Summary
Vi genetisk kode unaturlig aminosyre-, p-azido-L-fenylalanin ved forskjellige målrettede stillinger i GPCR og viser allsidigheten av azidogruppen i forskjellige anvendelser. Disse omfatter en målrettet photocrosslinking teknologi for å identifisere rester i det ligand-bindende lomme av et GPCR, og spesifikke bioorthogonal modifikasjon av GPCR med en peptid-epitop tag eller fluoriserende probe.
Abstract
For å legge til rette for strukturelle og dynamiske studier av G protein-koblet reseptor (GPCR) signal komplekser, er nye tilnærminger pålagt å innføre informative prober eller etiketter i uttrykt reseptorer som ikke forurolige reseptor funksjon. Vi brukte amber kodon undertrykkelse teknologi for å genetisk kode unaturlig aminosyre-, p-azido-L-fenylalanin (AZF) ved forskjellige målrettede stillinger i GPCR, heterologt uttrykt i pattedyrceller. Allsidigheten av azidogruppe er illustrert her i forskjellige applikasjoner for å studere GPCRs på sitt eget mobile miljøet eller under vaskemiddel oppløseliggjorte forhold. Først, viser vi et cellebasert rettet photocrosslinking teknologi for å identifisere rester i ligand-bindende lomme av GPCR hvor en tritium-merket små-molekyl ligand fornettes til en genetisk kodet aminosyre azido. Vi deretter demonstrere stedsspesifikk modifisering av GPCR av bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaksjonsjon som er rettet mot azidogruppe hjelp fosfin derivater. Vi diskuterer en generell strategi for målrettet peptid-epitop merking av uttrykte membran proteiner i-kulturen og dens påvisning ved hjelp av en hel-celle-baserte ELISA tilnærming. Til slutt viser vi at AZF-GPCRs kan selektivt merket med fluorescerende prober. De metoder som er diskutert er generelle ved at de i prinsippet kan anvendes på en hvilken som helst aminosyre posisjon i en hvilken som helst uttrykt GPCR for å avhøre aktive signaliseringskomplekser.
Introduction
Heptahelical G protein-koblede reseptorer (GPCR) omfatter en superfamily av svært dynamiske membran proteiner som formidler viktige og varierte ekstracellulære signaler. I den klassiske paradigme, er reseptoraktivering kombinert med ligand-indusert konformasjonsendringer. 1, har 2 Nyere fremskritt i strukturell biologi GPCRs gitt betydelig innsikt i de molekylære mekanismene for transmembrane signalering. 3-5 Men for å forstå med større kjemisk nøyaktighet funksjonell mekanisme og strukturelle dynamikken i GPCR signalering, er en verktøykasse av metoder som kreves for å innlemme informative molekylære og kjemiske prober å avhøre aktive signalkomplekser.
Til dette formål har vi tilpasset en metode for å site-spesifikt innføre non-eller minimalt perturbasjonsinnretningen sonder inn uttrykt reseptorer basert på unaturlig aminosyre (UAA) mutagenese ved hjelp av rav kodonet undertrykkelse teknologi tidligere utviklet av Schultz og coworkers. 6. Vi optimalisert UAA mutagenese metode for å oppnå et høyt utbytte ekspresjon og mutagenese-systemet for proteiner som GPCR, som er vanskelig å uttrykke i de heterologe systemer andre enn pattedyrceller. Ved hjelp av en rettvinklet konstruert suppressor tRNA og utviklet seg aminoacyl-tRNA syntetase pair for en bestemt UAA, vi site-spesifikt innført UAAS i uttrykt mål GPCRs. En vellykket inkorporering av UAAS, p-acetyl-L-fenylalanin (ACF), p-benzoyl-L-fenylalanin (BzF), og p-azido-L-fenylalanin (AZF) har blitt vist i vår modell GPCR - rhodopsin og human CC kjemokinreseptor, CCR5. 7, 8
I prinsippet kan en UAA være genetisk kodet til enhver posisjon innen protein sekvens og denne egenskapen er et uvurderlig biokjemiske verktøy som gjør det mulig single-kodon skanning av et mål GPCR. Vi fokuserer her spesielt på allsidighet av UAA, AZF, som har en reaktiv azigjøre resten. I tillegg til å tjene som et infrarødt lys (IR)-proben, 8, 9 AZF kan også tjene som en photoactivatable tverrbinder ved omsetning med nabo primære aminer eller alifatiske hydrogener. I tillegg kan den biologisk inert azidogruppen delta som en selektiv kjemisk håndtaket bioorthogonal merkingsreaksjoner. Her presenterer vi eksempler som illustrerer de nyttige anvendelser av stedsspesifikke inkorporering av AZF inn GPCRs, for eksempel målrettet photocrosslinking å felle en reseptor-ligand kompleks, og modifisering av GPCRs etter bioorthogonal epitop tagging og fluorescerende merking strategier.
