Summary
אנחנו גנטיים מקודדים את חומצת אמינו לא טבעית, p-azido-L-פנילאלנין בעמדות ממוקדות שונות בGPCRs ולהראות את הרבגוניות של קבוצת azido ביישומים שונים. אלה כוללים טכנולוגיה ממוקדת photocrosslinking לזהות שאריות בכיס מחייב ליגנד של GPCR, ושינוי bioorthogonal אתר ספציפי של GPCRs עם תג פפטיד epitope או בדיקה ניאון.
Abstract
כדי להקל על מחקרים מבניים ודינמיים של קולטן מצמידים חלבון G (GPCR) איתות מתחמים, גישות חדשות נדרשות להציג בדיקות או תוויות אינפורמטיבי לקולטניים ביטא שלא להפריע פונקצית קולטן. אנחנו השתמשנו בטכנולוגית דיכוי קודון ענבר גנטי לקודד חומצת אמינו לא טבעית, p-azido-L-פנילאלנין (azF) בעמדות ממוקדות שונות בGPCRs הביעה heterologously בתאי יונקים. הרבגוניות של קבוצת azido מודגמת כאן ביישומים שונים כדי ללמוד GPCRs בסביבה התאית האם שלהם או בתנאי solubilized חומרי ניקוי. ראשית, אנו מדגימים מבוסס תאי טכנולוגית photocrosslinking ממוקד כדי לזהות את השאריות בכיס מחייב ליגנד של GPCR בי יגנד מולקולה הקטנה שכותרתו טריטיום הוא crosslinked לחומצת אמינו azido גנטי מקודדת. לאחר מכן, אנו מדגימים שינוי ספציפי לאתר של GPCRs ידי reac קשירת Staudinger-Bertozzi bioorthogonaltion כי מטרות קבוצת azido באמצעות נגזרי phosphine. אנחנו דנים באסטרטגיה כללית לתיוג פפטיד epitope הממוקד של החלבונים בממברנה באו לידי ביטוי בתרבות ובזיהוי שלה באמצעות גישת ELISA המבוססת על כל התא. לבסוף, אנו מראים כי azF-GPCRs יכולה להיות מתויגת באופן סלקטיבי עם בדיקות ניאון. מתודולוגיות שנדונו הן כלליות, בכך שהם יכולים באופן עקרוני להיות מיושמים על כל עמדת חומצת אמינו בכל ביטוי GPCR לחקור מתחמי איתות פעילים.
Introduction
קולטנים Heptahelical G-חלבון בשילוב (GPCRs) מהווים superfamily של חלבוני קרום דינמיים מאוד שלתווך אותות תאיים חשובים ומגוונים. בפרדיגמה הקלסית, הפעלת קולטן בשילוב עם שינויי קונפורמציה יגנד-Induced. 1, 2 פיתוחים אחרונים בתחום הביולוגיה מבנית של GPCRs סיפק תובנה משמעותית על המנגנונים המולקולריים של איתות הטרנסממברני. 3-5 עם זאת, כדי להבין בדייקנות כימית גדולה יותר מנגנון תפקודי ודינמיקה מבנית של איתות GPCR, ערכת כלים של גישות נדרש לשלב בדיקות מולקולריות וכימיות אינפורמטיבי לחקור מתחמי איתות פעילים.
לשם כך, מתאמנים שיטה לאתר במיוחד להציג את אי - או מינימאלי בדיקות מביכות לקולטניים ביטא מבוססות על חומצת אמינו לא טבעית mutagenesis (UAA) באמצעות ענבר קודון טכנולוגית דיכוי חלוץ העבר על ידי ג שולץ וoworkers. 6 מותאמים המתודולוגיה mutagenesis UAA כדי להשיג מערכת mutagenesis ביטוי תשואה גבוהה ולחלבונים כגון GPCRs, שקשה לבטא במערכות Heterologous ביותר אחרות מאשר בתאי יונקים. שימוש במדכאים מהונדסים מאונך tRNA והתפתח זוג synthetase aminoacyl-tRNA לUAA ספציפי, אנחנו אתר ספציפי הצגנו UAAs בGPCRs היעד לידי ביטוי. השילוב המוצלח של UAAs, p-אצטיל-L-פנילאלנין (ACF), p-בנזואיל-L-פנילאלנין (BzF), ו-p azido-L-פנילאלנין (azF) הוכח בGPCRs המודל שלנו - רודופסין ואנושי קולט chemokine CC, CCR5. 7, 8
באופן עקרוני, UAA ניתן לקודד גנטי בכל מיקום בתוך רצף החלבון ונכס זה הוא כלי רב ערך ביוכימיים כפי שהיא מאפשרת סריקה חד קודון של GPCR יעד. אנו מתמקדים כאן דווקא ברבגוניות של UAA, azF, שבה יש עזי תגובתילעשות מחצית. בנוסף משמש כבדיקה ייחודית אינפרא אדום (IR), 8, 9 azF יכול גם לשמש כמקשר צולב photoactivatable על ידי מגיב עם אמינים ראשוניים שכנים או מימני אליפטי. בנוסף, קבוצת azido אינרטי מבחינה ביולוגית יכולה להשתתף כידית כימית סלקטיבית בתגובות תיוג bioorthogonal. כאן אנו מציגים דוגמאות הממחישות את היישומים השימושיים התאגדות אתר ספציפי של azF לGPCRs, כגון photocrosslinking הממוקד למלכודת מורכבת קולטן ליגנד, ושינוי של GPCRs ידי תיוג epitope bioorthogonal ואסטרטגיות תיוג ניאון.
