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Biology

आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग आण्विक जांच जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स अध्ययन करने के लिए

Published: September 13, 2013 doi: 10.3791/50588
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Laboratory of Chemical Biology and Signal Transduction, The Rockefeller University

Summary

हम GPCRs में विभिन्न लक्षित पदों पर अप्राकृतिक अमीनो एसिड, पी azido-एल फेनिलएलनिन आनुवंशिक रूप से सांकेतिक शब्दों में बदलना और विभिन्न अनुप्रयोगों में azido समूह की बहुमुखी प्रतिभा दिखा. ये एक एक GPCR के ligand बाध्यकारी जेब में अवशेषों की पहचान करने के लिए लक्षित photocrosslinking प्रौद्योगिकी, और एक पेप्टाइड मिलान टैग या फ्लोरोसेंट जांच के साथ GPCRs की साइट विशेष bioorthogonal संशोधन शामिल हैं.

Abstract

परिसर संकेत जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (GPCR) की संरचनात्मक और गतिशील पढ़ाई की सुविधा, नए तरीकों रिसेप्टर समारोह उपद्रव नहीं है कि व्यक्त रिसेप्टर्स में जानकारीपूर्ण जांच या लेबल शुरू करने की आवश्यकता है. हम आनुवंशिक रूप से सांकेतिक शब्दों में बदलना करने के लिए एम्बर कोडोन दमन तकनीक का इस्तेमाल किया अप्राकृतिक अमीनो एसिड, heterologously स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त GPCRs में विभिन्न लक्षित पदों पर पी azido-एल फेनिलएलनिन (azF). azido समूह की बहुमुखी प्रतिभा के लिए अपनी मूल सेलुलर वातावरण में या डिटर्जेंट solubilized परिस्थितियों में GPCRs अध्ययन करने के लिए विभिन्न अनुप्रयोगों में यहाँ सचित्र है. सबसे पहले, हम एक ट्रिटियम लेबल छोटे अणु ligand एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग azido अमीनो एसिड के लिए Crosslinked है जहां GPCR के ligand बाध्यकारी जेब में अवशेषों की पहचान करने के लिए एक सेल आधारित लक्षित photocrosslinking प्रौद्योगिकी का प्रदर्शन. हम तो bioorthogonal STAUDINGER-Bertozzi बंधाव reac द्वारा GPCRs की साइट विशेष संशोधन का प्रदर्शनphosphine डेरिवेटिव का उपयोग azido समूह है कि लक्ष्य tion. हम एक पूरे सेल आधारित एलिसा दृष्टिकोण का उपयोग में संस्कृति और अपनी पहचान व्यक्त झिल्ली प्रोटीन के लक्षित पेप्टाइड मिलान टैगिंग के लिए एक सामान्य रणनीति पर चर्चा की. अंत में, हम azF-GPCRs चुनिंदा फ्लोरोसेंट जांच के साथ टैग किया जा सकता है. वे सिद्धांत रूप में सक्रिय संकेतन परिसर पूछताछ करने GPCR व्यक्त किसी में किसी भी अमीनो एसिड की स्थिति के लिए लागू किया जा सकता है कि में चर्चा के तरीके में, सामान्य हैं.

Introduction

Heptahelical जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) महत्वपूर्ण और विविध बाह्य संकेत मध्यस्थता कि अत्यधिक गतिशील झिल्ली प्रोटीन का एक superfamily शामिल. शास्त्रीय प्रतिमान में, रिसेप्टर सक्रियण ligand प्रेरित गठनात्मक परिवर्तन के साथ युग्मित है. 1, GPCRs की संरचनात्मक जीव विज्ञान में 2 हाल की प्रगति transmembrane संकेतन के आणविक तंत्र पर महत्वपूर्ण जानकारी उपलब्ध कराई है. 3-5 हालांकि, अधिक से अधिक रासायनिक परिशुद्धता के साथ समझने के लिए कार्यात्मक तंत्र और GPCR संकेतन की संरचनात्मक गतिशीलता, दृष्टिकोण की एक टूलकिट सक्रिय संकेतन परिसर से पूछताछ करने के लिए जानकारीपूर्ण आणविक और रासायनिक जांच को शामिल करने की आवश्यकता है.

यह अंत करने के लिए, हम साइट विशेष रूप से पहले से Schultz और सी ने बीड़ा उठाया दमन प्रौद्योगिकी कोडोन एम्बर का उपयोग कर अप्राकृतिक अमीनो एसिड (UAA) mutagenesis के आधार पर व्यक्त रिसेप्टर्स में गैर या न्यूनतम perturbing जांच शुरू करने की एक विधि अनुकूलितoworkers. 6 हम जैसे स्तनधारी कोशिकाओं की तुलना में अन्य अधिकांश heterologous प्रणालियों में व्यक्त करना मुश्किल है जो GPCRs, के रूप में प्रोटीन के लिए एक उच्च उपज अभिव्यक्ति और mutagenesis प्रणाली को प्राप्त करने के लिए UAA mutagenesis पद्धति को अनुकूलित. एक orthogonal इंजीनियर शमन tRNA का उपयोग करना और एक विशिष्ट UAA के लिए अमीनोएसिल-tRNA synthetase जोड़ी विकसित, हम साइट विशेष रूप से व्यक्त लक्ष्य GPCRs में UAAs की शुरुआत की. UAAs का सफल समावेश, P-Acetyl-एल फेनिलएलनिन (ए सी एफ), पी benzoyl एल फेनिलएलनिन (BZF), और पी azido-एल फेनिलएलनिन (azF) हमारे मॉडल GPCRs में प्रदर्शित किया गया है - rhodopsin और मानव सीसी केमोकाइन रिसेप्टर, CCR5. 7, 8

सिद्धांत रूप में, एक UAA आनुवंशिक रूप से प्रोटीन अनुक्रम के भीतर किसी भी स्थिति में इनकोड किया जा सकता है और यह एक लक्ष्य GPCR के एकल कोडोन स्कैनिंग सक्षम बनाता है के रूप में यह संपत्ति एक अमूल्य जैव रासायनिक उपकरण है. हम एक प्रतिक्रियाशील Azi है जो UAA, azF, की चंचलता पर विशेष रूप से यहां ध्यान केंद्रितआधा भाग कर. 9 azF भी पड़ोसी प्राथमिक amines या स्निग्ध hydrogens साथ प्रतिक्रिया द्वारा एक photoactivatable पार linker के रूप में काम कर सकते हैं एक अद्वितीय अवरक्त (आईआर) की जांच, 8, के रूप में सेवा करने के अलावा. इसके अतिरिक्त, जैविक रूप से अक्रिय azido समूह bioorthogonal लेबलिंग प्रतिक्रियाओं में एक चयनात्मक रसायन के संभाल के रूप में भाग ले सकते हैं. यहाँ हम इस तरह के जाल को लक्षित photocrosslinking एक रिसेप्टर ligand जटिल है, और bioorthogonal मिलान टैगिंग और फ्लोरोसेंट लेबलिंग रणनीतियों से GPCRs के संशोधन के रूप में GPCRs, में azF की साइट विशेष समावेश की उपयोगी अनुप्रयोगों illustrating उदाहरण प्रस्तुत करते हैं.

