Summary
우리의 GPCR의 다양한 타겟 위치에 부 자연스러운 아미노산, P-아지도-L-페닐알라닌을 유전자 인코딩 및 다른 응용 프로그램에서 아지 그룹의 다양성을 보여줍니다. 이들은 GPCR의 리간드 결합 주머니에 잔류를 확인하는 대상으로 광 가교 기술 및 펩티드 에피토프 태그 또는 형광 프로브의 GPCR의 특정 사이트 bioorthogonal 수정이 (가) 있습니다.
Abstract
단지 신호 G 단백질 결합 수용체 (GPCR)의 구조 및 동적 연구를 용이하게하기 위해 새로운 접근 방식은 수용체의 기능을 교란하지 않는 표현 수용체에 정보를 프로브 또는 라벨을 도입해야합니다. 우리는 유 전적으로 인코딩에 앰버 코돈 억제 기술을 사용 부자연 아미노산 heterologously 포유 동물 세포에서 발현의 GPCR의 다양한 표적 위치에서의 P-아지도-L-페닐알라닌 (AZF). 아지 그룹의 다양성은 그들 나라의 세포 환경이나 세제 용해 된 상태에서의 GPCR을 연구하는 다른 응용 프로그램에서 보여줍니다. 먼저, 트리튬 표지 된 저분자 리간드 유전자 부호화 아지 아미노산 가교 GPCR의 리간드 결합 포켓 잔기를 식별하는 셀 기반 타겟팅 광 가교 기술을 보여준다. 우리는 그 다음 bioorthogonal 딩거 (Staudinger) - BERTOZZI 결찰 REAC로의 GPCR의 사이트의 특정 변형을 보여 주포스 핀 유도체를 사용하는 아지 도기를 대상 기. 우리는 전체 세포 기반 ELISA 방법을 사용하여의 문화와 탐지 표현 막 단백질의 대상 펩티드 에피토프 태그에 대한 일반적인 전략에 대해 설명합니다. 마지막으로, 우리는 AZF-GPCR에 선택적 형광 프로브로 태그 될 수 있다는 것을 보여줍니다. 그들은 원칙적으로 활성 신호 복합체를 심문하는 GPCR을 발현 어느 임의의 아미노산 위치에 적용 할 수 있다는 점에서 논의 된 방법은 일반적이다.
Introduction
Heptahelical G 단백질 결합 수용체 (GPCR에)는 중요하고 다양한 세포 외 신호를 매개하는 매우 역동적 인 막 단백질의 거대 집단을 포함한다. 고전적인 패러다임에서, 수용체의 활성화는 리간드에 의한 구조적 변화와 연결되어있다. 1,의 GPCR의 구조 생물학에있는 최근 전진이 횡단 신호의 분자 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다. 3-5하지만, 더 큰 화학 정밀도와 이해 기능적인 메커니즘과 GPCR 신호의 구조 역학은, 접근 방법의 툴킷은 활성 신호 단지를 심문하는 정보를 분자 및 화학 프로브를 통합하는 데 필요합니다.
이를 위해, 우리는 사이트 구체적으로 이전 슐츠와 C에 의해 개척 억제 기술 코돈 호박을 사용하여 자연스러운 아미노산 (UAA) 돌연변이에 따라 표현 수용체에 비 또는 최소가 혼란 프로브를 소개하는 방법을 적용oworkers. 6 우리는 포유 동물 세포 이외의 대부분의 이종 시스템에서 표현하기 어려운의 GPCR과 같은 단백질에 대한 높은 수율의 발현 및 돌연변이 유발 시스템을 달성하기 위해 UAA 돌연변이 유발 방법을 최적화. 직교 설계 회로의 tRNA를 사용하여 특정 UAA에 대한 아미노 아실-tRNA의 합성 쌍을 진화, 우리는 사이트 구체적으로 표현 된 대상의 GPCR에 UAAs을 소개했다. UAAs의 성공적인 결합은, P-아세틸-L-페닐알라닌 (ACF), P-벤조일-L-페닐알라닌 (BZF), 및 p-아지도-L-페닐알라닌 (AZF) 우리의 모델의 GPCR에서 입증되었습니다 - 로돕신과 인간 CC 케모카인 수용체 CCR5. 7, 8
원칙적으로, UAA는 유전자 단백질 시퀀스 내에서 어떤 위치에 인코딩 할 수 있으며,이 목표 GPCR의 단일 코돈 스캔을 가능으로이 속성은 매우 중요한 생화학 적 도구입니다. 우리는 반응 AZI가 UAA, AZF의 다양성에 특별히 초점을 맞춘다부분을. 9 AZF 또한 인접 급 아민 또는 지방족 수소와 반응시켜 광활성 가교제로 사용될 수 고유의 적외선 (IR) 조사, 08로서 외에도. 또한, 생물학적으로 불활성 인 아지 도기는 bioorthogonal 라벨링 반응에서 선택적 화학 핸들로서 참여할 수있다. 여기에서 우리는 같은 함정을 대상으로 광 가교 수용체 - 리간드 복합체 및 bioorthogonal 에피토프 태그 형광 라벨 전략으로의 GPCR의 변경 등의 GPCR로 AZF의 사이트 별 법인의 유용한 응용 프로그램을 설명하는 예를 제시한다.