Photoactivatable reagenser er blitt brukt til å studere biologiske systemer siden 1960-tallet. 10. I denne periode har en overflod av reseptor-ligand-tverrbindingseksperimenter rapportert å studere GPCR komplekser, hvorav de fleste er involvert ved bruk av photoaffinity ligander. 11, 12 er imidlertid disse applikasjoner er teknisk begrenset, da de require syntese av ligander som bærer et tverrbindingsgruppen. 13-15 Dessuten, med den tverrbinder resten i liganden, er det vanskelig å identifisere plasseringen av tverrbinding på GPCR. Site-spesifikt innføre photocrosslinking grupper som UAAS til proteiner ved hjelp av amber kodon undertrykkelse teknologi er et verdifullt fremskritt. 16. 17 Vi har utviklet en photocrosslinking teknikk for å identifisere bindingssystem på en reseptor som er involvert i dannelsen av et reseptor-ligand-kompleks i levende celler ved å innføre photolabile grupper i GPCR. 18., 19. Her beskriver vi den eksperimentelle protokoll og fremgangsmåte for dataanalyse for å anvende denne målrettede photocrosslinking teknologi for å identifisere bindingssetet for en små-molekyl ligand, tritiert maraviroc, på CCR5. Denne metoden drar nytte av den nøyaktig kvantifisering av det radioaktive håndtaket på ligand, i tillegg til å beholde den opprinnelige kjemiske struktur av liganden.
Fluorescens-baserte teknikker støtter entydig forståelse av den strukturelle basis for reseptoraktivering ved direkte sondering konformasjonsendring tilstand av reseptoren. 20. 21 Imidlertid innehar teknikkene fleksibilitet til å innføre fluorescerende merkelapper til GPCR sete-spesifikt begrenset. Vi er interessert i å ansette bioorthogonal kjemisk modifikasjon strategier for å legge til rette for single-molekyl deteksjon (SMD) av GPCR signal komplekser. 22 azidogruppen kan delta i bioorthogonal kjemi som Staudinger-Bertozzi ligation, 23, 24 kobber-free belastning-forfremmet azid- alkynet cycloaddition (SpAAC) 25 og kobber-katalysert azid-alkynet cycloaddition (CuAAC). 26. Vi fokuserer her på Staudinger-Bertozzi ligeringsreaksjon som involverer den spesifikke reaksjon mellom et azid og et fosfin. Vi viser bruken av to forskjellige fosfin-derivater, konjugert til et peptid-epitop (FLAG-peptid) eller en fluorescerende markør(Fluorescein) for å oppnå setespesifikke modifikasjon av GPCR.
Vi har tidligere optimalisert vilkårene for stedsspesifikke merking av rhodopsin AZF varianter å bruke X-ray krystallstruktur og dynamiske simuleringer for å velge målområder som er løsemiddel eksponert. 27, 28 Vi har også illustrert muligheten til å oppnå bakgrunn fritt merking av Staudinger- Bertozzi ligering. 29. Vi viser her den generelle fremgangsmåte anvendt for å oppnå fluorescerende merking av en detergent-solubilisert reseptor som er immobilisert på en immunoaffinitets matrise og deretter visualisert ved in-gel fluorescens. I tillegg viser vi en nyttig utvidelse på denne merking strategi for å identifisere stillinger mottagelig for merking på en reseptor med ukjent struktur, CCR5. Dette utføres ved hjelp av en målrettet peptid-epitop-merking strategi som baserer seg på bioorthogonal modifikasjon av AZF-GPCR-varianter i et cellebasert halv høy gjennomstrømning format. 30. DenneMetoden utnytter flertrinnsdeteksjon egenskapene til en celle-overflate ELISA for å overvåke etiketteringshendelser.
De metoder vi diskuterer her er generelle og i prinsippet kan brukes på alle GPCR innarbeidet med AZF å bruke den gule kodonet undertrykkelse teknologi. I protokollene som presenteres her vi detalj trinnene involvert i pattedyrceller uttrykk for reseptorer innlemmet med UAAS som AZF bruker unaturlig aminosyre mutagenesis metode og deres senere søknader til rette for strukturelle og dynamiske studier av GPCRs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Stedsspesifikke Genetisk Innlemmelse av unaturlig aminosyrer inn GPCRs
- Oppretthold HEK293T celler i DMEM (4,5 g / l glukose, 2 mM glutamin), supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i en 5% CO2 atmosfære.
- Transfektere cellene vokst til 60-80% samløpet i en 10-cm plate ved hjelp Lipofectamine Plus reagens.
- Til 750 mL DMEM, tilsett 10 mL Plus reagens, 3,5 mikrogram av GPCR cDNA (pMT4. Rho eller pcDNA 3.1. CCR5) som inneholder den gule stoppkodonet på et ønsket posisjon, 3,5 mikrogram av suppressor tRNA cDNA (pSVB.Yam) og 0,35 mikrogram av mutant amino-acyl-tRNA syntetase cDNA for p-azido-L-fenylalanin (pcDNA.RS). Inkuber ved romtemperatur i 15 min. Også utføre en lignende transfeksjon ved hjelp av vekt-GPCR cDNA (ikke inneholdende et gult stoppkodonet) for å tjene som en kontroll. Legg denne blandingen til 750 mL av DMEM med 17 mL Lipofectamine. Etter ekvilibrering i 15 min ved romtemperatur, bringetotalvolum på 4 ml.