Photoactivatable अभिकर्मकों 1960 के दशक के बाद से जैविक प्रणालियों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस अवधि में 10, रिसेप्टर ligand crosslinking प्रयोगों की एक बहुतायत GPCR परिसरों का अध्ययन करने के लिए सूचित किया गया है, जिनमें से अधिकांश photoaffinity ligands के उपयोग को शामिल किया. 11, 12 हालांकि, इन वे requir के रूप में आवेदन तकनीकी रूप से, सीमित हैंएक crosslinking समूह असर ligands की ई संश्लेषण. 13-15 इसके अलावा, ligand में crosslinker आधा भाग के साथ, यह GPCR पर Crosslink के स्थान की पहचान करने के लिए चुनौतीपूर्ण है. साइट विशेष रूप से दमन प्रौद्योगिकी कोडोन एम्बर का उपयोग प्रोटीन में UAAs रूप photocrosslinking समूहों को शुरू करने के लिए एक मूल्यवान प्रगति है. 16, 17 हम में एक रिसेप्टर ligand जटिल के गठन में शामिल है कि एक रिसेप्टर पर बाध्यकारी इंटरफेस की पहचान करने के लिए एक photocrosslinking तकनीक विकसित की GPCRs में photolabile समूहों को शुरू करने से कोशिकाओं रहते हैं. 18, 19 यहाँ हम एक छोटे अणु ligand के बंधन स्थल, CCR5 पर tritiated maraviroc, की पहचान करने के लिए इस लक्षित photocrosslinking प्रौद्योगिकी को लागू करने के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल और डेटा विश्लेषण की विधि का वर्णन. इस विधि ligand की देशी रासायनिक संरचना को बनाए रखने के अलावा ligand पर रेडियोधर्मी संभाल, की सटीक मात्रा का ठहराव पर capitalizes.

प्रतिदीप्ति आधारित तकनीक सीधे रिसेप्टर के गठनात्मक राज्य द्वारा जांच भी रिसेप्टर सक्रियण की संरचनात्मक आधार की सटीक समझ समर्थन करते हैं. 20 21 बहरहाल, GPCRs में फ्लोरोसेंट लेबल पेश करने लचीलापन रखने तकनीकों साइट विशेष रूप से सीमित कर रहे हैं. हम GPCR संकेत परिसरों की एकल अणु का पता लगाने (एसएमडी) की सुविधा के लिए bioorthogonal रासायनिक संशोधन रणनीति को रोजगार में रुचि रखते हैं. 22 azido समूह ऐसे STAUDINGER-Bertozzi बंधाव, 23, 24 तांबे से मुक्त तनाव पदोन्नत azide के रूप bioorthogonal chemistries में भाग ले सकते हैं alkyne cycloaddition (SpAAC) 25 और तांबे उत्प्रेरित azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). 26 हम एक azide और एक phosphine के बीच विशेष प्रतिक्रिया शामिल है कि STAUDINGER-Bertozzi बंधाव प्रतिक्रिया पर यहाँ ध्यान केंद्रित. हम एक पेप्टाइड मिलान (फ्लैग पेप्टाइड) या एक फ्लोरोसेंट लेबल संयुग्मित दो अलग phosphine डेरिवेटिव, के उपयोग के प्रदर्शनGPCRs की साइट विशिष्ट संशोधन प्राप्त करने के लिए (fluorescein).

हम पहले से अवगत कराया विलायक हैं कि लक्षित साइटों का चयन करने के लिए एक्स - रे क्रिस्टल संरचना और गतिशील सिमुलेशन का उपयोग azF वेरिएंट rhodopsin की साइट विशेष लेबलिंग के लिए शर्तें अनुकूलित. 27, 28 हम भी पृष्ठभूमि से मुक्त लेबलिंग प्राप्त करने के लिए व्यवहार्यता सचित्र STAUDINGER- Bertozzi बंधाव. 29 हम यहाँ एक क्रोमैटोग्राफी मैट्रिक्स पर स्थिर है और बाद में जेल प्रतिदीप्ति द्वारा कल्पना है कि एक डिटर्जेंट solubilized रिसेप्टर के फ्लोरोसेंट लेबलिंग को प्राप्त करने के लिए नियोजित सामान्य प्रक्रिया का प्रदर्शन. इसके अतिरिक्त, हमने अज्ञात संरचना, CCR5 के एक रिसेप्टर पर लेबलिंग करने के लिए उत्तरदायी पदों की पहचान करने के लिए इस लेबलिंग रणनीति पर एक उपयोगी एक्सटेंशन प्रदर्शित करता है. इस azF-GPCR एक सेल आधारित अर्द्ध उच्च throughput प्रारूप में वेरिएंट की bioorthogonal संशोधन पर निर्भर करता है कि एक लक्षित पेप्टाइड मिलान टैगिंग रणनीति का प्रयोग किया जाता है. 30 यहविधि लेबलिंग की घटनाओं पर नजर रखने के लिए एक सेल सतह एलिसा की बहु कदम का पता लगाने के गुणों का लाभ उठाते.

हम यहां चर्चा के तरीके में सामान्य हैं और सिद्धांत में दमन प्रौद्योगिकी कोडोन एम्बर का उपयोग azF के साथ शामिल किसी भी GPCR के लिए लागू किया जा सकता है. हम विस्तार GPCRs की संरचनात्मक और गतिशील अध्ययन की सुविधा के लिए अप्राकृतिक अमीनो एसिड mutagenesis के विधि और उनके बाद अनुप्रयोगों का उपयोग कर ऐसे azF रूप UAAs के साथ शामिल रिसेप्टर्स की स्तनधारी सेल अभिव्यक्ति में शामिल कदम यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल में.