광활성 시약은 1960 년대 이후 생물 학적 시스템을 연구하는 데 사용되었습니다.이 기간에 10, 수용체 - 리간드 가교 실험의 풍부가 GPCR 복합체를 연구보고되고있다, 그 중 대부분은 photoaffinity 리간드의 사용을 포함. (11, 12) 그러나 이러한 그들은 요하는대로 응용 프로그램은 기술적으로 제한됩니다가교기를 함유 리간드의 전자 합성. 13-15 또한, 리간드의 가교제 잔기, 그것은 GPCR에 가교 결합의 위치를 식별하기 위해 도전. 사이트 구체적 진압 기술 코돈 황색하여 단백질로 UAAs 등 광 가교기를 도입하는 것은 귀중한 발전이다. 16,17 우리에서 수용체 - 리간드 복합체의 형성에 관여하는 수용체에 결합 인터페이스를 식별하는 광 가교 기법을 개발 GPCR에로 광 불안정성 그룹을 도입함으로써 세포를 살아. (18, 19) 여기에서 우리는 작은 분자 리간드의 결합 부위, CCR5에 삼중 마라 비록을 식별하기 위해 표적 광 가교 기술을 적용하기위한 실험 프로토콜 및 데이터 분석 방법을 서술. 이 방법은 리간드의 기본 화학 구조를 유지 이외에 방사성 리간드에 손잡이의 정확한 정량화에 대문자.
형광 기반 기술을 직접 수용체의 구조적 상태를 프로빙하여 수용체 활성화의 구조 기준의 정확한 이해를 지원합니다. (20), (21)는 그러나 GPCR에에 형광 라벨을 소개 할 수있는 유연성을 가진 기술이 사이트 구체적으로 제한됩니다. 우리는 GPCR 신호 복합체의 단일 분자 검출 (SMD)를 용이하게하기 위해 bioorthogonal 화학적 변형 전략을 채용에 관심이 있습니다. 22 아지 도기는 딩거 (Staudinger) - BERTOZZI 내고, 23, 24 동계 변형 승진 아 지드 - 같은 bioorthogonal 화학에 참여할 수 알킨 사이클로 (SpAAC) 25 구리 - 촉매 아 지드 - 알킨 사이클로 (CuAAC가). 26 우리는 아 지드와 포스의 특정 반응을 포함 딩거 (Staudinger) - BERTOZZI 결찰 반응에 초점을 맞춘다. 우리는 펩티드 에피토프 (FLAG 펩티드) 또는 형광 라벨에 접합 된 두 개의 다른 포스 핀 유도체의 사용을 보여GPCR에의 특정 사이트 변경을 달성하기 위해 (형광).
우리는 이전에 노출 된 용매이다 대상 사이트를 선택하는 X-선 결정 구조 및 동적 시뮬레이션을 사용 AZF 변이체 로돕신의 부위 특이 적 표지에 대한 조건을 최적화. 27, 28 우리는 또한 의해 배경 프리 라벨링을 달성하기위한 가능성 도시 딩거 (Staudinger)을 BERTOZZI 결찰. 29 우리는 여기에 면역 매트릭스에 고정하고 이후에 겔 형광에 의해 가시화되는 세제 용해 수용체의 형광 라벨을 달성하기 위해 사용되는 일반적인 과정을 보여줍니다. 또한, 우리는 알 수없는 구조, CCR5의 수용체에 대한 표시 의무가 위치를 식별하기 위해이 라벨 전략에 대한 편리한 확장을 보여줍니다. 이것은 AZF - GPCR은 세포 기반의 세미 높은 처리량 형식으로 변형 bioorthogonal 수정에 의존하는 대상 펩티드 에피토프 태그 전략을 사용하여 수행됩니다. (30)이방법은 라벨링 이벤트를 모니터하는 세포 표면 ELISA의 다단계 검출 특성을 이용한다.
우리가 여기서 논의 방법은 일반이며, 원칙적으로 억제 기술 코돈 호박을 사용하여 AZF로 통합 된 모든 GPCR에 적용 할 수 있습니다. 우리는 세부 사항의 GPCR의 구조와 역동적 인 연구를 용이하게하기 위해 부 자연스러운 아미노산 돌연변이 유발 방법과 그 이후의 응용 프로그램을 사용하여 같은 AZF 등 UAAs와 결합 수용체의 포유 동물 세포 발현하는 단계에서 제시하는 프로토콜에서.
