05 ملي FLAG-triarylphosphine لمدة 1 ساعة في الخلايا الحية ومن ثم كميا بواسطة ELISA اللاحقة استخدام الألغام المضادة للFLAG M2 ماب لتحديد مدى الببتيد حاتمة وضع علامات في كل موقف (أشرطة زرقاء) . أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط لاثنين أو أكثر من مجموعات البيانات المتماثلة. طبع (مقتبس) بإذن من Naganathan، S.، وآخرون. موقع محددة حاتمة وضع علامات على GPCRs قبل التعديل bioorthogonal من الأحماض الأمينية غير طبيعية المشفرة وراثيا الكيمياء الحيوية دوى: 10.1021/bi301292h (2013). حقوق التأليف والنشر (2013) الجمعية الكيميائية الأمريكية. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر
الشكل 4. وضع العلامات الفلورية من رودوبسين ايه زد اف تدرج في مناصب مختلفة. بالوزن وAZF-رودوبسين المسوخ يجمد على مصفوفة immunoaffinity المسمى مع فلوريسئين-الفوسفين. تم فصل عينات تنقيته من قبل 4-12٪ SDS-PAGE وتم التقاط الصورة في جل مضان أظهرت مع متحد البؤر مضان 488 نانومتر الليزر الماسح الضوئي باستخدام مجموعة تصفية الانبعاثات الأمثل للكشف عن فلوريسئين. الرقم مقتبس من هوبر، T.، وآخرون. وضع العلامات Bioorthogonal من G مستقبلات البروتين يقترن الوظيفية في المجموعات azido المشفرة وراثيا. المقدمة (2013). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن هنا وصف منهجية قوية لإدراجها في مواقع محددة من التحقيق على رد الفعل، ايه زد اف، في GPCRs وإظهار ثلاثة تطبيقات مفيدة من هذه الأداة لدراسة بنية وديناميات GPCRs. لدينا وسيلة لموقع تحديدا دمج UAAs تلتف مشكلة أساسية مع استراتيجية بديلة تقوم على وصفها كيميائيا 32، 33 أو ربط photocrosslinkers 34 إلى واحد يمكن الوصول إليها متحولة السيستين. وعلى الرغم من كيمياء التي تستهدف مجموعات ثيول السيستين استخدمت لنعلق تحقيقات الفلورسنت، ومثل هذه الاستراتيجية يتطلب توليد خلفية البروتين خالية من السيستين. هذا ويمكن الحد لأن كل GPCRs امتلاك السيستين أكثر من واحد، وكثير منها قد تكون ضرورية للحفاظ على وظيفة مستقبلات المناسبة. وبالتالي فإن الجدوى لإدخال UAA التي هي قابلة للتعديل كيميائية أو يمكن تفعيلها من خلال ضوء الأشعة فوق البنفسجية هي جذابة للغاية.
رد فعل التساهمية من فوتcrosslinker oactivatable مع جزيء الهدف يعتمد على المسافة والجانب المجاورة السلاسل. وبالتالي، يمكن استخدام هذه التحقيقات في تحديد التفاعلات التي تقع ضمن مسافة محددة من crosslinker، على سبيل المثال، اقترح crosslinkers القائم على بينزفينون أن يكون تبعية مسافة 3 Å 35 سابقا، قدمنا كلا ايه زد اف وBzF، وهو UAA تحتوي على مجموعة بينزفينون رد الفعل، لتحديد المخلفات في النوع من الاختزال التي تقع ضمن مسافة محددة من فلوريسئين أو التريتيوم المسمى يجند 18، 19 انطباق العام لهذه التكنولوجيا يعتمد فقط على توافر مثل هذه بروابط وصفت وتوليد المسوخ العنبر من GPCR الهدف. بالإضافة إلى ذلك، من الناحية النظرية يمكن تطبيقها هذه التقنية photocrosslinking المستهدفة لتحديد التفاعلات بين GPCRs والشركاء ملزمة الأخرى المترتبة عليها، مثل بروتين G أو β-arrestin. البيانات المكتسبة من هذه الدراسات يشابك يمكن استخدامها لخلق مو أكثر دقةنماذج من lecular النوع من الاختزال المجمعات الإشارة.
وقد وصفت العديد من التفاعلات الكيميائية bioorthogonal في الأدبيات التي تسمح لتعديل موقع معين من مخلفات UAA. وUAA، ACF، على سبيل المثال، تمتلك مجموعة كيتوني التي يمكن المشاركة في هيدرازون أو أوكسيم ربط التفاعلات 36، 37 ونحن في السابق مقارنة التعديل الجماعات كيتوني والجماعات azido مع الكواشف مترافق البيروكسيديز وفلوريسئين. أشار 29 ملاحظاتنا أن azido مجموعة من ايه زد اف هو حقا أكثر bioorthogonal من نظيره كيتوني لها. وبالتالي، ركزنا في وقت لاحق على استخدام ربط شتاودينغر-Bertozzi لتعديل اثنين GPCRs مع علامة الببتيد حاتمة أو تسمية الفلورسنت. من الجدير بالذكر، مع ذلك، أن ربط شتاودينغر-Bertozzi يسلك شبه متكافئة 38 والفقراء الخصائص الحركية للوضع العلامات. علاوة على ذلك، الفوسفين هي عرضة للأكسدة الهواء 25 وقد لاحظنا أن شتاودينغر كنربط rtozzi يحقق فقط 30٪ بعد وضع العلامات الحضانة لمدة 12 ساعة في درجة حرارة الغرفة 29 لهذه الأسباب، فإننا ندرس حاليا كيمياء وضع العلامات البديلة مثل CuAAC وSpAAC لموقع تحديدا تسمية AZF-GPCRs.
