Summary
在GPCR的各种目标的位置，我们基因编码的非天然氨基酸，对 - 叠氮基-L-苯丙氨酸，并显示在叠氮基团中的不同的应用程序的通用性。这些包括有针对性的光交联技术，以确定在一个G蛋白偶联受体的配体结合口袋的残基，和位点特异性生物正交的GPCR与肽表位标签或荧光探针的修饰。
Abstract
以促进G蛋白偶联受体（GPCR）信号复合物的结构和动力学研究，新的方法需要引入翔实的探针或标记入表达的受体不扰乱受体的功能。我们使用琥珀密码子抑制技术，基因编码的非天然氨基酸， 对 -叠氮基-L-苯丙氨酸（AZF）在异源表达在哺乳动物细胞中的GPCR各种目标的位置。叠氮基的通用性是这里示出在不同的应用程序来研究G蛋白偶联受体在其天然细胞环境或洗涤剂溶解的条件下进行。首先，我们展示了基于细胞的靶向光交联技术，以确定在G蛋白偶联受体，其中一个氚标记的小分子配体交联到一种基因编码的叠氮基的氨基酸的配体结合口袋的残基。然后，我们通过生物正交的Staudinger-Bertozzi教授结扎反应表明G蛋白偶联受体的位点特异性修饰化用膦衍生物为目标的叠氮基。我们将讨论用于使用全细胞系的ELISA方法在培养及其检测表达的膜蛋白的靶向肽的表位标记的一般策略。最后，我们证明了AZF-G蛋白偶联受体可以选择性标记的荧光探针。讨论的方法是通用的，因为它们可以在原则上被应用到任何的任何氨基酸位置表示的GPCR来询问活性信号传导复合物。
Introduction
七螺旋G蛋白偶联受体（GPCR）包括高度动态的膜蛋白介导的重要和多样的细胞外信号的超家族。在古典范式，受体激活耦接配体诱导的构象变化。1，在G蛋白偶联受体的结构生物学2最近的进步已经提供的跨膜信号转导的分子机制显著洞察力。3-5然而，为了理解具有更大的化学精度的作用机理和G蛋白偶联受体信号传导的结构动力学，办法的工具包，需要把信息分子和化学探针审问积极信号复合体。
为此，我们适应的方法来位点特异性地引入基于非天然氨基酸（UAA）的诱变使用琥珀密码子之前由舒尔茨和c开创抑制技术非或最低限度地扰动探测到表达的受体oworkers 6我们优化了UAA诱变的方法来实现对蛋白质，如G蛋白偶联受体，它们是难以表达，在大多数的异源系统比哺乳动物细胞等的高产量表达和诱变系统。使用正交设计的抑制性tRNA和进化氨酰-tRNA合成酶对用于特定UAA，我们位点特异性地引入UAAs中表达靶GPCR的。 UAAs的成功的掺入， 对 -乙酰基-L-苯丙氨酸（ACF）， 对 -苯甲酰基-L-苯丙氨酸（BZF），和p-叠氮基-L-苯丙氨酸（AZF）已被证明在我们的模型中的GPCR -视紫红质和人类CC趋化因子受体，CCR5 7,8
原则上，UAA可以基因编码的蛋白质序列中的任何位置，这个属性是一个非常宝贵的生化工具，因为它使一个目标GPCR的单密码子扫描。我们特别关注这里的UAA，AZF，其中有一个反应阿紫的多功能性做的部分。除了 作为一个独特的红外（IR）探测器，8,9 AZF也可以作为一个可光活化交联剂通过与邻近的伯胺或脂族氢的反应。此外，生物惰性叠氮基可以参与作为生物正交标记反应选择性的化学处理。在这里，我们提出了举例说明位点特异性结合AZF的有用的应用程序转换为G蛋白偶联受体，例如有针对性的光交诱捕受体 - 配体复合物，并通过G蛋白偶联受体抗原生物正交标记和荧光标记的策略进行修改。
光活化试剂已被用于研究生物系统自1960年以来，10在这期间，受体-配体的交联实验丰盈已报道研究G蛋白偶联受体复合物，其中大部分涉及利用光亲和配体。11,12然而，这些应用技术上的限制，因为它们必需参数E的合成配体带有交联基团的13-15再者，在配位体的交联基团，它是具有挑战性的，以确定在G蛋白偶联受体的交联点的位置。位点特异性地引入光交联基团如UAAs到使用琥珀密码子抑制技术的蛋白质是一种有价值的进步。16,17我们开发了一种光致交联的技术，以确定对涉及的受体-配体复合物的形成是一个受体的结合界面通过引入光不稳定基团引入GPCR的活细胞。18,19在这里，我们描述的实验方案和数据分析的方法，应用该目标光交联技术，以确定一个小分子配体的结合位点，氚标记马拉韦罗，对CCR5。该方法利用了对配体的放射性的手柄，除了保留配体的天然化学结构的精确定量。