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Protocol
1. GPCR에에 부 자연스러운 아미노산의 사이트 별 유전 설립
- 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 10 % 태아 소 혈청 (FBS)이 보충 된 DMEM에서 HEK293T 세포 (포도당 4.5 g / L, 2 mM의 글루타민)을 유지한다.
- 리포 펙 타민 플러스 시약을 사용하여 10-cm 접시에서 60-80% 합류로 성장 된 세포를 형질.
- 750 μL의 DMEM에, 원하는 위치에 황색 정지 코돈을 포함하는 10 ㎕의 플러스 시약, GPCR의 cDNA 3.5 μg (pMT4. RHO 또는 pcDNA를 3.1. CCR5), 3.5 회로의 tRNA의 cDNA (pSVB.Yam) ㎍의 0.35 μg을 추가 P-아지도-L-페닐알라닌 (pcDNA.RS)에 대한 돌연변이 아미노 아실 tRNA의 합성 효소의 cDNA. 15 분 동안 실온에서 배양한다. 또한 제어 역할을 중량 GPCR의 cDNA (앰버 정지 코돈을 함유하지 않는)를 사용하여 유사한 형질 전환을 수행한다. 17 μL의 리포 펙 타민과 DMEM 750 μL에이 혼합물을 추가합니다. 실온에서 15 분 동안 평형화 한 후 가져4 ML에 전체 볼륨.
- 10 cm의 접시에 대기음 매체는 세포에 형질 전환 혼합물을 적용하고, CO 2 분위기 5 %에서 37 ° C로 돌아갑니다. 4-6 시간 후, 20 % FBS와 1 ㎜ AZF을 포함하는 4 ML DMEM으로 세포를 보충합니다.
- 다음 날, DMEM 10 % FBS와 0.5 ㎜ AZF을 포함로 성장 매체를 교체하십시오.
- 수확 세포를 48 시간 후 형질 발현을 분석하거나 다음 절에서 설명 광 가교 또는 라벨링 절차를 진행합니다.
- 성장 미디어의 UAA의 존재에 GPCR 호박 돌연변이의 발현을 확인합니다. 우리는 서부 면역 블롯 검출하여이 작업을 수행. 를 Lyse 1 %의 세포 펠렛 (W / V) 20 MM 트리스 - 염산, pH의 도데 실-β-D-말토 (DDM) 7.5, 4 ℃에서 1 시간 동안 100 ㎜의 NaCl 16,000 XG에서 해물을 원심 분리기 및 SDS-PAGE에 의해 환원 조건에서 뜨는을 해결할 수 있습니다. PVDF 막에 옮기고 일을 사용하여 전체 길이의 수용체 발현을 검출하기 위해 면역 블롯 분석을 수행수용체의 C-말단에 설계 에피토프를 인식 전자는 1d4 단클론 항체 (국립 세포 배양 센터). 31
2. 표적 광 가교를 사용하여 리간드 결합 부위를 매핑
- 48 시간 사후 형질 세포에서 미디어를 대기음 4 ML 1X 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)로 교체. 15 분 동안 37 ° C로 돌아갑니다.
- 1X PBS로 세포를 재현 탁하고 팔콘 튜브에 전송할 수 있습니다. 펠릿 세포 상층 액을 흡인하기 위해 2 분 동안 1,500 rpm으로 원심 분리기.
- 20 mM의 HEPES, pH가 7.5, 0.2 % BSA 및 수용체 - 리간드 복합체 형성을 보장하기 위해 시간과 온도의 필요한 길이에 대한 바인딩 농도가 포화에 삼중 리간드를 함유하는 1X 행크 완충 소금물에서 세포 펠렛을 재현 탁.
- 4 ℃에서 15 분 동안 (예를 들어, UV-A 램프를 사용하여) 365 nm에서 AZF의 photoactivation의 24도 또는 96 - 웰 플레이트에 세포 현탁액을 전송 MaintaiN 얼음에 접시 샘플 가열 및 세포 용해를 방지 할 수 있습니다.
- 펠릿 세포 에펜 도르프 튜브, 원심 분리기에 세포를 전송하고, 상층 액을 제거하고 분석을 진행합니다. 펠릿은 향후 사용을 위해 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
- (w / v) DDM, 20 mM 트리스-HCl, pH7.5 및 프로테아제 억제제 1 %를 함유하는 용해 버퍼에서 세포 펠렛을 재현 탁. 4 ° C에서 1 시간 배양 한 후, 16,000 XG에 10 분 동안 세포 용 해물을 원심 분리, 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다.