وإن كانت السلبيات من ردود الفعل ربط شتاودينغر-Bertozzi، علينا أن نظهر هنا استخدام استراتيجية علامات الببتيد حاتمة الخلية الحية لتحديد المواقف على GPCR المستهدفة التي يمكن الوصول إليها لوضع العلامات الفلورية المستقبل. بالإضافة إلى ذلك، فإن هذه الاستراتيجية علامات حاتمة والعديد من التطبيقات الأخرى المفيدة، مثل، وإدخال علامة حاتمة في بقايا احد تعديل على النقيض من إدراج حاتمة بأكمله عن طريق استبدال تسلسل الأصلية. هذه الميزة ذات أهمية خاصة مع GPCRs منذ تعديل طول وتسلسل شرائح حلقة حفظا للغاية يمكن أن يغير وظيفة بشكل كبير. أخيرا، ونحن أيضا يتضح هنا إثبات صحة مفهوم التجارب لتسمية GPCRs مع fluorophores، يا أماهالملك يجعلها مناسبة للواحدة جزيء التجارب الكشف.
في الختام، ايه زد اف هو أداة مرنة لدراسة بنية ووظيفة GPCRs. لقد أظهرنا أن ايه زد اف هو دمجها GPCRs أعرب في خلايا الثدييات باستخدام العنبر كودون نظام القمع على وجه التحديد الموقع. وهذا يسمح لتعديل من النوع من الاختزال في موقف واحد واحد فقط. ومن ثم يمكن تقييم هيكل وظيفة من وظائف مستقبلات المسمى إما في بيئة البلازما غشاء الأم أو في حل المنظفات. ونحن نستعد الآن للتحقيق في المجمعات إشارة النوع من الاختزال مع مرونة التحقيق ايه زد اف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر الدعم السخي من العديد من المؤسسات والجهات المانحة الخيرية (انظر SakmarLab.org).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid pSVB. Yam | (Ye et al., 2008) | ||
| Plasmid pcDNA.RS for azF | (Ye et al., 2009) | ||
| Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5 | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position | ||
| HEK 293T cells | Adherent cells | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 10566 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14200 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Lipofectamine Plus | Invitrogen | Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015 |
|
| p-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | 6162 | |
| Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials | |||
| Maxima ML-3500S UV-A lamp | Spectronics Corporation | azF is activated by 365-nm light | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14065 | |
| HEPES | Irvine Scientific | 9319 | |
| Bovine serum albumin | Roche | 3117405001 | |
| Tritium-labeled ligand | From collaborator (Grunbeck et al., 2012) | ||
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| 1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166 | |
| NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Trans-Blot SD apparatus | Biorad | Apparatus for semi-dry transfer | |
| Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Non-fat powered milk | Fisher Scientific | NC9934262 | |
| Tween-20 | Aldrich | 274348 | |
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | Scintillation fluid |
| Scintillation vials | Fisher Scientific | 333726 | |
| LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter | Perkin Elmer | Beta-Scintillation counter | |
| Anti-rhodopsin 1D4 mAb | National Cell Culture Center | custom | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG | KPL, Inc. | 474-1806 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
| Hyblot CL AR film | Denville | E3018 | |
| Table 2. Targeted photocrosslinking materials | |||
| 0.25% Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
| FLAG-triarylphosphine | Sigma | GPHOS1 | |
| M2 FLAG mAb | Sigma | F1804 | |
| anti-CCR5 2D7 mAb | BD Biosciences | 555990 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| 96-well plate | Costar | 3601 | Clear bottom, high binding EIA/RIA |
| Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium) | Gibco | 14040 | |
| 16% Paraformaldehyde | EMS | 28908 | |
| HRP-conjugated | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| anti-rabbit IgG | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 | |
| Hydrogen peroxide | DE Healthcare Products | 97-93399 | |
| CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader | Perseptive Biosystems | ||
| Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials | |||
| Fluorescein-phosphine | (Huber et al., submitted 2012) | ||
| Nonapeptide (C9 peptide) | AnaSpec | 62190 | Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH |
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner | GE Healthcare | discontinued | Scanner with 488-nm wavelength laser |
| Table 4. Fluorescent labeling materials |
References
- Huber, T., Menon, S., Sakmar, T. P. Structural basis for ligand binding and specificity in adrenergic receptors: Implications for GPCR-targeted drug discovery. Biochemistry. 47, 11013-11023 (2008).
- Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current opinion in structural biology. 21, 567-572 (2011).
- Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Wu, B., et al. Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists. Science. 330, 1066-1071 (2010).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301, 964-967 (2003).
- Ye, S., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. The Journal of biological chemistry. 283, 1525-1533 (2008).
- Ye, S., Huber, T., Vogel, R., Sakmar, T. P. FTIR analysis of GPCR activation using azido probes. Nature chemical biology. 5, 397-399 (2009).
- Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464, 1386-1389 (2010).
- Singh, A., Thornton, E. R., Westheimer, F. H. The photolysis of diazoacetylchymotrypsin. The Journal of biological chemistry. 237, 3006-3008 (1962).
- Nakayama, T. A., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bovine rhodopsin determined by cross-linking using a photoactivatable analog of 11-cis-retinal. The Journal of biological chemistry. 265, 15762-15769 (1990).
- Chen, Q., Pinon, D. I., Miller, L. J., Dong, M. Molecular basis of glucagon-like peptide 1 docking to its intact receptor studied with carboxyl-terminal photolabile probes. The Journal of biological chemistry. 284, 34135-34144 (2009).
- Huang, K. S., Radhakrishnan, R., Bayley, H., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bacteriorhodopsin as studied by cross-linking using a photosensitive analog of retinal. The Journal of biological chemistry. 257, 13616-13623 (1982).
- Zoffmann, S., Turcatti, G., Galzi, J., Dahl, M., Chollet, A. Synthesis and characterization of fluorescent and photoactivatable MIP-1alpha ligands and interactions with chemokine receptors CCR1 and CCR5. Journal of medicinal chemistry. 44, 215-222 (2001).
- Janz, J. M., et al. Direct interaction between an allosteric agonist pepducin and the chemokine receptor CXCR4. Journal of the American Chemical Society. 133, 15878-15881 (2011).
- Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11020-11024 (2002).
- Hino, N., et al. Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid. Nature. 2, 201-206 (2005).
- Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50, 3411-3413 (2011).
- Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS chemical biology. 7, 967-972 (2012).
- Dunham, T. D., Farrens, D. L. Conformational changes in rhodopsin. Movement of helix f detected by site-specific chemical labeling and fluorescence spectroscopy. The Journal of biological chemistry. 274, 1683-1690 (1999).
- Maurel, D., et al. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nature. 5, 561-567 (2008).
- Huber, T., Sakmar, T. P. Escaping the flatlands: new approaches for studying the dynamic assembly and activation of GPCR signaling complexes. Trends in pharmacological sciences. 32, 410-419 (2011).
- Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
- Kiick, K. L., Saxon, E., Tirrell, D. A., Bertozzi, C. R. Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 19-24 (2002).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted [3 + 2] azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems. Journal of the American Chemical Society. 126, 15046-15047 (2004).
- Kolb, H. C., Sharpless, K. B. The growing impact of click chemistry on drug discovery. Drug discovery today. 8, 1128-1137 (2003).
- Huber, T., Botelho, A. V., Beyer, K., Brown, M. F. Membrane Model for the G-Protein-Coupled Receptor Rhodopsin: Hydrophobic Interface and Dynamical Structure. Biophys. J. 84, 2078-2100 (2004).
- Okada, T., et al. The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 Å crystal structure. J. Mol. Biol. 342, 571-583 (2004).
- Huber, T., Tian, H., Ye, S., Naganathan, S., Kazmi, M. A., Duarte, T., Sakmar, T. P. Bioorthogonal labeling of functional G protein-coupled receptors at genetically encoded azido groups. , submitted (2013).
- Naganathan, S., Ye, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Site-specific epitope tagging of GPCRs by bioorthogonal modification of a genetically-encoded unnatural amino acid. Biochemistry. , (2013).
- Molday, R. S., MacKenzie, D. Monoclonal antibodies to rhodopsin: characterization, cross-reactivity, and application as structural probes. Biochemistry. 22, 653-660 (1983).
- Gether, U., et al. Agonists induce conformational changes in transmembrane domains III and VI of the beta2 adrenoceptor. The EMBO journal. 16, 6737-6747 (1997).
- Hubbell, W. L., Altenbach, C., Hubbell, C. M., Khorana, H. G. Rhodopsin structure, dynamics, and activation: A perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking. Advances in Protein Chemistry; Membrane Proteins. 63, 243-290 (2003).
- Cai, K., Itoh, Y., Khorana, H. G. Mapping of contact sites in complex formation between transducin and light-activated rhodopsin by covalent crosslinking: use of a photoactivatable reagent. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4877-4882 (2001).
- Dorman, G., Prestwich, G. D. Benzophenone photophores in biochemistry. Biochemistry. 33, 5661-5673 (1994).
- Zhang, Z., et al. A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo. Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).
- Dirksen, A., Hackeng, T. M., Dawson, P. E. Nucleophilic catalysis of oxime ligation. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7581-7584 (2006).
- Yanagisawa, T., et al. Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification. Chemistry & biology. 15, 1187-1197 (2008).