ריאגנטים photoactivatable שימשו ללמוד מערכות ביולוגיות מאז 1960s. 10 בתקופה זו, שפע של ניסויי crosslinking הקולטן ליגנד דווח ללמוד מתחמי GPCR, שרובם כללו שימוש בligands photoaffinity. 11, 12 עם זאת, אלה יישומים טכני מוגבלים, כפי שהם requirסינתזת דואר של ligands נושאת קבוצת crosslinking. 13-15 יתר על כן, עם מחצית crosslinker ביגנד, זה מאתגר לזהות את מיקומו של Crosslink על GPCR. אתר ספציפי בהכנסת קבוצות photocrosslinking כUAAs לחלבונים באמצעות הענבר קודון טכנולוגית דיכוי היא קידום יקר. 16, 17 פיתחנו טכניקת photocrosslinking לזהות את הממשק מחייב את קולטן זה מעורב בהיווצרות קומפלקס הקולטן ליגנד ב לחיות תאים על ידי החדרת קבוצות photolabile לGPCRs. 18, 19 כאן אנו מתארים את הפרוטוקול ושיטת ניתוח נתוני ניסוי ליישום טכנולוגית photocrosslinking ממוקד זה כדי לזהות את אתר הקישור של ליגנד מולקולה קטנה, maraviroc tritiated, על CCR5. שיטה זו מנצלת את הכימות המדויק של הידית רדיואקטיביים ביגנד, בנוסף לשמירה על המבנה כימי יליד יגנד.
טכניקות הקרינה מבוססת לתמוך בהבנה המדויקת של הבסיס המבני של הפעלת קולטן ישירות על ידי חיטוט מדינת קונפורמציה של הקולטן. 20, 21 עם זאת, הטכניקות בעל הגמישות להציג תוויות ניאון לGPCRs אתר ספציפיות הן מוגבלות. אנו מעוניינים בהפעלת אסטרטגיות שינוי הכימי bioorthogonal כדי להקל על זיהוי מולקולה בודדת (SMD) של קומפלקסי איתות GPCR. 22 קבוצת azido יכולה להשתתף בתהליכים כימיים bioorthogonal כגון קשירת Staudinger-Bertozzi, 23, 24 אזיד-קידם מתח ללא נחושת חיי בן אשר alkyne (SpAAC) 25 וחיי בן אשר, הייתה זרז נחושת אזיד-alkyne (CuAAC). 26 אנו מתמקדים כאן בתגובת קשירת Staudinger-Bertozzi המערבת את התגובה הספציפית בין אזיד וphosphine. אנו מדגימים את השימוש בשני נגזרי phosphine שונים, מצומדת לאפיטופ פפטיד (פפטיד FLAG) או תווית ניאון(העמסה) כדי להשיג שינוי ספציפי לאתר של GPCRs.
אנו מותאמים בעבר התנאים לתיוג ספציפי לאתר של rhodopsin azF גרסאות באמצעות המבנה הגבישי רנטגן וסימולציות דינמיות לבחור אתרי יעד שהם ממס חשוף. 27, 28 אנחנו גם איירנו את ההיתכנות להשגת תיוג ללא רקע בStaudinger- קשירת Bertozzi. 29 אנו מדגימים כאן הנוהל הכללי המועסק על מנת להשיג ניאון תיוג של קולט חומר ניקוי, solubilized כי הוא משותק על מטריצת immunoaffinity ולאחר מכן דמיינו ידי הקרינה בג'ל. בנוסף, אנו מדגימים הארכה שימושית על אסטרטגית תיוג זה כדי לזהות עמדות נוחות לתיוג על הקולטן של מבנה ידוע, CCR5. זו מתבצעת באמצעות אסטרטגית תיוג פפטיד epitope ממוקדת המסתמכת על שינוי bioorthogonal של azF-GPCR גרסאות בפורמט חצי תפוקה גבוהה מבוסס תאים. 30 זהשיטה מנצלת את תכונות זיהוי רב שלבים של ELISA על פני קרום תא כדי לפקח על אירועי תיוג.
מתודולוגיות אנו דנים כאן הן כלליות ועקרוניים יכולות להיות מיושמות על כל GPCR משולב עם azF באמצעות הענבר קודון טכנולוגית דיכוי. בפרוטוקולים שהוצגו כאן פירוט אנו השלבים כרוכים בביטוי תאים היונקים של קולטנים משולבים עם UAAs כגון azF בשיטה טבעית חומצת אמינו mutagenesis והיישומים הבאים שלהם כדי להקל על מחקרים מבניים ודינמיים של GPCRs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. התאגדות גנטית אתר ספציפי של חומצות אמינו לא טבעיים לGPCRs
- שמור על תאי HEK293T בDMEM (4.5 גר '/ L של גלוקוז, 2 גלוטמין מ"מ) בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS) על 37 מעלות צלזיוס באווירת 5% CO 2.
- Transfect התאים מבוגרים כדי מפגש 60-80% בצלחת 10 ס"מ באמצעות מגיב Lipofectamine פלוס.