- 상층 액에 1d4 개 단클론 항체 - 세 파로스 2B 수지를 추가하고 설계 C-말단는 1d4 단클론 항체의 항원을 사용하여 GPCR을 immunopurify 4 ° C에서 밤새 품어. 다음날 용해 버퍼와 비즈를 여러 번 씻는다. 동요와 함께 1 시간 동안 37 ° C에서 1 % SDS와 용출 샘플.
- 15 ㎖의 바이알 함유 신틸레이션 유체 용출액의 일부를 전송하고 일까지 삼중 리간드의 특이 적 결합의 양을 정량화하는 베타 섬광 계수기 의지전자 수용체.
- 표준 겔 전기 영동에 의해 나머지는 1d4 단클론 항체 정제 리제를 해결합니다. 우리는 4 내지 12 % SDS-PAGE 젤과 면역 블롯을위한 PVDF 막에 다음 세미 드라이 전송을 사용합니다. 우리는 또한 분자량의 시각적 접근을 안내하는 표준 단백질 사다리 레인이 (가) 있습니다.
- 0.05 % 트윈 -20을 함유하는 TBS 버퍼에 5 % 우유로 PVDF 멤브레인을 차단. HRP - 복합 항 - 마우스 IgG 이차 항체 다음 1d4 개 단클론 항체와 전체 길이 수용체 발현을 확인하기 위해 멤브레인을 조사.
- 강화 된 화학 발광 (ECL) 시약과 치료와 밴드를 시각화하기 위해 필름을 오토 라디오 그래피 멤브레인을 노출합니다.
- 특정 분자량 마커에서 절단하여 다음 각 샘플 차선을 분리하는 면도날로 막을 잘라. 섬광 액체가 들어있는 유리 병에 막 세그먼트를 전송합니다. 베타 섬광 계수기에서 계수함으로써 각각의 막 세그먼트에서 삼중 수소의 양을 정량화.
- 긍정적를 확인GPCR과 리간드의의 합과 동일 겉보기 분자 질량에서 삼중 수소의 검출과 photocrosslink.
3. 에피토프 태그 지정 및 세포 표면 효소 결합 면역 분석 (ELISA)을 대상으로
- 24 시간 후 형질, PBS 1X 1 ㎖로 세포를 씻어 3 분 1 ㎖의 0.25 %의 트립신를 Trypsinize. 10 % FBS와 0.5 ㎜ AZF를 포함 9 ML DMEM으로 보충합니다. 세포를 재현 탁하고 세포 밀도를 계산. 우리는 표준 혈구를 사용합니다.
- 0.01 ㎎ / 웰 당 ML 폴리 - D - 라이신 100 ㎖와 높은 결합, 분명 바닥 96 - 웰 플레이트를 사전 처리합니다. 1X PBS 및 공기 건조를 반복하여 세척하고 실온에서 30 분 동안 배양한다.
- 플레이트 (200) 6 × 10 4의 밀도에서 형질 세포의 μL - 8 × 10 4 세포 / 잘 96 - 웰 플레이트에와 CO 2 분위기 5 %에서 37 ° C로 돌아갑니다.
- 다음날 라벨에 대한 세포를 준비합니다. 부드럽게 100 μL / 잘 1X PBS의 T로 3 회 세척O 모든 AZF 포함 성장 미디어를 제거합니다. 세포는 PBS는 칼슘 2 + 2 + 및 Mg를 함유하여, 예를 들어, 부착 상태를 유지하도록.
- PBS에 5 ~ 20 ㎜로 유지되는 주식에서 1X HBSS / PBS에서 50 ~ 200 μM FLAG-트리 아릴 포스의 표지 시약을 준비합니다. 각 웰 (각 호박 돌연변이에 대한 세중) 60 ML을 적용하고 30 분 내지 4, 37 ° C로 돌아갑니다. 1X HBSS / PBS에 라벨 처리하지 않고 우물의 집합을 유지합니다. 또한 AZF - GPCR의 변형과 비교하는 중량 GPCR 컨트롤을 포함.
- 잘 차단 버퍼 100 μL /와 세포에게 3 번 씻으, BB (1X PBS, 0.5 % BSA)는, 완전 반응 라벨을 제거합니다.
- 세포 100 μL / 잘 (1X PBS에서 16 %의 주식에서 준비) 4 % 파라 포름 알데히드를 적용합니다. 실온에서 20 분 동안 배양한다. BB로 3 회 씻는다.
- 표지 된 수용체 및 수용체의 발현을 검출하기 위해 표준 세포 표면 ELISA 프로토콜을 수행한다. 차 뒤에 얼음에 1.5 시간 동안 차 항체와 부화실온에서 1 시간 동안 인큐베이션 tibody.
- FLAG-트리 아릴 포스의 표지 시약의 FLAG 펩티드 항원을 검출하기 위해 항-FLAG M2 항체 100 μL (BB에서 만들어진 항체의 예 1:2,000 희석)를 추가합니다. 또한 음성 대조군으로 비 라벨 처리 우물을 조사. 중량 또는 AZF - GPCR 세포 표면 발현을 결정하는 우물의 별도의 세트에 항체 (우리는 1:500 희석 사용) 방지 CCR5 2D7를 추가합니다.