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Protocol

1. GPCRs में अप्राकृतिक एमिनो एसिड की साइट विशेष जेनेटिक निगमन

  1. एक 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक DMEM में HEK293T कोशिकाओं (ग्लूकोज की 4.5 ग्राम / ल, 2 मिमी glutamine) को बनाए रखने.
  2. Lipofectamine अलावा अभिकर्मक का उपयोग कर एक 10 सेमी की थाली में 60-80% संगम को विकसित कोशिकाओं Transfect.
    1. 750 μl DMEM करने के लिए, एक इच्छित स्थान पर एम्बर बंद codon युक्त 10 μl प्लस अभिकर्मक, GPCR सीडीएनए की 3.5 ग्राम (pMT4. रो या pcDNA 3.1. CCR5), 3.5 शमन tRNA सीडीएनए (pSVB.Yam) की ग्राम और 0.35 ग्राम जोड़ पी azido-एल फेनिलएलनिन (pcDNA.RS) के लिए उत्परिवर्ती एमिनो एसाइल tRNA synthetase सीडीएनए की. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. इसके अलावा एक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए WT GPCR सीडीएनए (एक एम्बर बंद codon युक्त नहीं) का उपयोग कर एक समान अभिकर्मक प्रदर्शन करते हैं. 17 μl Lipofectamine साथ DMEM के 750 μl के लिए इस मिश्रण जोड़ें. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के equilibrating के बाद लाना4 मिलीलीटर कुल मात्रा.
    2. 10 सेमी की थाली पर महाप्राण मीडिया, कोशिकाओं को अभिकर्मक मिश्रण लागू होते हैं, और सीओ 2 के वातावरण 5% में 37 डिग्री सेल्सियस पर लौटें. 4-6 घंटे के बाद, 20% FBS और 1 मिमी azF युक्त 4 मिलीलीटर DMEM के साथ कोशिकाओं के पूरक.
  3. अगले दिन, DMEM 10% FBS और 0.5 मिमी azF को रोकने के साथ विकास मीडिया की जगह.
  4. हार्वेस्ट कोशिकाओं 48 घंटे के बाद अभिकर्मक, अभिव्यक्ति का विश्लेषण या निम्न अनुभागों में वर्णित photocrosslinking या लेबलिंग प्रक्रियाओं को आगे बढ़ने के लिए.
    1. विकास मीडिया में UAA की उपस्थिति में GPCR एम्बर उत्परिवर्ती की अभिव्यक्ति की पुष्टि करें. हम पश्चिमी immunoblot पता लगाने के द्वारा इस करते हैं. Lyse 1% में सेल गोली (w / v) 20 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच में dodecyl-β-D-maltoside (DDM) 7.5, 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 100 मिमी NaCl 16,000 XG पर lysate अपकेंद्रित्र और एसडीएस पृष्ठ द्वारा शर्तों को कम करने के नीचे सतह पर तैरनेवाला हल. एक PVDF झिल्ली पर स्थानांतरण और वें का उपयोग पूर्ण लंबाई रिसेप्टर अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए immunoblot विश्लेषण बाहर लेरिसेप्टर की सी टर्मिनस पर एक इंजीनियर का मिलान पहचानता है जो ई 1D4 एमएबी (राष्ट्रीय सेल संस्कृति केंद्र),. 31

2. लक्षित Photocrosslinking का प्रयोग एक ligand बाध्यकारी साइट का मिलान

  1. 48 घंटा बाद अभिकर्मक, कोशिकाओं से महाप्राण मीडिया और 4 मिलीग्राम 1x फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) के साथ बदलें. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर लौटें.
  2. 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं Resuspend और एक फाल्कन ट्यूब को हस्तांतरण. गोली कोशिकाओं और सतह पर तैरनेवाला aspirate करने के लिए 2 मिनट के लिए 1500 rpm पर अपकेंद्रित्र.
  3. 20 मिमी HEPES, 7.5 पीएच, 0.2% BSA और रिसेप्टर ligand जटिल गठन सुनिश्चित करने के लिए समय और तापमान की लंबाई के लिए बाध्यकारी एकाग्रता saturating पर tritiated ligand युक्त 1x हांक बफर नमक के घोल में सेल गोली Resuspend.
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए (जैसे एक यूवी एक दीपक का उपयोग करें) 365 एनएम पर azF के photoactivation के लिए एक 24 अच्छी तरह से या 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण Maintain बर्फ पर थाली नमूना हीटिंग और सेल से बचने के लिए.
  5. गोली कोशिकाओं के लिए एक Eppendorf ट्यूब, अपकेंद्रित्र कोशिकाओं स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला निकालें और विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ें. छर्रों भविष्य में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
  6. (W / v) DDM, 20 मिमी Tris-एचसीएल, 7.5 पीएच और protease inhibitors 1% से युक्त lysis बफर में सेल छर्रों Resuspend. डिग्री सेल्सियस 4 में 1 घंटा ऊष्मायन के बाद, 16,000 XG पर 10 मिनट के लिए सेल lysate अपकेंद्रित्र, और एक नया ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला.
  7. सतह पर तैरनेवाला को 1D4 एमएबी-sepharose 2 बी राल जोड़ें और इंजीनियर सी टर्मिनस 1D4 एमएबी मिलान का उपयोग कर GPCR immunopurify के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं. अगले दिन lysis बफर के साथ मोती कई बार धोने. झटकों के साथ 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1% एसडीएस के साथ Elute नमूनों.
  8. एक 15 मिलीलीटर शीशी युक्त जगमगाहट तरल पदार्थ को eluent के एक हिस्से का स्थानांतरण और वें के लिए tritiated ligand की विशिष्ट बंधनकारी की राशि यों के लिए एक बीटा जगमगाहट काउंटर पर भरोसाई रिसेप्टर.
  9. मानक जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा शेष 1D4 एमएबी शुद्ध eluent का समाधान करें. हम एक 4-12% एसडीएस पृष्ठ जेल और immunoblotting के लिए एक PVDF झिल्ली को तो अर्द्ध शुष्क हस्तांतरण का उपयोग करें. हम भी आणविक वजन के दृश्य सन्निकटन मार्गदर्शन करने के लिए मानक प्रोटीन सीढ़ी के साथ एक लेन में शामिल हैं.
    1. 0.05% बीच 20 युक्त टीबीएस बफर में 5% दूध के साथ PVDF झिल्ली ब्लॉक. एचआरपी संयुग्मित विरोधी माउस आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पीछा 1D4 एमएबी के साथ पूर्ण लंबाई रिसेप्टर अभिव्यक्ति की पुष्टि झिल्ली जांच.
    2. बढ़ाया chemiluminescence (ईसीएल) अभिकर्मक के साथ व्यवहार और बैंड कल्पना करने के लिए फिल्म autoradiography के लिए झिल्ली का पर्दाफाश.
  10. विशिष्ट आणविक वजन मार्करों में कटौती करके पीछा प्रत्येक नमूना लेन को अलग करने के लिए एक रेजर ब्लेड, साथ झिल्ली कट. जगमगाहट तरल पदार्थ युक्त शीशियों को झिल्ली क्षेत्रों स्थानांतरण. एक बीटा जगमगाहट काउंटर पर भरोसा करके प्रत्येक झिल्ली खंड में ट्रिटियम की मात्रा.
  11. सकारात्मक पहचानेंGPCR और ligand की है कि की राशि के बराबर स्पष्ट आणविक द्रव्यमान में ट्रिटियम का पता लगाने के साथ photocrosslink.