- ל750 DMEM μl, להוסיף 10 μl פלוס מגיב, 3.5 מיקרוגרם של GPCR cDNA (pMT4. Rho או pcDNA 3.1. CCR5) המכיל את קודון עצירת הענבר במיקום רצוי, 3.5 מיקרוגרם של מדכאי tRNA cDNA (pSVB.Yam) ו0.35 מיקרוגרם של cDNA מוטנטי אמין acyl tRNA synthetase עבור p-azido-L-פנילאלנין (pcDNA.RS). דגירה בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות. גם לבצע transfection דומה באמצעות WT GPCR cDNA (שאינם מכיל קודון עצירת ענבר) לשמש כביקורת. להוסיף את התערובת ל750 μl של DMEM עם 17 Lipofectamine μl. לאחר equilibrating 15 דקות בטמפרטורת חדר, להביא אתנפח הכולל עד 4 מיליליטר.
- תקשורת לשאוב על צלחת 10-סנטימטר, להחיל תערובת transfection לתאים, ולחזור ל37 ° C ב 5% CO 2 אווירה. אחרי 4-6 שעות, להשלים את התאים עם 4 מיליליטר DMEM המכיל FBS 20% לבין 1 מ"מ azF.
- למחרת, להחליף את תקשורת הצמיחה עם DMEM המכיל 10% FBS ו0.5 מ"מ azF.
- קציר תאים 48 שעות שלאחר transfection, לנתח ביטוי או להמשיך לנהלי photocrosslinking או תיוג המתואר בסעיפים הבאים.
- אשר ביטוי של המוטציה ענבר GPCR בנוכחות UAA בתקשורת הצמיחה. אנו עושים זאת על ידי זיהוי immunoblot המערבי. Lyse התא גלולה ב 1% (w / v) dodecyl-β-D-maltoside (DDM) ב20 מ"מ טריס-HCl, pH 7.5, 100 מ"מ NaCl עבור שעה 1 ב 4 ° C. צנטריפוגה lysate XG 16,000 ולפתור את supernatant תחת הפחתת תנאים ידי-SDS. העברה לקרום PVDF ולבצע את ניתוח immunoblot לזהות ביטוי הקולטן באורך מלא באמצעות הדואר 1D4 מב (Cell הלאומי מרכז תרבות), אשר מזהה אפיטופ מהונדס בC-הסופית של הקולטן. ביום 31
2. מיפוי אתר קישור ליגנד שימוש Photocrosslinking ממוקד
- לאחר transfection 48 שעות, מדיה לשאוב מהתאים ולהחליף עם 4 מיליליטר 1x בופר פוספט (PBS). חזור ל37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
- Resuspend התאים עם 1x PBS ולהעביר לצינור פלקון. צנטריפוגה ב 1,500 סל"ד במשך 2 דקות עד גלולה התאים ולשאוב supernatant.
- Resuspend התא גלולה שבנאגרו תמיסת מלח של 1x האנק מכיל 20 HEPES מ"מ, pH 7.5, BSA 0.2% ויגנד tritiated בלהרוות ריכוז מחייב לאורך הנדרש של זמן וטמפרטורה על מנת להבטיח היווצרות מורכבת קולטן ליגנד.
- מעביר את ההשעיה התא לצלחת 24 גם או 96 היטב לphotoactivation של azF ב365 ננומטר (למשל להשתמש UV-מנורה) ל15 דקות ב 4 ° C. Maintain את הצלחת על קרח, כדי למנוע חימום מדגם ותמוגה תא.
- להעביר את תאי צינור Eppendorf, צנטריפוגות כדי גלולה התאים, להסיר את supernatant ולהמשיך לניתוח. ניתן לאחסן את כדורים ב-20 ° C לשימוש עתידי.
- Resuspend את כדורי התא במאגר תמוגה המכילים 1% (w / v) DDM, 20 מ"מ טריס-HCl, pH 7.5 ומעכבי פרוטאז. לאחר דגירה 1-HR ב 4 ° C, צנטריפוגה lysate התא 10 דקות ב 16,000 XG, ולהעביר את supernatant לצינור חדש.
- הוספת שרף 2B מב-sepharose 1D4 לsupernatant ו דגירה הלילה ב 4 ° C כדי immunopurify GPCR באמצעות epitope 1D4 מב C-הסופית המהונדס. למחרת לשטוף את החרוזים כמה פעמים עם חיץ תמוגה. דגימות Elute עם SDS 1% ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם רעד.
- להעביר חלק מeluent לבקבוקון המכיל נוזל נצנץ 15 מיליליטר ולסמוך על מונה נצנץ בטא לכמת את כמות המחייב הספציפי של ליגנד tritiated הקולט דואר.
- לפתור את eluent מטוהר 1D4 מב שנותר על ידי ג'ל אלקטרופורזה סטנדרטית. אנו משתמשים ב4-12% ג'ל SDS-PAGE ולאחר מכן העברת חצי יבשה לקרום PVDF לimmunoblotting. אנו גם מסלול עם סולם חלבון סטנדרטי להנחות קירוב חזותי של משקל מולקולרי.
- לחסום את קרום PVDF עם חלב 5% ב TBS חיץ המכיל 20-Tween 0.05%. לחקור את הקרום כדי לאשר ביטוי הקולטן באורך מלא עם 1D4 מב ואחרי שני נוגדנים אנטי העכבר IgG HRP-מצומדות.
- פנק עם chemiluminescence המשופרת מגיב (ECL) ולחשוף את הקרום לautoradiography סרט לדמיין להקות.
- חותכים את הקרום בסכין גילוח כדי להפריד בין נתיב לדוגמה, ואחריו על ידי חיתוך בסמני משקל מולקולריים ספציפיים. העבר את מקטעי קרום למבחנות המכילות נצנץ נוזל. לכמת את הכמות של טריטיום בכל מגזר קרום על ידי ספירה על דלפק בטא נצנץ.