- BB와 세포를 세 번 씻어 HRP - 복합 항 - 마우스 IgG 이차 항체 (1:2,000 희석) 100 μL에 품어.
- 조심스럽게 BB와 세포 다섯 번 씻는다. 50 μL 감지 버퍼 추가 Amplex 레드, 20 mM의 H 2 O 2, 1X PBS (1:10:90 비율)을 실온에서 15 분 알을 품다. λ의 예 = 530 형광 멀티 웰 플레이트 리더에 스펙트럼 데이터를 수집하고 λ는 EM은 590 =.
4. GPCR의 Bioorthogonal 형광 라벨링
- 를 Lyse중량 또는 AZF-로돕신이 1 %를 포함하는 1 ML의 용해 버퍼에 변형 (w / v)의 DM, 50 mM의 HEPES 또는 트리스 - 염산, 산도 6.8, 100 ㎜의 NaCl, 1 mM의 염화칼슘 및 단백질 분해 효소 억제제에 대한 1을 표현하는 10 7 수확 세포 4 ° C에서 시간 10 분 동안 15,000 XG에서 세포 용 해물을 원심 분리하고 상청액 분획을 수집한다.
- 설계 C 말단는 1d4의 항원을 사용하여 수용체를 캡처하는 100 μL는 1d4 - 단클론 항체 세 파로스 2B 수지를 추가합니다. 4 ℃에서 12 시간 동안 배양 0.1 M 인산 나트륨 완충액, pH가 7.3 (W / V) DDM 0.1 %로 수지를 세 번 씻으십시오.
- 면역 매트릭스 (1d4 개 - 단클론 항체 세 파로스 2B)에 고정 수용체를 레이블에 0.5 ㎖ - 0.3의 총 부피에 0.1 ㎜ 형광-포스를 추가합니다. 실온에서 12 시간 동안 배양한다. 원심 분리기 및 뜨는을 제거합니다. 미 반응 라벨을 제거하기 위해 수지를 씻으십시오.
- (w / v) DDM 0.33 ㎎ / ㎖ nonapeptide (1d4 개 에피토프에 대해 C9 펩티드) 0.1 %를 함유하는 100 ㎖의 용출 완충액으로 표지 된 수용체을 용출2 mM의 포스페이트 완충액에서 1 시간 동안 얼음 위에서 배양 pH를 6.0.
- 환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 표시된 샘플을 해결합니다. PBS에서 간단히 젤 씻어 다음에 젤 형광에 의해 AZF - GPCR의 라벨을 시각화. 예를 들어, 플루오 레세 인 변성 수용체를 검출하기 위해 488 nm 파장의 레이저 공 초점 형광 스캐너를 사용한다.
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Representative Results
우리는 - 특히 사이트 억제 기술 코돈 호박을 사용하여 GPCR에 분자 프로브를 소개하는 부 자연스러운 아미노산 돌연변이 유발 방법을 채택했다. 그림 1의 방식은 방법론의 돌출 단계와의 GPCR에, 다양한 UAA를, P-아지도-L-페닐알라닌 (AZF) 통합의 다양한 응용 프로그램을 설명합니다. 포유 동물 세포에 AZF - GPCR에의 발현은 리간드 광 가교를 대상으로하고, bioorthogonal 라벨 화학을 통해 펩티드 에피토프 태그 또는 GPCR의 형광 수정을 대상으로 할 수 있습니다.
광 가교 기술은 생균 GPCR의 리간드 복합체 (도 1A)의 구조적 양상을 조사하기 위해 사용될 수있다. 하나의 실험에서 얻은 대표 데이터는 그림 2와 같다. 19 여기에 우리가 앉아 바인딩을 식별 할 수있는 방사성 표지 작은 분자 리간드, 삼중 마라 비록을 사용CCR5에 전자. 이 예에서, AZF-CCR5를 발현하는 세포에 자외선 조사는 리간드에 민감한 방사성 태그를 사용하여 식별 할 수있는 공유 가교 단지에있는 삼중 수소 마라 비록의 결과를 미리 배양 변종입니다. 테스트 CCR5의 여러 위치 사이에, I28azF 및 W86azF은 상당히 높은 섬광 카운트 (빨간색 막대, 하단 패널, 그림 2)에 도시 된 바와 같이, 삼중 마라 비록을 photocrosslink 할 수 있었다. 중량 수용체 방사성 리간드에 어떤 가교를 보여 주었다.