基于荧光技术直接探测受体的构象状态支持受体激活的结构基础的精确理解。20,21然而，拥有技术引进荧光标记成G蛋白偶联受体的灵活性，位点特异性是有限的。我们感兴趣的是使用生物正交化学修饰策略，以促进G蛋白偶联受体信号复合物的单分子检测（SMD），22叠氮基可以参与生物正交化学物质，如施陶丁格-Bertozzi教授结扎，23，24无铜应变推动叠氮炔环加成反应（SpAAC）25和铜催化的叠氮-炔环加成反应（CuAAC）26在这里，我们重点放在涉及叠氮化物和磷化氢之间的特异性反应的施陶丁格-Bertozzi教授连接反应。我们展示了使用两种不同的膦衍生物，缀合的肽表位（FLAG肽）或荧光标记的（荧光素），以实现GPCR的位点特异性修饰。
我们以前优化的视紫红质AZF变种利用X-射线晶体结构和动态模拟来选择是溶剂暴露目标站点的站点特定标记的条件。27，28，我们也说明了实现无背景标签的可行性，施陶丁格- Bertozzi教授结扎29我们在这里展示用于实现该被固定在免疫亲和基质，并随后通过在凝胶荧光可视化的洗涤剂增溶的受体荧光标记的一般方法。此外，我们证明这个标签战略，以确定适合于对未知结构，CCR5的受体标记位置的有用的扩展。这是通过使用一个依赖于的AZF-GPCR在基于细胞的半高通量形式的变体生物正交变型的靶向肽的表位标记的战略。30这方法利用细胞表面的ELISA的多步骤的检测性能监视标记的事件。
我们在这里讨论的方法是通用的，原则上可以适用于使用琥珀密码子抑制技术与AZF注册成立的任何G蛋白偶联受体。在这里给出的细节，我们涉及使用非天然氨基酸的诱变方法和其后续的应用，以促进G蛋白偶联受体的结构和动力学研究UAAs如AZF结合受体的哺乳动物细胞表达的步骤的协议。
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Protocol
1。非天然氨基酸位点特异性基因掺入到G蛋白偶联受体
- 保持HEK293T细胞在DMEM（4.5 g / L的葡萄糖，2mM谷氨酰胺）中在37℃下在5％CO 2气氛中添加了10％胎牛血清（FBS）。
- 转染生长至在使用Lipofectamine试剂加有10厘米板60-80％汇合的细胞。
- 到750微升DMEM中，加入10微升加试剂，3.5微克的GPCR的cDNA（pMT4.的Rho或染pcDNA3.1。CCR5）含有琥珀终止密码子在所希望的位置上，3.5微克的抑制基因tRNA的cDNA（pSVB.Yam）和0.35微克的突变氨酰tRNA合成酶的cDNA 的 p-叠氮基-L-苯丙氨酸（pcDNA.RS）。在室温下孵育15分钟。也可以执行使用重量GPCR的cDNA（不含有琥珀终止密码子），以用作对照类似转染。将此混合物750μLDMEM与17μL脂质体。平衡15分钟后在室温下，使总体积〜4毫升。
- 吸出介质上10厘米的板，采用转染混合物到细胞中，并返回到37℃，在5％CO 2气氛中。后4-6小时，补充细胞用4ml的DMEM含20％FBS和1 mM的AZF。
- 第二天，用含有10％FBS和0.5mM AZF DMEM更换生长培养基。
- 收获细胞48小时后转染，分析表达或继续在下面的章节中描述光交联或标签的程序。
- 确认在UAA的生长培养基中存在的G蛋白偶联受体琥珀突变体的表达。我们通过免疫印迹检测。溶胞物，以1％的细胞沉淀物（重量/体积）十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）在20mM的Tris-HCl，pH值7.5，100mM NaCl的1小时，在4℃下离心溶胞产物以16,000×g离心并解决下通过SDS-PAGE在还原条件上清液。转移到PVDF膜上，并进行免疫印迹分析使用日检测全长受体的表达Ë1D4单抗（国家细胞培养中心），其中确认在受体的C-末端的工程表位。31
2。映射一个配体结合网站使用定向光交
- 48小时转染后，从细胞中吸出介质，并替换为4毫升1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。返回到37°C下15分钟。
- 重悬细胞用1×PBS和转移到Falcon管中。离心机在1500 rpm离心2分钟以沉淀细胞并吸出上清液。
- 重悬含有20mM HEPES，pH为7.5，0.2％BSA和氚化的配体在饱和浓度的结合的时间和温度所需要的长度，以确保受体 - 配体复合物形成的细胞沉淀物在1×Hank氏缓冲盐溶液。
- 细胞悬液转移到24孔或96孔板的AZF的光活化在365nm下在4℃下（ 例如，使用UV-A灯）15分钟Maintain中板置于冰上，以避免样品加热和细胞裂解。