- זהה את חיוביphotocrosslink עם זיהוי של טריטיום במסה המולקולרית לכאורה שווה לסכום של זו של GPCR ויגנד.
3. ממוקד Epitope תיוג ותא שטח צמוד לאנזים immunosorbent assay (ELISA)
- 24 שעות שלאחר transfection, לשטוף תאים עם 1 מיליליטר 1x PBS וtrypsinize עם טריפסין 1 מיליליטר 0.25% במשך 3 דקות. להשלים עם 9 מיליליטר DMEM המכיל 10% FBS ו0.5 מ"מ azF. Resuspend תאים ולספור את צפיפות התאים. אנו משתמשים hemocytometer סטנדרטית.
- טרום לטפל צלחת מחייב גבוהה, ברורה תחתון 96 היטב עם של 0.01 מ"ג / פולי-D-ליזין מיליליטר לכל טוב 100 מיליליטר. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר, לשטוף שוב ושוב עם 1x PBS ואוויר יבש.
- צלחת 200 μl של תאי transfected בצפיפות של 6 x 04-8 אוקטובר x 10 4 תאים / היטב לצלחת 96 היטב ולחזור ל37 ° C ב 5% CO 2 אווירה.
- למחרת להכין את התאים לתיוג. לשטוף בעדינות שלוש פעמים עם 100 μl / גם לא PBS 1xo להוציא מדיה מצמיחה המכילה azF. ודא תאים נשארים דבקים, למשל, באמצעות PBS המכיל Ca 2 + ו Mg 2 +.
- הכן 50-200 מגיב תיוג FLAG-triarylphosphine מיקרומטר ב1x HBSS / PBS ממניות נשמרו ב5-20 מ"מ ב-PBS. החל 60 מיליליטר היטב כל אחד (בשלושת עותקים עבור כל מוטציה כתומה) ולחזור ל37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עד 4 שעות. שמור על סט של בארות ללא טיפול תווית ב1x HBSS / PBS. כמו כן כולל שליטת GPCR WT להשוות עם גרסאות azF-GPCR.
- שטוף תאים 3 פעמים עם 100 μl / טוב של חיץ חסימה, BB (1x PBS, BSA 0.5%), כדי להסיר את תווית unreacted לחלוטין.
- החל 100 μl / טוב של paraformaldehyde 4% (שהוכן ממניות 16% ב 1x PBS) לתאים. דגירה עבור 20 דקות בטמפרטורת חדר. לשטוף שלוש פעמים עם BB.
- לבצע פרוטוקול ELISA תא השטח סטנדרטי כדי לזהות קולט שכותרתו וביטוי הקולטן. דגירה עם נוגדן ראשוני ל1.5 שעות על קרח ואחרי משנייםהדגירה tibody בטמפרטורת חדר במשך שעה 1.
- הוספה של נוגדן אנטי הדגל M2 100 μl (דילול למשל 1:2,000 של נוגדנים שנעשה בBB) כדי לזהות epitope פפטיד דגל של מגיב תיוג FLAG-triarylphosphine. גם לחקור בארות מטופלים שאינם תווית כביקורת שלילית. הוספה אנטי CCR5 2D7 (אנו משתמשים 1:500 דילול) נוגדן לקבוצה של בארות נפרדת כדי לקבוע WT או ביטוי פני תא azF-GPCR.
- שטוף תאים שלוש פעמים עם BB, ודגירה עם נוגדן HRP-מצומדות אנטי העכבר IgG המשני (1:2,000 דילול) 100 μl.
- לשטוף בזהירות תאים חמש פעמים עם BB. הוסף חוצץ איתור 50 μl: Amplex אדום, 20 מ"מ H 2 O 2, 1x PBS (1:10:90 יחס) ו דגירה 15 דקות בטמפרטורת חדר. לאסוף נתונים ספקטרליים על קורא צלחת רב גם הקרינה באקס λ = 530 וλ em = 590.
4. Bioorthogonal תיוג פלורסנט של GPCR
- Lyse10 7 תאים שנקטפו להביע WT או azF-Rhodopsin גרסאות במאגר solubilization 1 מיליליטר המכיל 1% (w / v) DM, 50 HEPES מ"מ או טריס-HCl, pH 6.8, 100 mM NaCl, 1 מ"מ CaCl 2 ומעכבי פרוטאז ל1 שעות ב 4 ° C. צנטריפוגה lysate התא ב15,000 XG עבור 10 דקות ולאסוף את החלק היחסי supernatant.
- הוספת 100 μl שרף 2B sepharose 1D4-מב ללכוד קולט באמצעות epitope 1D4 הסופית C המהונדס. דגירה עבור שעה 12 ב 4 ° C. שטוף את השרף שלוש פעמים עם 0.1% (w / v) DDM במאגר M 0.1 פוספט נתרן, pH 7.3.
- הוספת 0.1 מ"מ והעמסת-phosphine בנפח כולל של 0.3-0.5 מיליליטר לתייג קולט משותק על מטריצת immunoaffinity (2B sepharose 1D4-מב). דגירה של 12 שעה בטמפרטורת חדר. צנטריפוגה ולהסיר supernatant. שטוף את השרף להסרת תווית unreacted.
- Elute קולט שכותרתו עם חיץ elution 100 מיליליטר מכיל 0.1% (w / v) DDM ו0.33 מ"ג / מיליליטר nonapeptide (פפטיד C9 נגד אפיטופ 1D4)ב2 חיץ פוספט מ"מ, pH 6.0 על ידי דגירה על קרח במשך שעה 1.