Bioorthogonal 라벨 화학가 사용할 수있는 사이트 구체적으로 AZF - GPCR의 변형을 수정합니다. CCR5 및 로돕신 포스 핀 유도체 (계획 1)을 사용하여 우리는 두 개의 GPCR에 라벨을 붙이기 위해 딩거 (Staudinger) - BERTOZZI 내고 화학을 채택했다. 하나의 전략은 펩티드 결합 된 라벨 (그림 1b)를 사용하여 살아있는 세포의 GPCR의 대상 에피토프 태그를 포함한다. 우리는 하나의 실험을 설명하는 플래그 peptidE-트리 아릴 포스 라벨 시약은 사이트 구체적으로 사용하고 선택적으로 AZF-CCR5의 변형을 수정합니다. 도 3에서는이 FLAG 펩티드로 태그 된 위치. CCR5 조사에 위치의 사이 (30)를 식별하는 데 사용되는 민감하고 다단계 ELISA 검출 전략에서 대표 데이터를 표시, 모든 AZF-CCR5 변이체는 세포 표면 (적색에 나타냈다 그 중 바, 그림 3)과 약 절반은 성공적으로 (파란색 막대, 그림 3) 태그를 대상으로 항원을 시행 하였다. 중량 CCR5는 항-FLAG 신호의 부족에 의해 전시 된 에피토프 태그에 대한 부정적인 컨트롤을 역임했습니다. 대안 전략, 우리는 형광 - 복합 라벨 (그림 1C)와, 2B 수지 세파하는 복합 안티 - 1d4 개 단클론 항체로 면역 매트릭스에 고정 세제 용해 AZF-의 GPCR을 표시. 도 4에 도시 된 인 - 겔 형광 이미지는 성공적으로 형광을 보여예상에서 형광 밴드의 부재로 보이는 형광의 포스 핀 유도체를 사용 딩거 (Staudinger)-BERTOZZI 결찰하여 AZF 혼입 세 개의 다른 위치에서 GPCR, 로돕신의 라벨링. 29 예상대로, 중량 로돕신은 배경 라벨링 없었다 수용체의 분자량.
계획 1. 트리 아릴 포스 핀과 안정한 아미드 결합을 형성하는 부가 지드 사이 딩거 (Staudinger)-BERTOZZI 결찰 반응.
그림 1. 방식은 UAA (AZF) 및 해당 응용 프로그램에의의 사이트 별 법인을 설명 . 호박 정지 코돈 (UAG)를 인식하는 UAA, 직교 억제의 tRNA에 대한 구체적인 진화 직교 아미노 아실-tRNA의 합성을 : Tudy에 GPCR에 사이트 별 UAA 돌연변이가 수행 포유 동물 세포에 세 개의 분리 된 플라스미드의 공동 형질 전환에 의해 달성된다 및 원하는 위치에 TAG 돌연변이를 함유하는 GPCR을 코딩하는 유전자. UAA의 존재에 성장 세포 사이트 구체적으로 소개 AZF 전체 길이의 GPCR을 표현한다. 이러한 세포는 다음 () 리간드와 함께 배양과 GPCR과 리간드 사이에 가교를 식별하는 UV 빛으로 활성화, (b)는 펩타이드 복합 화학 레이블 문화 사이트 특히 에피토프 태그 GPCR에 이용 될 수있다 또는 (C) 다음 bioorthogonally 수용체 항체 - 복합 파로스 수지에 고정화되는 조건 하에서 형광 라벨이 수정의 GPCR을 정화하는 가용화.0588/50588fig1highres.jpg "대상 ="_blank "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오
그림 2. 삼중 리간드 GPCR의 대상으로 광 가교. 여기에 표시가 AZF-CCR5 변형 및 삼중 수소 표지 작은 분자 리간드, 마라 비록 사이의 가교 실험의 대표적인 결과이다. 상단 패널 : 테스트 AZF-CCR5 변종의 표현을 보여주는 전형적인 실험 후 생성 된 서양 면역 블롯. 컬러 세그먼트는 PVDF 막을 섬광 계수에 절단 위치를 선택하고 하단 패널에있는 막대 그래프에 그려진 검출 섬광 계수에 해당합니다. 빨간 부분은 수용체와 리간드 사이의 공유 결합 가교 복합 (40 kDa의 주위에) 예상 분자량을 나타냅니다.refore, 우리 AZF가 리간드 결합 포켓에 근접하고 리간드와 공유 결합 가교를 형성 할 수있는 수용체의 위치에 도입 된 경우에만 그 세그먼트에서의 삼중 수소를 감지 할 것으로 예상된다. 등 Grunbeck, A.,의 허가 (적응) 재판. 유전자 인코딩 된 사진 크로스 - 링커는 G 단백질 결합 수용체의 알로 스테 릭 약물의 결합 부위를 매핑합니다. ACS 화학 생물학 (7), 967-972 (2012). 저작권 (2012) 미국 화학 학회. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오