- 将细胞转移到Eppendorf管中，离心沉淀细胞，除去上清液并进行分析。这些颗粒可以被储存在-20℃下以供将来使用。
- 重悬含1％（重量/体积）的DDM，20mM的Tris-盐酸，pH为7.5和蛋白酶抑制剂的细胞沉淀中的裂解缓冲液。经过1小时温育在4℃下，离心分离细胞裂解物对于以16,000×g离心10分钟，并且将上清液转移到新管中。
- 添加1D4单克隆抗体 - 琼脂糖树脂2B向上清液孵育过夜，在4℃使用改造的C-末端1D4单克隆抗体的表位至immunopurify的G蛋白偶联受体。第二天，用裂解缓冲液洗珠数次。洗脱的样品用1％SDS在37℃下进行1小时振荡培养。
- 洗脱剂的一部分转移到15ml小瓶中含闪烁液并计数在β闪烁计数器来量化氚标记的配体的特异性结合量以日Ë受体。
- 解决剩余1D4单克隆抗体纯化洗脱液用标准凝胶电泳。我们使用了4-12％SDS-PAGE凝胶，然后半干转移到PVDF膜用于免疫印迹分析。我们还包括了与标准蛋白质阶梯车道引导分子量的视觉逼近。
- 用含有0.05％Tween-20的5％牛奶的TBS缓冲液阻断PVDF膜上。探测膜，以确认全长受体表达与1D4单克隆抗体随后HRP-偶联的抗小鼠IgG第二抗体。
- 治疗用增强的化学发光（ECL）试剂和暴露膜放射自显影胶片，以可视化的频带。
- 切膜用刀片来分隔每个样品泳道，接着通过切割在特定分子量标记物。转移膜段含闪烁液小瓶。通过计数β-闪烁计数器定量在每个膜段氚的量。
- 标识正面photocrosslink与氚的表观分子量等于该G蛋白偶联受体和配体的总和的检测。
3。有针对性的抗原表位标记和细胞表面酶联免疫吸附试验（ELISA）
- 24小时转染后，洗涤细胞，用1ml的1×PBS和胰蛋白酶消化，用1ml 0.25％胰蛋白酶3分钟。补充用9ml的DMEM含有10％FBS和0.5mM AZF。重悬细胞并计数细胞密度。我们使用标准的血球。
- 预治疗的高结合，透明底的96孔板中，用100ml的0.01毫克/毫升，每孔聚-D-赖氨酸。温育30分钟，在室温下用1×PBS和风干反复洗涤。
- 板200微升转染细胞在6×10 4的密度- 8×10 4个细胞/孔的96孔板中，并返回到37℃，在5％CO 2气氛中。
- 第二天准备的细胞进行标记。轻轻洗涤三次，用100μl/孔的1×PBS吨Ø删除任何AZF含有生长培养基。确保细胞仍附着，例如，通过使用PBS中含有的Ca 2 +和Mg 2 +。
- 从维持在5-20毫米PBS股票准备50-200微米旗 - 三芳基膦标记试剂在1x HBSS / PBS中。申请60毫升到每个孔中（一式三份对各琥珀突变体），并返回到37℃，进行30分钟至4小时。保持一个集水井没有在1x HBSS / PBS标签处理。还包括G蛋白偶联受体重量控制AZF-G蛋白偶联受体的变体来比较。
- 用100μl/孔的封闭缓冲液洗涤细胞3次，BB（1×PBS，0.5％BSA），以完全除去未反应的标记。
- 应用100μl/孔的4％多聚甲醛（从在1x PBS中的16％的库存制备）到细胞中。孵育20分钟，在室温下进行。带BB洗三次。
- 执行标准细胞表面的ELISA方法检测标记的受体和受体的表达。孵育一抗1.5小时冰上其次是次要的tibody在室温下孵育1小时。
- 加入100μl抗FLAG M2抗体（ 如抗体1:2000稀释的BB制造）检测FLAG-三芳基膦标记试剂的FLAG肽抗原表位。还探讨非标签处理的孔作为阴性对照。添加抗CCR5 2D7（我们用1:500稀释）抗体，以一个单独的集水井，以确定重量或AZF-GPCR细胞表面表达。
- 带BB洗涤细胞3次，并孵育用100μlHRP-偶联的抗小鼠IgG第二抗体（1:2000稀释）的。
- 小心地用BB洗涤细胞五次。加入50μL检测缓冲液：红色的Amplex，20 mM的H 2 O 2，1×PBS（1:10:90的比例），并孵育15分钟，在室温下。收集的荧光多孔板读数器的光谱数据在λEX = 530和λ 发射 = 590。
4。一个G蛋白偶联受体的生物正交荧光标记
- 裂解10 7收获的细胞中表达（重量）或AZF-视紫红质中含有1％1毫升溶解缓冲液变体（重量/体积）DM，50mM的HEPES或Tris-盐酸，pH为6.8，100 mM氯化钠，1mM的氯化钙和蛋白酶抑制剂为1小时，在4℃下离心细胞裂解物在15,000×g离心10分钟，收集上清液部分。