- לפתור דגימות שכותרתו ידי-SDS תחת הפחתת תנאים. שטוף ג'לים לזמן קצר ב PBS ולאחר מכן לדמיין את התיוג של azF-GPCR על ידי הקרינה בג'ל. לדוגמא, השתמש בסורק הקרינה confocal עם לייזר באורך גל 488 ננומטר כדי לזהות קולט שונה עם והעמסת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנחנו מועסקים על המתודולוגיה mutagenesis חומצת אמינו לא טבעית לאתר באופן ספציפי, להציג את הבדיקות מולקולריות לGPCR באמצעות הענבר קודון טכנולוגית דיכוי. ערכה באיור 1 מתארת את הצעדים הבולטים של המתודולוגיה ויישומים השונים של שילוב UAA תכליתי, p-azido-L-פנילאלנין (azF), לGPCRs. ביטוי של azF-GPCRs בתאי יונקים מאפשר ממוקד photocrosslinking לליגנד, וממוקד תיוג פפטיד epitope או שינויי ניאון של GPCR באמצעות תהליכים כימיים תיוג bioorthogonal.
טכניקת photocrosslinking יכולה לשמש כדי לחקור את ההיבטים המבניים של מתחמי GPCR ליגנד בתאים חיים (איור 1 א). נציגי נתונים שהתקבלו מניסוי אחד כזה מוצג באיור 2. 19 כאן אנו משמשים ליגנד רדיואקטיבי שכותרתו מולקולה קטנה, maraviroc tritiated, לזהות כפיפות מחייבות שלהדואר בCCR5. בדוגמא זו, קרינת UV על תאים לבטא azF-CCR5 גרסאות טרום מודגרות-עם תוצאות maraviroc tritiated במתחמי קוולנטית crosslinked שיכול להיות מזוהה באמצעות התג רדיואקטיביים רגיש על יגנד. בין כמה עמדות על CCR5 נבדק, I28azF וW86azF הצליחו photocrosslink לmaraviroc tritiated כמתואר עם ספירה גבוהה יותר באופן משמעותי נצנץ (ברים אדומים, פנל תחתון, איור 2). קולט WT לא הראה crosslinking ליגנד רדיואקטיבי.
כימיה של תיוג Bioorthogonal יכולה לשמש לאתר במיוחד לשנות גרסאות azF-GPCR. אנחנו עובדים על הכימיה קשירת Staudinger-Bertozzi לתייג שתי GPCRs: CCR5 ורודופסין באמצעות נגזרי phosphine (1 Scheme). אסטרטגיה אחת כרוכה בתיוג הממוקד epitope של GPCR בתאים חיים באמצעות תווית פפטיד-מצומדת (איור 1b). אנו מדגימים ניסוי אחד כזה, שבו peptid FLAGמגיב תיוג דואר triarylphosphine משמש לאתר באופן ספציפי וסלקטיבי לשנות גרסאות azF-CCR5. באיור 3 אנו מציגים נתונים נציג מאסטרטגיה לאיתור שלבים רב רגישים וELISA משמשת לזיהוי עמדות שמתויגות עם פפטיד הדגל. 30 בין העמדות על CCR5 נחקר, כל גרסאות azF-CCR5 באו לידי ביטוי על פני התא (אדום ברים, איור 3) וכמחצית מהם עברה בהצלחה epitope ממוקד תיוג (סורגים כחולים, איור 3). WT CCR5 שימש כביקורת שלילית לתיוג epitope, הוצגה על ידי חוסר האות נגד דגל. באסטרטגיה חלופית, שכותרתו azF-GPCRs חומר ניקוי, solubilized משותקת על מטריצת immunoaffinity, כגון אנטי 1D4 מב מצומדת לSepharose שרף 2B, עם תווית fluorophore מצומדות (איור 1 ג'). תמונת הקרינה בג'ל מוצגת באיור 4 מדגימה את הניאון המוצלחתיוג של GPCR, רודופסין, בשלוש עמדות שונות משולבות עם azF ידי קשירת Staudinger-Bertozzi באמצעות נגזרת phosphine של והעמסת. 29 כצפוי, רודופסין WT לא הראה שום תיוג רקע כפי שניתן לראות מהיעדרם של להקת ניאון בציפה משקל מולקולרי של הקולטן.
ערכת 1. תגובת קשירת Staudinger-Bertozzi בין triarylphosphine ויזיד כדי ליצור adduct הצמוד אמיד יציב.