3. मिलान टैगिंग और कोशिका की सतह एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) लक्षित

  1. 24 घंटे बाद अभिकर्मक, पीबीएस 1x 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो और 3 मिनट के लिए 1 मिलीलीटर 0.25% trypsin के साथ trypsinize. 10% FBS और 0.5 मिमी azF युक्त 9 मिलीलीटर DMEM के साथ पूरक. कोशिकाओं Resuspend और सेल घनत्व गिनती. हम एक मानक hemocytometer का उपयोग करें.
  2. 0.01 मिलीग्राम / अच्छी तरह से प्रति मिलीलीटर पाली-D-लाइसिन की 100 मिलीलीटर के साथ एक उच्च बंधन, स्पष्ट नीचे 96 अच्छी तरह से थाली पूर्व इलाज. 1x पीबीएस और हवा शुष्क के साथ बार बार धोने, कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
  3. प्लेट 200 6 10 x 4 के घनत्व पर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की μl - 8 x 10 4 कोशिकाओं / अच्छी तरह से 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए और सीओ 2 के माहौल 5% में 37 डिग्री सेल्सियस पर लौटें.
  4. अगले दिन लेबलिंग के लिए कोशिकाओं को तैयार करते हैं. धीरे 100 μl / अच्छी तरह 1x पीबीएस टी के साथ तीन बार धोनेओ किसी भी azF युक्त विकास मीडिया को हटा दें. कोशिकाओं पीबीएस सीए 2 + और ​​2 मिलीग्राम + युक्त का उपयोग करके, उदाहरण के लिए, पालन रहना सुनिश्चित करें.
  5. पीबीएस में 5-20 मिमी पर बनाए रखा एक शेयर से 1x HBSS / पीबीएस में 50-200 माइक्रोन झंडा triarylphosphine लेबलिंग अभिकर्मक तैयार करें. प्रत्येक अच्छी तरह से (प्रत्येक एम्बर उत्परिवर्ती के लिए तीन प्रतियों में) के लिए 60 मिलीग्राम लागू करें और 30 मिनट घंटा से 4 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर लौटें. 1x HBSS / पीबीएस में लेबल उपचार के बिना कुओं का एक सेट बनाए रखें. इसके अलावा azF-GPCR वेरिएंट के साथ तुलना करने के लिए एक भार GPCR नियंत्रण शामिल हैं.
  6. अच्छी तरह से अवरुद्ध बफर के 100 μl / साथ कोशिकाओं 3 बार धोएं, बीबी (1x पीबीएस, 0.5% बीएसए), पूरी तरह से unreacted लेबल हटाने के लिए.
  7. कोशिकाओं के लिए 100 μl / अच्छी तरह से (1x पीबीएस में एक 16% शेयर से तैयार) 4% paraformaldehyde लागू करें. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए सेते हैं. बी बी के साथ तीन बार धोएं.
  8. लेबल रिसेप्टर और रिसेप्टर अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए मानक सेल सतह एलिसा प्रोटोकॉल प्रदर्शन. माध्यमिक एक द्वारा पीछा बर्फ पर 1.5 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सेते1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर tibody ऊष्मायन.
    1. झंडा triarylphosphine लेबलिंग अभिकर्मक का झंडा पेप्टाइड मिलान का पता लगाने के विरोधी झंडा M2 एंटीबॉडी के 100 μl (बी बी में बनाया एंटीबॉडी का उदाहरण 1:2,000 कमजोर पड़ने) जोड़ें. इसके अलावा एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में गैर लेबल इलाज कुओं की जांच. भार या azF-GPCR कोशिका की सतह अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए कुओं का एक अलग सेट करने के लिए एंटीबॉडी (हम एक 1:500 कमजोर पड़ने का उपयोग करें) विरोधी CCR5 2D7 जोड़ें.
    2. बी बी के साथ कोशिकाओं तीन बार धोएं, और एचआरपी संयुग्मित विरोधी माउस आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी (1:2,000 कमजोर पड़ने) के 100 μl के साथ सेते हैं.
    3. ध्यान से बी बी के साथ कोशिकाओं पांच बार धो लो. 50 μl पता लगाने बफर जोड़ें: Amplex लाल, 20 मिमी 2 एच 2 हे, 1x पीबीएस (1:10:90 अनुपात) और कमरे के तापमान पर 15 मिनट सेते हैं. Λ पूर्व = 530 पर एक प्रतिदीप्ति बहु अच्छी तरह से थाली पाठक पर वर्णक्रमीय डेटा इकट्ठा करने और λ उन्हें 590 =.

4. एक GPCR के Bioorthogonal फ्लोरोसेंट लेबलिंग

  1. Lyseभार या azF-Rhodopsin 1% से युक्त 1 मिलीलीटर solubilization बफर में वेरिएंट (w / v) डीएम, 50 मिमी HEPES या Tris-एचसीएल, 6.8 पीएच, 100 मिमी NaCl, 1 मिमी 2 CaCl और protease inhibitors के लिए 1 व्यक्त 10 7 काटा कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर घंटा 10 मिनट के लिए 15,000 XG पर सेल lysate अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला अंश एकत्र.
  2. इंजीनियर सी टर्मिनस 1D4 मिलान का उपयोग रिसेप्टर पर कब्जा करने के लिए 100 μl 1D4-एमएबी sepharose 2 बी राल जोड़ें. 4 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए सेते 0.1 एम सोडियम फास्फेट बफर, 7.3 पीएच में (w / v) DDM 0.1% के साथ राल तीन बार धोएं.
  3. क्रोमैटोग्राफी मैट्रिक्स (1D4-एमएबी sepharose 2 बी) पर स्थिर रिसेप्टर लेबल करने के लिए 0.5 मिलीलीटर - 0.3 की कुल मात्रा में 0.1 मिमी Fluorescein-phosphine जोड़ें. कमरे के तापमान पर 12 घंटे के लिए सेते हैं. अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटायें. Unreacted लेबल हटाने के लिए राल धो लें.
  4. (W / v) DDM और 0.33 मिलीग्राम / एमएल nonapeptide (1D4 मिलान के खिलाफ C9 पेप्टाइड) 0.1% से युक्त 100 मिलीलीटर क्षालन बफर के साथ लेबल रिसेप्टर Elute2 मिमी फॉस्फेट बफर में, 1 घंटे के लिए बर्फ पर ऊष्मायन से पीएच 6.0.
  5. शर्तों को कम करने के तहत एसडीएस पृष्ठ द्वारा लेबल के नमूनों का समाधान करें. पीबीएस में संक्षिप्त जैल धो लें और फिर में जेल प्रतिदीप्ति द्वारा azF-GPCR की लेबलिंग कल्पना. उदाहरण के लिए, fluorescein के साथ संशोधित रिसेप्टर पता लगाने के लिए एक 488 एनएम तरंगदैर्ध्य लेजर के साथ एक confocal प्रतिदीप्ति स्कैनर का उपयोग करें.