- 加入100μl1D4-单克隆抗体琼脂糖凝胶2B树脂使用设计的C末端1D4表位捕捉受体。孵育12小时，在4℃下用0.1％的洗涤树脂3次（重量/体积）的DDM在0.1M磷酸钠缓冲液，pH 7.3。
- 加入0.1毫米的荧光素膦0.3总体积 - 0.5毫升到标签受体固定在免疫亲和基质（1D4-单抗琼脂糖2B）。孵育12小时，在室温下进行。离心机除去上清液。洗涤树脂以除去未反应的标签。
- 洗脱标记的受体与含0.1％（重量/体积）的DDM和0.33毫克/毫升的九肽（C9对1D4表位肽）100毫升洗脱缓冲液在2 mM磷酸盐缓冲液，pH 6.0通过在冰上温育1小时。
- 在还原条件下解决标记的样品进行SDS-PAGE。在短暂的PBS洗凝胶，然后通过凝胶内的荧光可视化AZF-G蛋白偶联受体的标签。例如，使用共聚焦荧光扫描仪具有488纳米波长的激光来检测受体修饰与荧光素。
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Representative Results
我们所用的非天然氨基酸的诱变方法，以位点特异性地引入分子探针进入的GPCR使用琥珀密码子抑制技术。 图1中的方案概述的显着的步骤的方法，并结合了多功能UAA， 对-叠氮基-L-苯丙氨酸（AZF），进GPCRs的各种应用。的AZF-G蛋白偶联受体在哺乳动物细胞中的表达可让有针对性的光交联配体，并通过生物 正交标记化学针对性的肽表位标记或G蛋白偶联受体的荧光修改。
光交联技术也可以用来研究活细胞中G蛋白偶联受体-配体复合物（ 图1a）的结构方面。从一个这样的实验中获得的代表性数据示于图2。19在这里，我们使用了放射性标记的小分子配体，氚标记马拉韦罗，以确定其结合仰卧E在CCR5。在这个例子中，在细胞中表达AZF-CCR5 UV照射变体预培养用氚标记马拉韦罗结果在共价交联的复合物，可使用敏感的放射性标记的配体来识别。其中包括对CCR5测试的几个位置，I28azF和W86azF能够photocrosslink以氚化马拉韦罗作为描绘的显著更高的闪烁计数（红柱，底部面板， 图2）。该重量受体没有表现出交联的放射性配体。
生物正交标记化学物质，可用于位点特异性修饰AZF-G蛋白偶联受体的变体。我们采用的施陶丁格-Bertozzi教授结扎化学标记2 G蛋白偶联受体：CCR5和视紫红质使用膦衍生物（ 图1）。一个策略是一个G蛋白偶联受体在活细胞使用肽偶联标签（ 图1b）有针对性的表位标记。我们展示了一个这样的实验，其中一个FLAG肽链电子三芳基膦标记试剂用于位点特异性和选择性地修改AZF-CCR5变异。在图3中我们显示从用于识别的位置被标记的FLAG肽30当中的CCR5调查的位置的敏感和多步骤的ELISA检测策略的代表性数据，所有AZF-CCR5变异体表达在细胞表面（红酒吧， 图3）及约一半的人成功地进行了有针对性的表位标记（蓝色条， 图3）。重量CCR5作为阴性控制的表位标记，由缺乏抗FLAG信号的表现。在一个可供选择的策略，我们标记偶联至琼脂糖2B树脂去垢剂溶解AZF-GPCRs的固定化在免疫亲和基质，如抗1D4单克隆抗体，用荧光团标记的标签（ 图1c）。在图4所示的在凝胶的荧光图像表明了成功的荧光标记的G蛋白偶联受体，视紫红质，在使用荧光素的膦衍生物与AZF引入作为施陶丁格-Bertozzi教授结扎三个不同的位置。29正如所料，视紫红质（重量）显示没有背景标记所看到的情况下的荧光带的在预期分子量的受体。
方案1。三芳基膦和叠氮化物，以形成稳定的酰胺键合的加合物之间的施陶丁格-Bertozzi教授连接反应。
图1。计划说明特定网站的注册成立的UAA（AZF）及其应用的S 。TUDY GPCR的位点特异性诱变的UAA通过共转染的三个单独的质粒实现到哺乳动物细胞中携带：演进的正交氨酰基-tRNA的特定的UAA，正交抑制性tRNA识别的琥珀终止密码子（UAG）合成以及编码含有一个TAG突变在期望的位置的G蛋白偶联受体的基因。在UAA的存在下生长细胞表达全长G蛋白偶联受体与站点具体介绍了AZF。然后这些细胞可以是（ 一 ）孵育的配体并与UV光激活的识别G蛋白偶联受体和其配体之间的交联，（B）用于位点特异性表位标签的GPCR的培养与肽缀合的化学标签，或（c）溶解于纯化G蛋白偶联受体，其然后bioorthogonally修饰，其中所述受体固定在抗体偶联的琼脂糖树脂条件下进行荧光标记。0588/50588fig1highres.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图