איור 1. תכנית ממחישה את שילוב האתר ספציפי של UAA (azF) והיישומים שלה לים . Tudy GPCRs mutagenesis UAA אתר ספציפי מושגת על ידי שיתוף transfection של שלושה פלסמידים נפרדים לתאי יונקים שנושאים: אמין מאונך synthetase acyl-tRNA התפתח ספציפי עבור UAA, tRNA מדכאי מאונך שמזהה קודון עצירת ענבר (UAG) , וגן המקודד GPCR המכיל מוטציה TAG במיקום רצוי. תאים שגודלו בנוכחות UAA להביע GPCR באורך מלא עם azF הציג אתר ספציפי. תאים אלה יכולים להיות (א) הודגרו עם יגנד והופעל עם UV-אור לזהות crosslinks בין GPCR ויגנד, (ב) המשמש לאתר ספציפי Epitope תג GPCR בתרבות עם תווית כימית פפטיד-מצומדות, או (ג) solubilized לטהר GPCRs, אשר לאחר מכן הותאם bioorthogonally עם תווית ניאון בתנאים בהם קולטן הוא משותק על שרף sepharose נוגדנים מצומדות."Target =" 0588/50588fig1highres.jpg _blank "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר
איור 2. photocrosslinking הממוקד של GPCR ליגנד tritiated. הוצג כאן הם נציג התוצאות מניסוי crosslinking בין גרסאות azF-CCR5 ויגנד מולקולה הקטנה שכותרתו טריטיום, maraviroc. פנל עליון: immunoblot המערבי שנוצר לאחר ניסוי טיפוסי, המציג את הביטוי של גרסאות azF-CCR5 שנבדקו. הקטעים בצבע להדגיש בי קרום PVDF נחתך לספירת נצנץ ומתאים לספירת הנצנץ זוהתה זממה בגרף העמודות בלוח התחתון. הקטע האדום מייצג את ההמונים הצפויים המולקולריים (כ -40 KDA) של מתחם crosslinked קוולנטיים בין קולט ויגנד.refore, היינו מצפה לגילוי טריטיום במגזרים אלה רק כאשר azF הוא הציג בעמדה בקולטן שנמצאת בסמיכות לכיס מחייב ליגנד ויכול להיווצר crosslink קוולנטיים עם ליגנד. הודפס מחדש (מותאם) באישור Grunbeck, א ', et al. תמונה צולבת-linkers מקודדת גנטי למפות את אתר הקישור של תרופת allosteric על קולטן מצמידים חלבון G. הביולוגיה ACS Chemical 7, 967-972 (2012). זכויות יוצרים (2012) האגודה האמריקנית לכימיה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר
איור 3. איתור ELISA של ממוקד epitope תיוג של פנל GPCR למעלה:. ביטוי על פני השטח של תא cel HEK 293Tls להביע גרסאות azF-CCR5 ובקרות transfected WT והמדומים מששו עם אנטי CCR5 מב 2D7 באמצעות כל ELISA מבוסס התאים (ברים אדומים). פנל תחתון: תאים מאותו transfection טופלו בדגל-triarylphosphine 0.05 מ"מ עבור שעה 1 בתאים חיים ולאחר מכן לכמת ידי ELISA שלאחר מכן באמצעות אנטי הדגל M2 מב כדי לקבוע את מידת תיוג פפטיד epitope בכל עמדה (סורגים כחולים) . ברים שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע לשתיים או יותר קבוצות נתונים לשכפל. הודפס מחדש (מותאם) באישור Naganathan, ס ', et al. תיוג epitope אתר ספציפי של GPCRs ידי שינוי bioorthogonal של חומצת אמינו לא טבעית בקידוד גנטי ביוכימיה DOI:. 10.1021/bi301292h (2013). זכויות יוצרים (2013) האגודה האמריקנית לכימיה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר
איור 4. תיוג פלורסנט של רודופסין azF שולב בתפקידים שונים. WT ומוטציות azF-rhodopsin משותקים על מטריצת immunoaffinity שכותרתו עם ההעמסה-phosphine. דגימות מטוהרים הופרדו על ידי 4-12% SDS-PAGE ותמונת הקרינה בג'ל הראתה נלקחה עם סורק הקרינה לייזר 488 ננומטר confocal באמצעות מערכת סינון פליטה מותאמת לגילוי והעמסת. איור המותאם מהובר, ט, et al. תיוג Bioorthogonal של קולטני-חלבון בשילוב פונקציונלי G בקבוצות azido מקודד גנטי. הוגשו (2013). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מתארים כאן המתודולוגיה חזקה לשילוב באתר הספציפי של בדיקה תגובתי, azF, לGPCRs ולהדגים שלושה יישומים שימושיים של כלי זה כדי ללמוד את המבנה ודינמיקה של GPCRs. השיטה שלנו לאתר באופן ספציפי לשלב UAAs עוקפת בעיה בסיסית עם אסטרטגיה חלופית המבוססת על תיוג כימי 32, 33 או צירוף photocrosslinkers 34 למוטצית ציסטאין נגישה אחד. אמנם, תהליכים כימיים, כי יעד קבוצות תיאול ציסטאין שימשו לצרף בדיקות ניאון, אסטרטגיה כזו מחייבת את הדור של רקע חלבון ללא ציסטאין. זו יכולה להיות הגבלה שכן כל GPCRs להחזיק ציסטאין יותר מפעם אחת, שרבים מהם עשוי להיות חיוני כדי לשמור על תפקוד הקולטן מתאים. לכן, הכדאיות להציג UAA שניתן לשינוי כימי או יכול להיות מופעל על ידי אור UV היא מאוד אטרקטיבית.
התגובה קוולנטיים של אוריהcrosslinker oactivatable עם מולקולת מטרה תלוי על שרשרות מרחק וצד שכנות. לכן, יכולות להיות מנוצלים בדיקות אלה בזיהוי אינטראקציות הנמצאות במרחק מסוים מcrosslinker, למשל, crosslinkers מבוסס benzophenone הם הציעו לי תלות מרחק של 3 א. 35 בעבר, הציגו שני azF וBzF, UAA המכיל קבוצה תגובתי benzophenone, לזהות שאריות בGPCR שנמצאים במרחק מוגדר מהעמסה או טריטיום שכותרתו ליגנד. 18, 19 התחולה הכללית של טכנולוגיה זו תלויה רק בזמינות של ligands שכותרת כזו והדור של מוטנטים ענבר של GPCR יעד. כמו כן, בתאוריה יכולה להיות מיושמת טכניקת photocrosslinking ממוקדת זה כדי לזהות את יחסי גומלין בין GPCRs ושותפיהם האחרים מחייב, כגון חלבון G או β-arrestin. הנתונים שנצברו ממחקרי crosslinking אלה יכולים לשמש ליצירת מו מדויק יותרמודלים lecular של קומפלקסי איתות GPCR.