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Representative Results

हम विशेष रूप से साइट दमन प्रौद्योगिकी कोडोन एम्बर का उपयोग कर एक GPCR में आणविक जांच शुरू करने की अप्राकृतिक अमीनो एसिड mutagenesis कार्यप्रणाली कार्यरत हैं. चित्रा 1 में योजना कार्यप्रणाली की मुख्य चरणों और GPCRs में, बहुमुखी UAA, पी azido-एल फेनिलएलनिन (azF) को शामिल करने के लिए विभिन्न अनुप्रयोगों की रूपरेखा. स्तनधारी कोशिकाओं में azF-GPCRs की अभिव्यक्ति ligands के लिए photocrosslinking लक्षित, और bioorthogonal लेबलिंग chemistries के माध्यम से पेप्टाइड मिलान टैगिंग या एक GPCR के फ्लोरोसेंट संशोधनों लक्षित में सक्षम बनाता है.

photocrosslinking तकनीक जीवित कोशिकाओं में GPCR-ligand परिसरों (चित्रा 1 ए) के संरचनात्मक पहलुओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ऐसा ही एक प्रयोग से प्राप्त प्रतिनिधि डेटा चित्रा 2 में दिखाया गया है. 19 यहाँ हम अपने बंधन बैठने की पहचान करने के लिए एक रेडियोधर्मी लेबल छोटे अणु ligand, tritiated maraviroc, प्रयोगCCR5 पर ई. इस उदाहरण में, azF-CCR5 व्यक्त कोशिकाओं पर यूवी विकिरण ligand पर संवेदनशील रेडियोधर्मी टैग का उपयोग कर पहचाना जा सकता है कि covalently Crosslinked परिसरों में tritiated maraviroc परिणामों के साथ पूर्व incubated वेरिएंट. परीक्षण किया CCR5 पर कई पदों में से, I28azF और W86azF काफी अधिक जगमगाहट मायने रखता है (लाल सलाखों, नीचे पैनल, चित्रा 2) के साथ दर्शाया के रूप में tritiated maraviroc को photocrosslink करने में सक्षम थे. WT रिसेप्टर रेडियोधर्मी ligand के लिए कोई crosslinking दिखाया.

Bioorthogonal लेबलिंग chemistries के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है साइट विशेष रूप से azF-GPCR वेरिएंट संशोधित. CCR5 और rhodopsin phosphine डेरिवेटिव (स्कीम 1) का उपयोग: हम दो GPCRs लेबल करने STAUDINGER-Bertozzi बंधाव रसायन विज्ञान कार्यरत हैं. एक रणनीति एक पेप्टाइड संयुग्मित लेबल (चित्रा 1 बी) का उपयोग जीवित कोशिकाओं में एक GPCR के लक्षित मिलान टैगिंग शामिल है. हम एक ऐसा प्रयोग जो प्रदर्शन में एक झंडा peptidई triarylphosphine लेबलिंग अभिकर्मक साइट विशेष रूप से करने के लिए इस्तेमाल किया और चुनिंदा azF-CCR5 वेरिएंट को संशोधित किया जाता है. चित्रा 3 में हम झंडा पेप्टाइड के साथ टैग कर रहे हैं कि पदों. CCR5 जांच पर पदों में से 30 की पहचान करने के लिए इस्तेमाल एक संवेदनशील और बहु कदम एलिसा पता लगाने की रणनीति से प्रतिनिधि डेटा प्रदर्शित, सभी azF-CCR5 वेरिएंट कोशिका की सतह (लाल पर व्यक्त किया गया उनमें से सलाखों, चित्रा 3) और लगभग आधे सफलतापूर्वक (नीले सलाखों, चित्रा 3) टैगिंग लक्षित मिलान कराना पड़ा. WT CCR5 विरोधी झंडा संकेत के अभाव द्वारा प्रदर्शित मिलान टैगिंग के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा की. एक वैकल्पिक रणनीति में, हम एक fluorophore संयुग्मित लेबल (चित्रा 1C) के साथ, 2 बी राल sepharose संयुग्मित विरोधी 1D4 एमएबी के रूप में एक क्रोमैटोग्राफी मैट्रिक्स पर स्थिर डिटर्जेंट solubilized azF-GPCRs, लेबल. 4 चित्र में दिखाया में जेल प्रतिदीप्ति छवि सफल फ्लोरोसेंट दर्शाताउम्मीद पर एक फ्लोरोसेंट बैंड के अभाव के रूप में देखा fluorescein की एक phosphine व्युत्पन्न का उपयोग STAUDINGER-Bertozzi बंधाव द्वारा azF साथ शामिल तीन अलग अलग स्थानों पर GPCR, rhodopsin की लेबलिंग,. 29 जैसी कि उम्मीद थी, WT rhodopsin कोई पृष्ठभूमि लेबलिंग से पता चला रिसेप्टर की आणविक भार.

योजना 1

योजना 1. एक triarylphosphine और एक स्थिर एमाइड से जुड़े अभिवर्तन के लिए फार्म एक azide के बीच STAUDINGER-Bertozzi बंधाव प्रतिक्रिया.

चित्रा 1
चित्रा 1. योजना एक UAA (azF) और उसके आवेदन को एस के साइट विशेष समावेश illustrating . एक एम्बर बंद codon (UAG) पहचानता है कि UAA, एक orthogonal शमन tRNA के लिए विशिष्ट एक विकसित orthogonal अमीनो एसाइल-tRNA synthetase: tudy GPCRs साइट विशेष UAA mutagenesis ले कि स्तनधारी कोशिकाओं में तीन अलग plasmids के सह अभिकर्मक द्वारा हासिल की है और एक इच्छित स्थान पर एक टैग उत्परिवर्तन युक्त GPCR जीन एन्कोडिंग. UAA की उपस्थिति में विकसित कोशिकाओं एक साइट विशेष रूप से शुरू की azF साथ एक पूर्ण लंबाई GPCR व्यक्त करते हैं. इन कोशिकाओं को फिर, (एक) ligand साथ incubated और एक GPCR और अपने ligand के बीच crosslinks की पहचान करने के लिए यूवी प्रकाश के साथ सक्रिय, (ख) एक पेप्टाइड संयुग्मित रासायनिक लेबल के साथ संस्कृति में साइट विशेष रूप से मिलान टैग एक GPCR करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या (ग) तो bioorthogonally रिसेप्टर एक एंटीबॉडी संयुग्मित sepharose राल पर स्थिर है, जहां शर्तों के तहत एक फ्लोरोसेंट लेबल के साथ संशोधित कर रहे हैं जो GPCRs, शुद्ध करने के लिए solubilized.0588/50588fig1highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें

चित्रा 2
चित्रा 2. एक tritiated ligand के लिए एक GPCR के लक्षित photocrosslinking. यहाँ प्रदर्शित azF-CCR5 वेरिएंट और एक ट्रिटियम लेबल छोटे अणु ligand, maraviroc के बीच एक crosslinking प्रयोग से प्रतिनिधि के परिणाम हैं. शीर्ष पैनल: परीक्षण किया azF-CCR5 वेरिएंट की अभिव्यक्ति दिखा, एक ठेठ प्रयोग के बाद उत्पन्न पश्चिमी immunoblot. रंगीन क्षेत्रों PVDF झिल्ली जगमगाहट गिनती के लिए काट दिया गया, जहां पर प्रकाश डाला और नीचे के पैनल में बार ग्राफ में प्लॉट का पता चला जगमगाहट गिनती के अनुरूप हैं. लाल खंड रिसेप्टर और ligand के बीच सहसंयोजक Crosslinked परिसर का (40 केडीए) के चारों ओर उम्मीद आणविक जन प्रतिनिधित्व करता है.refore, हम azF ligand बाध्यकारी जेब के पास है और ligand के साथ एक सहसंयोजक crosslink फार्म कर सकते हैं कि रिसेप्टर में एक स्थान पर शुरू की है केवल जब उन क्षेत्रों में ट्रिटियम का पता लगाने की उम्मीद है. एट अल Grunbeck, ए, से अनुमति के साथ (अनुकूलित) पुनर्प्रकाशित. आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फोटो पार linkers एक जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर पर एक allosteric दवा के बंधन साइट मानचित्र. ACS रासायनिक जीवविज्ञान 7, 967-972 (2012). कॉपीराइट (2012) अमेरिकन केमिकल सोसायटी. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें

चित्रा 3
चित्रा 3. . एक GPCR शीर्ष पैनल के लक्षित मिलान टैगिंग की एलिसा जांच: HEK 293T सेल की कोशिका की सतह अभिव्यक्तिपूरे सेल आधारित एलिसा (लाल बार) का उपयोग करते हुए विरोधी CCR5 एमएबी 2D7 साथ जांच azF-CCR5 वेरिएंट और WT और नकली ट्रांसफ़ेक्ट नियंत्रण व्यक्त रास. नीचे पैनल: एक ही अभिकर्मक की कोशिकाएं जीवित कोशिकाओं में 1 घंटे के लिए 0.05 मिमी झंडा triarylphosphine के साथ इलाज किया गया और फिर हर स्थिति (नीले सलाखों) में पेप्टाइड मिलान टैगिंग की सीमा निर्धारित करने के लिए विरोधी झंडा M2 एमएबी का उपयोग बाद में एलिसा द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया . त्रुटि सलाखों दो या अधिक दोहराने डेटा सेट के लिए मतलब की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं. एट अल Naganathan, एस, से अनुमति के साथ (अनुकूलित) पुनर्प्रकाशित. एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग अप्राकृतिक अमीनो एसिड की bioorthogonal संशोधन द्वारा GPCRs की साइट विशेष मिलान टैगिंग बायोकैमिस्ट्री DOI:. 10.1021/bi301292h (2013). कॉपीराइट (2013) अमेरिकन केमिकल सोसायटी. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें

चित्रा 4 चित्रा 4. विभिन्न पदों. WT और fluorescein-phosphine साथ लेबल एक क्रोमैटोग्राफी मैट्रिक्स पर स्थिर azF-rhodopsin म्यूटेंट में शामिल rhodopsin azF के फ्लोरोसेंट लेबलिंग. शुद्ध नमूने 4-12% एसडीएस पृष्ठ से अलग हो गए थे और दिखाया में जेल प्रतिदीप्ति छवि fluorescein का पता लगाने के लिए अनुकूलित एक उत्सर्जन फिल्टर सेट का उपयोग कर एक confocal 488 एनएम लेजर प्रतिदीप्ति स्कैनर के साथ लिया गया था. ह्यूबर, टी., आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग azido समूहों पर कार्यात्मक जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स के एट अल. Bioorthogonal लेबलिंग से अनुकूलित चित्रा. (2013) प्रस्तुत की. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें

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Discussion

हम GPCRs में, एक प्रतिक्रियाशील जांच, azF की साइट विशिष्ट शामिल करने के लिए यहाँ एक मजबूत कार्यप्रणाली का वर्णन है और GPCRs की संरचना और गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए इस उपकरण का तीन उपयोगी अनुप्रयोगों प्रदर्शित करता है. करने के लिए हमारी पद्धति साइट विशेष रूप से UAAs रासायनिक 32, 33 लेबलिंग या एक भी सुलभ सिस्टीन उत्परिवर्ती को photocrosslinkers 34 संलग्न पर आधारित एक वैकल्पिक रणनीति के साथ एक मौलिक समस्या गतिरोध उत्पन्न शामिल. सिस्टीन thiol समूहों को लक्षित कि chemistries फ्लोरोसेंट जांच संलग्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, हालांकि, इस तरह के एक रणनीति एक सिस्टीन मुक्त प्रोटीन पृष्ठभूमि की पीढ़ी जरूरी है. सभी GPCRs उचित रिसेप्टर समारोह को बनाए रखने के लिए आवश्यक हो सकता है, जिनमें से कई एक से अधिक सिस्टीन, अधिकारी के बाद से यह सीमित किया जा सकता है. इसलिए, रासायनिक संशोधन करने के लिए उत्तरदायी है या पराबैंगनी प्रकाश से सक्रिय किया जा सकता है कि एक UAA शुरू करने की व्यवहार्यता बेहद आकर्षक है.