图2。一个G蛋白偶联受体的靶向光交联的氚化配体。这里显示的是从AZF-CCR5变异和氚标记的小分子配体，马拉韦罗间的交联实验的代表性成果。顶板：一个典型的实验后产生的，显示了测试AZF-CCR5变异体表达的免疫印迹。着色段突出PVDF膜切割用于闪烁计数和其中对应于绘制在条形图中底部面板检测到的闪烁计数。红色部分代表了受体和配位体之间的共价交联复合体的预期分子量（约40 kDa的）。该refore，我们希望检测氚在这些段，只有当AZF是在受体的位置是在靠近配体结合口袋，能形成共价交联与配体引入。重印（改编）与从Grunbeck，A. 等人的权限。遗传编码的光交联剂映射的变构药物的结合位点上的G蛋白偶联受体。ACS化学生物学 7，967-972（2012）。版权所有（2012）美国化学学会。 点击这里查看大图
图3。 ELISA法检测有针对性的表位标记一个G蛋白偶联受体顶部面板的：。的HEK 293T CEL细胞表面表达LS表示使用全细胞系的ELISA（红色条）用抗-CCR5单克隆抗体2D7 AZF CCR5的变体和野生型和模拟转染的对照。底部面板：从相同的转染细胞用0.05毫FLAG-三芳基膦进行处理1小时，在活细胞中，然后用抗-FLAG M2单克隆抗体，以确定在每个位置（蓝色条）的肽表位标记的范围由随后的ELISA定量。误差棒表示为两个或更多的复制数据集的平均值的标准误差。转载（改编）自Naganathan，S. 等权限。 GPCR的由基因编码的非天然氨基酸的生物正交修饰位点特异性的表位标记的生物化学 DOI：10.1021/bi301292h（2013）。版权所有（2013）美国化学学会。 点击这里查看大图
图4。AZF的视紫红质在不同的位置。重量和固定在用荧光素标记膦免疫亲和基质AZF -视紫红质的突变体结合荧光标记 。纯化的样品通过4-12％SDS-PAGE分离，并使用发射滤波器组用于荧光检测的优化中所示的凝胶内的荧光图像是用共聚焦488-nm激光荧光扫描仪。图改编自胡伯，T.，功能性的G蛋白偶联受体的基因编码的叠氮基等生物正交标记。提交（2013年）。 点击这里查看大图
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Discussion
在这里，我们描述了一个完善的方法进行位点特异性结合反应的探针，AZF，进入G蛋白偶联受体，并证明这个工具来研究G蛋白偶联受体的结构和动力学的三个有用的应用程序。我们的方法来位点特异性地并入UAAs规避与基于化学标记32,33或附加光交联剂34到单个可访问的半胱氨酸突变体的替代策略的一个基本问题。虽然，针对半胱氨酸硫醇基团的化学已被用于附加的荧光探针，这种策略就必须的半胱氨酸游离蛋白的背景生成。这可以被限制，因为所有的GPCR具有一个以上的半胱氨酸，其中有许多可能是必不可少的，以保持适当的受体的功能。因此，引入UAA是经得起化学改性或可以通过UV光激活的可行性是非常有吸引力的。
一个辐透的共价反应oactivatable交联剂与靶分子取决于距离和邻近的侧链。因此，这些探针可用于确定是由交联剂的特定距离内的相互作用，例如，二苯甲酮系交联剂建议有3埃的距离的依赖性。35以前，我们引入了两个AZF和BZF，一个UAA含有二苯甲酮反应性基团，以确定在一个G蛋白偶联受体是荧光素或氚标记的配体。18,19这项技术的普遍适用性仅依赖于这样的标记的配体的可用性和琥珀突变体的产生一个限定的距离内的残的目标GPCR。此外，在理论上这个目标光交联技术也可以应用于识别G蛋白偶联受体和它们的其它结合配偶体，如G蛋白或β-抑制蛋白之间的相互作用。从这些交联的研究获得的数据可用于创建更准确的莫G蛋白偶联受体信号复合物的lecular模型。
一些生物正交化学反应在文献中是允许的UAA残基的位点特异性修饰进行了描述。的UAA，ACF，例如，具有酮基的，可以在腙或肟连接反应参加。36,37我们以前相比酮基和叠氮基团的修饰与生物素化和荧光结合试剂。29我们的观察表明，叠氮组AZF的是真正的比其对应的酮更多生物正交。因此，我们随后的重点是使用施陶丁格-Bertozzi教授结扎修改两个G蛋白偶联受体的肽表位标记或荧光标记。值得注意的是，然而，在施陶丁格-Bertozzi教授结扎呈现标签的亚化学计量的38和差的动力学性质。此外，膦极易受空气氧化25我们观察到的施陶丁格-成为rtozzi结扎只达到30％的标签孵化后12小时在室温下29基于这些原因，我们目前正在评估替代化学标记，如CuAAC和SpAAC以位点特异性标记AZF-G蛋白偶联受体。