그림 3. . GPCR 상판의 대상 에피토프 태그의 ELISA 탐지 : HEK 293T의 CEL의 세포 표면 발현전체 세포 기반 ELISA (빨간색 막대)를 사용하여 안티 CCR5 단클론 항체 2D7으로 탐색 할 AZF-CCR5 변형 및 중량 및 모의 형질 컨트롤을 표현 LS. 하단 패널 : 같은 형질의 세포는 살아있는 세포에서 1 시간 동안 0.05 ㎜의 FLAG-트리 아릴 포스 핀으로 처리 한 후 각 위치 (파란색 막대)에서 펩티드 에피토프 태그의 범위를 결정하기 위해 항-FLAG M2 단클론 항체를 사용하여 이후의 ELISA에 의해 정량화 된 . 오차 막대는 둘 이상의 복제 데이터 세트에 대한 평균의 표준 오차를 나타낸다. 등 Naganathan, S.,의 허가 (적응) 재판. 유전자에 의해 코딩 부 자연스러운 아미노산의 bioorthogonal 수정하여 GPCR에의 사이트 별 에피토프 태그 생화학 DOI :. 10.1021/bi301292h (2013). 저작권 2013 년 미국 화학 학회. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오
그림 4. 다양한 위치. 중량 및 형광-포스로 표지 면역 매트릭스에 고정 AZF-로돕신 돌연변이에 포함 로돕신 AZF의 형광 표지. 정제 된 시료 4~12% SDS-PAGE에 의해 분리시키고, 도시의 겔 형광 이미지는 형광 검출을 위해 최적화 된 발광 필터 세트를 이용하여 488 ㎚의 공 초점 레이저 형광 스캐너로 촬영했다. 후버, T., 유전자 인코딩 아지 그룹에서 기능 G 단백질 결합 수용체의 등. Bioorthogonal 라벨에서 적응 그림. (2013)를 제출했다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오
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Discussion
우리의 GPCR에, 반응 조사, AZF의 사이트 별 편입 여기 강력한 방법을 설명하고의 GPCR의 구조와 역학을 연구하는이 도구의 세 가지 유용한 응용 프로그램을 보여줍니다. 우리의 방법이 사이트는, 구체적으로 UAAs 화학적 (32, 33)를 라벨 또는 단일 접근 시스테인 돌연변이에 photocrosslinkers 34 부착에 따라 다른 전략에 근본적인 문제를 우회 통합. 시스테인 티올 그룹을 대상으로 화학 형광 프로브를 부착하기 위해 사용 된,하지만, 이러한 전략은 시스테인 프리 단백질 배경의 생성을 필요로한다. 모든 GPCR에 적절한 수용체 기능을 유지하는 것이 필수적 일 수있다 많은 중 하나 이상의 시스테인을 소유 때문에 이것은 제한 될 수있다. 따라서, 화학 수정 의무 또는 UV 빛에 의해 활성화 될 수있는 UAA를 소개하는 가능성은 매우 매력적이다.
사 ž의 공유 결합 반응표적 분자와 oactivatable 가교제는 거리와 이웃 측 사슬에 따라 달라집니다. 따라서, 이들 프로브는 가교제로부터 특정 거리 내에 상호 작용을 식별하는, 예를 들면, 벤조 페 논계 가교제가 3의 거리 의존성을 갖도록 제안되어 이용 될 수있다. (35)는 이전에는 AZF 및 BZF, UAA를 모두 도입 리간드. (18, 19)이 기술의 일반적인 적용은 이러한 표지 된 리간드의 가용성 및 황색 돌연변이의 발생에 따라 표지 된 형광 또는 삼중에서 정의 된 거리 내에있는 GPCR에서 잔기를 확인하는 페논 반응성기를 함유 대상 GPCR의. 또한, 이론상이 타겟 광 가교 기법의 GPCR과 같은 G 단백질 또는 β-arrestin는 그들의 다른 결합 파트너 간의 상호 작용을 식별하기 위해 적용될 수있다. 이러한 가교 결합 연구로부터 얻은 데이터는 더 정확한 MO를 생성 할 수있다GPCR 신호 단지의 lecular 모델.