एक phot के सहसंयोजक प्रतिक्रियाएक लक्ष्य अणु के साथ oactivatable crosslinker दूरी और पड़ोसी पक्ष श्रृंखला पर निर्भर है. इसलिए, इन जांच crosslinker से एक विशिष्ट दूरी के भीतर हैं कि बातचीत की पहचान करने में, उदाहरण के लिए, Benzophenone आधारित crosslinkers 3 ने की दूरी निर्भरता है करने के लिए सुझाव दिया जाता है उपयोग किया जा सकता है. 35 पहले, हमने azF और BZF, एक UAA दोनों शुरू की ligand. 18, 19 में इस प्रौद्योगिकी का सामान्य प्रयोज्यता केवल ऐसे लेबल ligands की उपलब्धता और एम्बर म्यूटेंट की पीढ़ी पर निर्भर करता है लेबल एक fluorescein या ट्रिटियम से एक परिभाषित दूरी के भीतर हैं कि एक GPCR में अवशेषों की पहचान करने के लिए एक Benzophenone प्रतिक्रियाशील समूह, जिसमें एक लक्ष्य GPCR की. इसके अतिरिक्त, सिद्धांत रूप में यह लक्षित photocrosslinking तकनीक GPCRs और इस तरह एक जी प्रोटीन या β arrestin के रूप में उनके अन्य बंधन भागीदारों के बीच बातचीत की पहचान करने के लिए लागू किया जा सकता है. इन crosslinking पढ़ाई से प्राप्त डेटा और अधिक सटीक मो बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैGPCR संकेत परिसरों की lecular मॉडल.

कई bioorthogonal रासायनिक प्रतिक्रियाओं UAA अवशेषों की साइट विशेष संशोधन के लिए अनुमति देते हैं कि साहित्य में वर्णित किया गया है. UAA, एसीएफ, उदाहरण के लिए, Hydrazone या oxime बंधाव प्रतिक्रियाओं में हिस्सा लेना कर सकते हैं कि एक कीटो समूह के पास. 36, 37 हम पहले biotinylated और fluorescein संयुग्मित अभिकर्मकों के साथ कीटो समूहों और azido समूहों के संशोधन की तुलना में. 29 हमारी टिप्पणियों से संकेत दिया है कि azido azF के समूह ने अपने कीटो समकक्ष से सही मायने में अधिक bioorthogonal है. इसलिए, हम बाद में एक पेप्टाइड मिलान टैग या एक फ्लोरोसेंट लेबल के साथ दो GPCRs को संशोधित करने के STAUDINGER-Bertozzi बंधाव के उपयोग पर ध्यान केंद्रित किया. यह STAUDINGER-Bertozzi बंधाव लेबलिंग के 38 उप stoichiometric और गरीब गतिज गुण दर्शाती है कि, हालांकि, उल्लेखनीय है. इसके अलावा, phosphines हवा ऑक्सीकरण के लिए अत्यधिक अतिसंवेदनशील होते हैं. 25 हम STAUDINGER रहो कि मनायाrtozzi बंधाव ही कमरे के तापमान पर 12 घंटे के लिए ऊष्मायन के बाद 30% लेबलिंग को प्राप्त होता है. इन कारणों के लिए 29, हम वर्तमान में करने के लिए इस तरह के CuAAC और SpAAC के रूप में वैकल्पिक लेबलिंग chemistries मूल्यांकन कर रहे हैं साइट विशेष रूप से azF-GPCRs लेबल.

STAUDINGER-Bertozzi बंधाव प्रतिक्रियाओं की कमियां देरी, हम यहाँ भविष्य फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए पहुंच रहे हैं कि एक लक्ष्य GPCR पर पदों की पहचान करने के लिए एक जीवित कोशिका पेप्टाइड मिलान टैगिंग रणनीति के उपयोग के प्रदर्शन. साथ ही, यह मिलान टैगिंग रणनीति इस तरह के देशी दृश्यों की जगह से पूरे मिलान डालने के विपरीत एक एकल संशोधित अवशेषों पर एक मिलान टैग की शुरूआत के रूप में कई अन्य उपयोगी अनुप्रयोगों, है. यह सुविधा नाटकीय रूप से समारोह को बदल सकता है उच्च संरक्षित पाश क्षेत्रों की लंबाई और अनुक्रम को संशोधित करने के बाद GPCRs साथ विशिष्ट महत्व है. अंत में, हम भी fluorophores, मा के साथ GPCRs लेबल करने के लिए यहाँ सबूत की अवधारणा प्रयोगों सचित्रएकल अणु का पता लगाने के प्रयोगों के लिए उपयुक्त राजा उन्हें.

अंत में, azF GPCRs की संरचना और कार्यप्रणाली के अध्ययन के लिए एक बहुमुखी उपकरण है. हम azF साइट विशेष रूप से दमन प्रणाली कोडोन एम्बर का उपयोग स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त GPCRs में शामिल है कि पता चला है. यह केवल एक ही स्थान पर एक GPCR के संशोधन के लिए अनुमति देता है. लेबल रिसेप्टर की संरचना और समारोह तो देशी प्लाज्मा झिल्ली वातावरण में या एक साबुन के घोल में या तो मूल्यांकन किया जा सकता. हम अब azF जांच के लचीलेपन के साथ GPCR संकेतन परिसरों की जांच के लिए तैयार कर रहे हैं.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम कई नींव और परोपकारी दाताओं की उदार सहायता (SakmarLab.org देखें) धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasmid pSVB. Yam (Ye et al., 2008)
Plasmid pcDNA.RS for azF (Ye et al., 2009)
Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5 Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position
HEK 293T cells Adherent cells
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Gibco 10566  
Phosphate Buffered Saline Gibco 14200  
Fetal Bovine Serum Gemini Bio-products 100-106  
Lipofectamine Plus Invitrogen Lipofectamine: 18324-012
Plus: 11514-015		  
p-azido-L-phenylalanine Chem-Impex International 6162  
  Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials
Maxima ML-3500S UV-A lamp Spectronics Corporation azF is activated by 365-nm light
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) Gibco 14065  
HEPES Irvine Scientific 9319  
Bovine serum albumin Roche 3117405001  
Tritium-labeled ligand From collaborator (Grunbeck et al., 2012)
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside Anatrace D310LA  
1D4-sepharose resin 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166  
NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels Invitrogen NP0322BOX SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Trans-Blot SD apparatus Biorad Apparatus for semi-dry transfer
Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Millipore IPVH00010  
Non-fat powered milk Fisher Scientific NC9934262  
Tween-20 Aldrich 274348  
Ecoscint A National Diagnostics LS-273 Scintillation fluid
Scintillation vials Fisher Scientific 333726  
LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter Perkin Elmer Beta-Scintillation counter
Anti-rhodopsin 1D4 mAb National Cell Culture Center custom  
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG KPL, Inc. 474-1806  
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 34080  
Hyblot CL AR film Denville E3018  
  Table 2. Targeted photocrosslinking materials
0.25% Trypsin Invitrogen 15050065  
FLAG-triarylphosphine Sigma GPHOS1  
M2 FLAG mAb Sigma F1804  
anti-CCR5 2D7 mAb BD Biosciences 555990  
Poly-D-lysine Sigma P6407  
96-well plate Costar 3601 Clear bottom, high binding EIA/RIA
Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium) Gibco 14040  
16% Paraformaldehyde EMS 28908  
HRP-conjugated KPL, Inc. 474-1516  
anti-rabbit IgG KPL, Inc. 474-1516  
Amplex Red Invitrogen A12222  
Hydrogen peroxide DE Healthcare Products 97-93399  
CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader Perseptive Biosystems  
  Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials
Fluorescein-phosphine (Huber et al., submitted 2012)
Nonapeptide (C9 peptide) AnaSpec 62190 Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside Anatrace D310LA  
1D4-sepharose resin 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels Invitrogen NP0322BOX SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner GE Healthcare discontinued Scanner with 488-nm wavelength laser
  Table 4. Fluorescent labeling materials