虽然的施陶丁格-Bertozzi教授连接反应的弊端，我们在这里展示使用的活细胞多肽表位标记的策略来识别目标GPCR，这对于未来的荧光标记到达的位置。此外，此表位标记的策略有许多其他有用的应用，如，在对比通过替换天然序列中插入整个表位的单一修饰残基的引入表位标签的。此功能是与特定的G蛋白偶联受体的重要性，因为修改高度保守的环段的长度及序列可显着改变功能。最后，我们还说明这里的概念证明的实验与荧光团，马GPCRs的标签王它们适合用于单分子检测实验。
总之，AZF是一个多功能的工具，G蛋白偶联受体的结构和功能的研究。我们已经表明，AZF是位点特异性地掺入用琥珀密码子抑制系统表达于哺乳动物细胞中G蛋白偶联受体。这允许一个G蛋白偶联受体的变型只在一个单一的位置上。被标记的受体的结构和功能可以然后要么在天然质膜环境中或在洗涤剂溶液进行评估。现在我们正准备调查G蛋白偶联受体信号复合体与AZF探头的灵活性。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢慷慨支持的几个基金会和慈善捐赠（见SakmarLab.org）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid pSVB. Yam | (Ye et al., 2008) | ||
| Plasmid pcDNA.RS for azF | (Ye et al., 2009) | ||
| Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5 | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position | ||
| HEK 293T cells | Adherent cells | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 10566 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14200 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Lipofectamine Plus | Invitrogen | Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015 |
|
| p-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | 6162 | |
| Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials | |||
| Maxima ML-3500S UV-A lamp | Spectronics Corporation | azF is activated by 365-nm light | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14065 | |
| HEPES | Irvine Scientific | 9319 | |
| Bovine serum albumin | Roche | 3117405001 | |
| Tritium-labeled ligand | From collaborator (Grunbeck et al., 2012) | ||
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| 1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166 | |
| NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Trans-Blot SD apparatus | Biorad | Apparatus for semi-dry transfer | |
| Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Non-fat powered milk | Fisher Scientific | NC9934262 | |
| Tween-20 | Aldrich | 274348 | |
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | Scintillation fluid |
| Scintillation vials | Fisher Scientific | 333726 | |
| LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter | Perkin Elmer | Beta-Scintillation counter | |
| Anti-rhodopsin 1D4 mAb | National Cell Culture Center | custom | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG | KPL, Inc. | 474-1806 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
| Hyblot CL AR film | Denville | E3018 | |
| Table 2. Targeted photocrosslinking materials | |||
| 0.25% Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
| FLAG-triarylphosphine | Sigma | GPHOS1 | |
| M2 FLAG mAb | Sigma | F1804 | |
| anti-CCR5 2D7 mAb | BD Biosciences | 555990 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| 96-well plate | Costar | 3601 | Clear bottom, high binding EIA/RIA |
| Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium) | Gibco | 14040 | |
| 16% Paraformaldehyde | EMS | 28908 | |
| HRP-conjugated | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| anti-rabbit IgG | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 | |
| Hydrogen peroxide | DE Healthcare Products | 97-93399 | |
| CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader | Perseptive Biosystems | ||
| Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials | |||
| Fluorescein-phosphine | (Huber et al., submitted 2012) | ||
| Nonapeptide (C9 peptide) | AnaSpec | 62190 | Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH |
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner | GE Healthcare | discontinued | Scanner with 488-nm wavelength laser |
| Table 4. Fluorescent labeling materials |
References
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