כמה תגובות כימיות bioorthogonal תוארו בספרות המאפשרת השינוי ספציפי לאתר של שאריות UAA. UAA, ACF, למשל, מחזיק קבוצת קטו שיכול לקחת חלק בתגובות hydrazone או קשירת oxime. 36, 37 השווינו בעבר השינוי של קבוצות קטו וקבוצות azido עם ריאגנטים מצומדות biotinylated והעמסה. 29 התצפיות שלנו עולות כי azido קבוצה של azF היא באמת יותר מאשר עמיתו bioorthogonal קטו שלה. לפיכך, אנו לאחר מכן התמקדנו בשימוש בקשירת Staudinger-Bertozzi לשנות שתי GPCRs עם תג epitope פפטיד או תווית ניאון. ראוי לציין, עם זאת, כי קשירת Staudinger-Bertozzi מציגה מאפייני הקינטית תת stoichiometric 38 ועניים של תיוג. יתר על כן, phosphines רגישים מאוד לחמצון באוויר. 25 ראו כי Staudinger-Beקשירת rtozzi משיגה רק תיוג 30% לאחר דגירה עבור שעה 12 בטמפרטורת חדר. 29 מסיבות אלה, אנו בוחנים כעת את הכימיה של תיוג חלופי כגון CuAAC וSpAAC לאתר במיוחד תווית azF-GPCRs.
אם כי החסרונות של תגובות קשירת Staudinger-Bertozzi, אנחנו מדגימים כאן את השימוש באסטרטגית תיוג פפטיד epitope לחיות תאים לזהות את עמדות על GPCR יעד נגישים לניאון תיוג עתיד. בנוסף, יש לו אסטרטגית תיוג epitope זו יישומים רבים אחרים שימושיים, כגון, את ההקדמה של תג epitope בשאריות שונה בודדות בניגוד להחדרת כל epitope על ידי החלפת רצפי ילידים. תכונה זו היא בעלת חשיבות ספציפית עם GPCRs מאז שינוי האורך והרצף של קטעי לולאה שמורים ביותר באופן דרמטי יכול לשנות את התפקוד. לבסוף, אנחנו גם מאוירים כאן ניסויי הוכחה של הקונספט לתייג GPCRs עם fluorophores, MAמלם מתאים לניסוי זיהוי מולקולה בודדת.
לסיכום, azF הוא כלי תכליתי לחקר המבנה והתפקוד של GPCRs. הראנו שazF הוא שולב GPCRs לידי ביטוי בתאי יונקים באמצעות הענבר קודון מערכת דיכוי אתר ספציפי. זה מאפשר השינוי של GPCR במיקום אחד בלבד. המבנה והתפקוד של הקולטן שכותרתו אז יכולים להיות מוערך גם בסביבת קרום הפלזמה היליד או בתמיסת ניקוי. כעת אנו עומדים לחקור מתחמי איתות GPCR עם הגמישות של חללית azF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש מחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לתמיכתם הנדיבה של כמה קרנות ותורמים פילנתרופיים (ראה SakmarLab.org).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid pSVB. Yam | (Ye et al., 2008) | ||
| Plasmid pcDNA.RS for azF | (Ye et al., 2009) | ||
| Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5 | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position | ||
| HEK 293T cells | Adherent cells | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 10566 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14200 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Lipofectamine Plus | Invitrogen | Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015 |
|
| p-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | 6162 | |
| Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials | |||
| Maxima ML-3500S UV-A lamp | Spectronics Corporation | azF is activated by 365-nm light | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14065 | |
| HEPES | Irvine Scientific | 9319 | |
| Bovine serum albumin | Roche | 3117405001 | |
| Tritium-labeled ligand | From collaborator (Grunbeck et al., 2012) | ||
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| 1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166 | |
| NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Trans-Blot SD apparatus | Biorad | Apparatus for semi-dry transfer | |
| Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Non-fat powered milk | Fisher Scientific | NC9934262 | |
| Tween-20 | Aldrich | 274348 | |
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | Scintillation fluid |
| Scintillation vials | Fisher Scientific | 333726 | |
| LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter | Perkin Elmer | Beta-Scintillation counter | |
| Anti-rhodopsin 1D4 mAb | National Cell Culture Center | custom | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG | KPL, Inc. | 474-1806 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
| Hyblot CL AR film | Denville | E3018 | |
| Table 2. Targeted photocrosslinking materials | |||
| 0.25% Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
| FLAG-triarylphosphine | Sigma | GPHOS1 | |
| M2 FLAG mAb | Sigma | F1804 | |
| anti-CCR5 2D7 mAb | BD Biosciences | 555990 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| 96-well plate | Costar | 3601 | Clear bottom, high binding EIA/RIA |
| Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium) | Gibco | 14040 | |
| 16% Paraformaldehyde | EMS | 28908 | |
| HRP-conjugated | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| anti-rabbit IgG | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 | |
| Hydrogen peroxide | DE Healthcare Products | 97-93399 | |
| CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader | Perseptive Biosystems | ||
| Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials | |||
| Fluorescein-phosphine | (Huber et al., submitted 2012) | ||
| Nonapeptide (C9 peptide) | AnaSpec | 62190 | Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH |
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner | GE Healthcare | discontinued | Scanner with 488-nm wavelength laser |
| Table 4. Fluorescent labeling materials |
References
- Huber, T., Menon, S., Sakmar, T. P. Structural basis for ligand binding and specificity in adrenergic receptors: Implications for GPCR-targeted drug discovery. Biochemistry. 47, 11013-11023 (2008).
- Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current opinion in structural biology. 21, 567-572 (2011).
- Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Wu, B., et al. Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists. Science. 330, 1066-1071 (2010).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301, 964-967 (2003).
- Ye, S., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. The Journal of biological chemistry. 283, 1525-1533 (2008).
- Ye, S., Huber, T., Vogel, R., Sakmar, T. P. FTIR analysis of GPCR activation using azido probes. Nature chemical biology. 5, 397-399 (2009).
- Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464, 1386-1389 (2010).
- Singh, A., Thornton, E. R., Westheimer, F. H. The photolysis of diazoacetylchymotrypsin. The Journal of biological chemistry. 237, 3006-3008 (1962).
- Nakayama, T. A., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bovine rhodopsin determined by cross-linking using a photoactivatable analog of 11-cis-retinal. The Journal of biological chemistry. 265, 15762-15769 (1990).
- Chen, Q., Pinon, D. I., Miller, L. J., Dong, M. Molecular basis of glucagon-like peptide 1 docking to its intact receptor studied with carboxyl-terminal photolabile probes. The Journal of biological chemistry. 284, 34135-34144 (2009).
- Huang, K. S., Radhakrishnan, R., Bayley, H., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bacteriorhodopsin as studied by cross-linking using a photosensitive analog of retinal. The Journal of biological chemistry. 257, 13616-13623 (1982).
- Zoffmann, S., Turcatti, G., Galzi, J., Dahl, M., Chollet, A. Synthesis and characterization of fluorescent and photoactivatable MIP-1alpha ligands and interactions with chemokine receptors CCR1 and CCR5. Journal of medicinal chemistry. 44, 215-222 (2001).
- Janz, J. M., et al. Direct interaction between an allosteric agonist pepducin and the chemokine receptor CXCR4. Journal of the American Chemical Society. 133, 15878-15881 (2011).
- Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11020-11024 (2002).
- Hino, N., et al. Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid. Nature. 2, 201-206 (2005).
- Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50, 3411-3413 (2011).
- Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS chemical biology. 7, 967-972 (2012).
- Dunham, T. D., Farrens, D. L. Conformational changes in rhodopsin. Movement of helix f detected by site-specific chemical labeling and fluorescence spectroscopy. The Journal of biological chemistry. 274, 1683-1690 (1999).
- Maurel, D., et al. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nature. 5, 561-567 (2008).
- Huber, T., Sakmar, T. P. Escaping the flatlands: new approaches for studying the dynamic assembly and activation of GPCR signaling complexes. Trends in pharmacological sciences. 32, 410-419 (2011).
- Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
- Kiick, K. L., Saxon, E., Tirrell, D. A., Bertozzi, C. R. Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 19-24 (2002).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted [3 + 2] azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems. Journal of the American Chemical Society. 126, 15046-15047 (2004).
- Kolb, H. C., Sharpless, K. B. The growing impact of click chemistry on drug discovery. Drug discovery today. 8, 1128-1137 (2003).
- Huber, T., Botelho, A. V., Beyer, K., Brown, M. F. Membrane Model for the G-Protein-Coupled Receptor Rhodopsin: Hydrophobic Interface and Dynamical Structure. Biophys. J. 84, 2078-2100 (2004).
- Okada, T., et al. The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 Å crystal structure. J. Mol. Biol. 342, 571-583 (2004).
- Huber, T., Tian, H., Ye, S., Naganathan, S., Kazmi, M. A., Duarte, T., Sakmar, T. P. Bioorthogonal labeling of functional G protein-coupled receptors at genetically encoded azido groups. , submitted (2013).
- Naganathan, S., Ye, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Site-specific epitope tagging of GPCRs by bioorthogonal modification of a genetically-encoded unnatural amino acid. Biochemistry. , (2013).
- Molday, R. S., MacKenzie, D. Monoclonal antibodies to rhodopsin: characterization, cross-reactivity, and application as structural probes. Biochemistry. 22, 653-660 (1983).
- Gether, U., et al. Agonists induce conformational changes in transmembrane domains III and VI of the beta2 adrenoceptor. The EMBO journal. 16, 6737-6747 (1997).
- Hubbell, W. L., Altenbach, C., Hubbell, C. M., Khorana, H. G. Rhodopsin structure, dynamics, and activation: A perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking. Advances in Protein Chemistry; Membrane Proteins. 63, 243-290 (2003).
- Cai, K., Itoh, Y., Khorana, H. G. Mapping of contact sites in complex formation between transducin and light-activated rhodopsin by covalent crosslinking: use of a photoactivatable reagent. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4877-4882 (2001).
- Dorman, G., Prestwich, G. D. Benzophenone photophores in biochemistry. Biochemistry. 33, 5661-5673 (1994).
- Zhang, Z., et al. A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo. Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).
- Dirksen, A., Hackeng, T. M., Dawson, P. E. Nucleophilic catalysis of oxime ligation. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7581-7584 (2006).
- Yanagisawa, T., et al. Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification. Chemistry & biology. 15, 1187-1197 (2008).