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References

  1. Huber, T., Menon, S., Sakmar, T. P. Structural basis for ligand binding and specificity in adrenergic receptors: Implications for GPCR-targeted drug discovery. Biochemistry. 47, 11013-11023 (2008).
  2. Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current opinion in structural biology. 21, 567-572 (2011).
  3. Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
  4. Wu, B., et al. Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists. Science. 330, 1066-1071 (2010).
  5. Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
  6. Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301, 964-967 (2003).
  7. Ye, S., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. The Journal of biological chemistry. 283, 1525-1533 (2008).
  8. Ye, S., Huber, T., Vogel, R., Sakmar, T. P. FTIR analysis of GPCR activation using azido probes. Nature chemical biology. 5, 397-399 (2009).
  9. Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464, 1386-1389 (2010).
  10. Singh, A., Thornton, E. R., Westheimer, F. H. The photolysis of diazoacetylchymotrypsin. The Journal of biological chemistry. 237, 3006-3008 (1962).
  11. Nakayama, T. A., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bovine rhodopsin determined by cross-linking using a photoactivatable analog of 11-cis-retinal. The Journal of biological chemistry. 265, 15762-15769 (1990).
  12. Chen, Q., Pinon, D. I., Miller, L. J., Dong, M. Molecular basis of glucagon-like peptide 1 docking to its intact receptor studied with carboxyl-terminal photolabile probes. The Journal of biological chemistry. 284, 34135-34144 (2009).
  13. Huang, K. S., Radhakrishnan, R., Bayley, H., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bacteriorhodopsin as studied by cross-linking using a photosensitive analog of retinal. The Journal of biological chemistry. 257, 13616-13623 (1982).
  14. Zoffmann, S., Turcatti, G., Galzi, J., Dahl, M., Chollet, A. Synthesis and characterization of fluorescent and photoactivatable MIP-1alpha ligands and interactions with chemokine receptors CCR1 and CCR5. Journal of medicinal chemistry. 44, 215-222 (2001).
  15. Janz, J. M., et al. Direct interaction between an allosteric agonist pepducin and the chemokine receptor CXCR4. Journal of the American Chemical Society. 133, 15878-15881 (2011).
  16. Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11020-11024 (2002).
  17. Hino, N., et al. Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid. Nature. 2, 201-206 (2005).
  18. Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50, 3411-3413 (2011).
  19. Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS chemical biology. 7, 967-972 (2012).
  20. Dunham, T. D., Farrens, D. L. Conformational changes in rhodopsin. Movement of helix f detected by site-specific chemical labeling and fluorescence spectroscopy. The Journal of biological chemistry. 274, 1683-1690 (1999).
  21. Maurel, D., et al. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nature. 5, 561-567 (2008).
  22. Huber, T., Sakmar, T. P. Escaping the flatlands: new approaches for studying the dynamic assembly and activation of GPCR signaling complexes. Trends in pharmacological sciences. 32, 410-419 (2011).
  23. Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
  24. Kiick, K. L., Saxon, E., Tirrell, D. A., Bertozzi, C. R. Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 19-24 (2002).
  25. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted [3 + 2] azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems. Journal of the American Chemical Society. 126, 15046-15047 (2004).
  26. Kolb, H. C., Sharpless, K. B. The growing impact of click chemistry on drug discovery. Drug discovery today. 8, 1128-1137 (2003).
  27. Huber, T., Botelho, A. V., Beyer, K., Brown, M. F. Membrane Model for the G-Protein-Coupled Receptor Rhodopsin: Hydrophobic Interface and Dynamical Structure. Biophys. J. 84, 2078-2100 (2004).
  28. Okada, T., et al. The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 Å crystal structure. J. Mol. Biol. 342, 571-583 (2004).
  29. Huber, T., Tian, H., Ye, S., Naganathan, S., Kazmi, M. A., Duarte, T., Sakmar, T. P. Bioorthogonal labeling of functional G protein-coupled receptors at genetically encoded azido groups. , submitted (2013).
  30. Naganathan, S., Ye, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Site-specific epitope tagging of GPCRs by bioorthogonal modification of a genetically-encoded unnatural amino acid. Biochemistry. , (2013).
  31. Molday, R. S., MacKenzie, D. Monoclonal antibodies to rhodopsin: characterization, cross-reactivity, and application as structural probes. Biochemistry. 22, 653-660 (1983).
  32. Gether, U., et al. Agonists induce conformational changes in transmembrane domains III and VI of the beta2 adrenoceptor. The EMBO journal. 16, 6737-6747 (1997).
  33. Hubbell, W. L., Altenbach, C., Hubbell, C. M., Khorana, H. G. Rhodopsin structure, dynamics, and activation: A perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking. Advances in Protein Chemistry; Membrane Proteins. 63, 243-290 (2003).
  34. Cai, K., Itoh, Y., Khorana, H. G. Mapping of contact sites in complex formation between transducin and light-activated rhodopsin by covalent crosslinking: use of a photoactivatable reagent. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4877-4882 (2001).
  35. Dorman, G., Prestwich, G. D. Benzophenone photophores in biochemistry. Biochemistry. 33, 5661-5673 (1994).
  36. Zhang, Z., et al. A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo. Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).
  37. Dirksen, A., Hackeng, T. M., Dawson, P. E. Nucleophilic catalysis of oxime ligation. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7581-7584 (2006).
  38. Yanagisawa, T., et al. Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification. Chemistry & biology. 15, 1187-1197 (2008).

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जेनेटिक्स अंक 79 रिसेप्टर्स जी प्रोटीन युग्मित प्रोटीन इंजीनियरिंग सिग्नल transduction जैव रसायन अप्राकृतिक अमीनो एसिड साइट निर्देशित mutagenesis जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर लक्षित photocrosslinking bioorthogonal लेबलिंग मिलान टैगिंग लक्षित
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Naganathan, S., Grunbeck, A., Tian, H., Huber, T., Sakmar, T. P. Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors. J. Vis. Exp. (79), e50588, doi:10.3791/50588 (2013).

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