몇몇 bioorthogonal 화학 반응은 UAA 잔기의 부위 특이 적 변형을 허용 문헌에 기재되어있다. UAA, ACF는, 예를 들면 하이 드라 존 또는 옥심 결찰 반응에 참여할 수있는 케 토기를 가지고있다. 36, 37 우리는 이전에 비오틴 및 플루 오레 공액 시약으로 케토 그룹과 아지도 기의 변형을 비교 하였다. 29 우리 관측 표기된 아지 AZF의 그룹은 케 대응보다 훨씬 더 뛰어나다 bioorthogonal입니다. 따라서, 우리는 연속적으로 펩티드 에피토프 태그 또는 형광 라벨 두의 GPCR을 수정할 수 딩거 (Staudinger) - BERTOZZI 결찰의 사용에 초점을 맞추었다. 그것은 딩거 (Staudinger) - BERTOZZI 결찰은 라벨의 38 부 양론과 가난한 운동 특성을 나타내고 있다는 점에 주목할 필요가있다. 또한, 포스는 공기 산화에 매우 민감하다. 25 우리는 딩거 (Staudinger) 되실 것을 관찰rtozzi 결찰은 실온에서 12 시간 동안 배양 한 후 30 %의 라벨을 달성한다. 이러한 이유로 29, 우리가 현재와 같은 CuAAC 및 SpAAC 같은 대체 라벨 화학 물질을 평가하는 사이트 구체적으로 AZF-GPCR에 레이블을 지정합니다.
딩거 (Staudinger) - BERTOZZI 결찰 반응의 단점이기는하지만, 우리는 여기에 미래의 형광 라벨에 대한 액세스 대상 GPCR에 위치를 식별 할 수있는 살아있는 세포 펩티드 에피토프 태그 전략을 사용하는 방법을 보여줍니다. 또한이 에피토프 태깅 전략은 기본 시퀀스를 대체함으로써 전체 에피토프를 삽입 달리 단일 변경됨 잔기 에피토프 태그의 도입과 같은 많은 다른 유용한 애플리케이션을 갖는다. 이 기능은 극적 기능을 변경할 수있는 고도로 보존 된 루프 세그먼트의 길이와 시퀀스를 수정 이후의 GPCR과 구체적인 중요성이다. 마지막으로, 우리는 또한 형광, 엄마와 함께 GPCR에 레이블을 여기에 개념 증명 실험을 설명단일 분자 검출 실험에 적합 왕이 그들.
결론적으로,이 AZF의 GPCR의 구조 및 기능 연구를위한 다양한 도구이다. 우리는 AZF이 사이트 구체적으로 진압 시스템 코돈 호박을 사용하여 포유 동물 세포에서 발현의 GPCR에 포함될 것으로 나타났습니다. 이것은 단지 하나의 위치에서 GPCR의 수정을 허용합니다. 표지 된 수용체의 구조와 기능은 네이티브 세포막 환경이나 세제에 어느 평가 될 수있다. 우리는 지금 AZF 프로브의 유연성 GPCR의 신호 전달 복합체를 조사하기 위해 서 있습니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는 몇 가지 기초 및 자선 기증자의 관대 한 지원을 (SakmarLab.org 참조) 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid pSVB. Yam | (Ye et al., 2008) | ||
| Plasmid pcDNA.RS for azF | (Ye et al., 2009) | ||
| Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5 | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position | ||
| HEK 293T cells | Adherent cells | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 10566 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14200 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Lipofectamine Plus | Invitrogen | Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015 |
|
| p-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | 6162 | |
| Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials | |||
| Maxima ML-3500S UV-A lamp | Spectronics Corporation | azF is activated by 365-nm light | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14065 | |
| HEPES | Irvine Scientific | 9319 | |
| Bovine serum albumin | Roche | 3117405001 | |
| Tritium-labeled ligand | From collaborator (Grunbeck et al., 2012) | ||
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| 1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166 | |
| NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Trans-Blot SD apparatus | Biorad | Apparatus for semi-dry transfer | |
| Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Non-fat powered milk | Fisher Scientific | NC9934262 | |
| Tween-20 | Aldrich | 274348 | |
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | Scintillation fluid |
| Scintillation vials | Fisher Scientific | 333726 | |
| LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter | Perkin Elmer | Beta-Scintillation counter | |
| Anti-rhodopsin 1D4 mAb | National Cell Culture Center | custom | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG | KPL, Inc. | 474-1806 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
| Hyblot CL AR film | Denville | E3018 | |
| Table 2. Targeted photocrosslinking materials | |||
| 0.25% Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
| FLAG-triarylphosphine | Sigma | GPHOS1 | |
| M2 FLAG mAb | Sigma | F1804 | |
| anti-CCR5 2D7 mAb | BD Biosciences | 555990 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| 96-well plate | Costar | 3601 | Clear bottom, high binding EIA/RIA |
| Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium) | Gibco | 14040 | |
| 16% Paraformaldehyde | EMS | 28908 | |
| HRP-conjugated | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| anti-rabbit IgG | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 | |
| Hydrogen peroxide | DE Healthcare Products | 97-93399 | |
| CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader | Perseptive Biosystems | ||
| Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials | |||
| Fluorescein-phosphine | (Huber et al., submitted 2012) | ||
| Nonapeptide (C9 peptide) | AnaSpec | 62190 | Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH |
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner | GE Healthcare | discontinued | Scanner with 488-nm wavelength laser |
| Table 4. Fluorescent labeling materials |
References
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