- Sug media på 10-cm plate, gjelder transfeksjon blandingen til cellene, og gå tilbake til 37 ° C i 5% CO 2 atmosfæren. Etter 4-6 timer, supplere celler med 4 ml DMEM inneholdende 20% FBS og 1 mM AZF.
- Den neste dag, erstatte vekstmedier med DMEM inneholder 10% FBS og 0,5 mM AZF.
- Slakte celler 48 timer etter transfeksjon, for å analysere uttrykk eller gå videre til photocrosslinking eller merking prosedyrer som er beskrevet i de neste avsnittene.
- Bekrefte ekspresjon av GPCR rav mutant i nærvær av UAA i vekstmediet. Vi gjør dette ved Western immunoblot deteksjon. Lyse cellepelleten i 1% (w / v) dodecyl-β-D-maltoside (DDM) i 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl i 1 time ved 4 ° C. Sentrifuger lysatet ved 16.000 xg og løse supernatanten under reduserende betingelser ved SDS-PAGE. Overføring til en PVDF-membran og utføre immunoblot-analyse for å detektere full-lengde reseptorekspresjon ved hjelp the 1D4 MAB (National Cell Culture Center), som anerkjenner en konstruert epitop på C-terminus av reseptoren. 31
2. Kartlegging en ligandbindende nettsted Bruke Målrettet Photocrosslinking
- 48 timer post-transfeksjon, aspireres mediet fra cellene og erstatte med 4 ml 1 x fosfatbufret saltvann (PBS). Tilbake til 37 ° C i 15 min.
- Suspender cellene med 1x PBS og overføre til en Falcon tube. Sentrifuger ved 1500 rpm i 2 minutter for å pelletere cellene, og suge supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i 1x Hanks bufrede saltoppløsning inneholdende 20 mM HEPES, pH 7,5, 0,2% BSA, og den tritierte liganden ved å mette bindingskonsentrasjonen for den nødvendige lengden av tid og temperatur for å sikre reseptor-ligand-kompleksdannelse.
- Overfør cellesuspensjonen til en 24-brønn eller 96-brønners plate for fotoaktivering av AZF ved 365 nm (for eksempel bruke en UV-A-lampe) i 15 min ved 4 ° C. Vedlikehon plate på is for å unngå å sample oppvarming og cellelyse.
- Overfør cellene til et Eppendorf-rør, sentrifuge for å pelletere cellene, fjern supernatanten og fortsette til analyse. Pelletene kan lagres ved -20 ° C for fremtidig bruk.
- Resuspender cellepelletene i lyseringsbuffer inneholdende 1% (w / v) DDM, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, og protease-inhibitorer. Etter 1-timers inkubasjon ved 4 ° C, sentrifuger cellelysat i 10 min ved 16 000 xg, og supernatanten overføres til et nytt rør.
- Legg mAb 1D4-Sepharose 2B-harpiks til supernatanten og inkuber over natten ved 4 ° C for å immunopurify GPCR ved hjelp konstruert C-terminus mAb 1D4-epitopen. Neste dag vaskes kulene flere ganger med lyseringsbuffer. Eluere prøvene med 1% SDS ved 37 ° C i 1 time med risting.
- Overfør en andel av elueringsmiddel i et 15 ml hetteglass inneholdende scintillasjonsvæske og regne med en beta scintillasjonsteller for å kvantifisere mengden av spesifikk binding av den tritierte ligand til the-reseptoren.
- Løse de rester 1D4 MAB renset elueringsmiddel standard gel elektroforese. Vi bruker en 4-12% SDS-PAGE gel og deretter semi-tørr overføring til en PVDF-membran for immunoblotting. Vi har også et kjørefelt med standard protein stige for å veilede visuell tilnærming av molekylvekt.
- Blokker PVDF membran med 5% melk i TBS-buffer inneholdende 0,05% Tween-20. Probe membran for å bekrefte at full-lengde reseptorekspresjon med mAb 1D4, etterfulgt av HRP-konjugert anti-mus IgG sekundært antistoff.
- Unn med forbedret chemiluminescence (ECL) reagens og utsette membran å Autoradiografi film å visualisere band.
- Skjær membranen med et barberblad for å skille hver prøve kjørefelt, etterfulgt av å kutte på bestemte molekylvekt markører. Overfør segmenter membran til hetteglass som inneholder scintillasjonsvæske. Kvantifisere mengden av tritium i hver membransegment ved å telle i en beta-scintillasjonsteller.
- Identifiser den positivephotocrosslink med påvisning av tritium i den tilsynelatende molekylvekt er lik summen av den av GPCR, og liganden.
Tre. Målrettet Epitope Tagging og Cell Surface Enzyme-linked immunsorbent analyse (ELISA)
- 24 timer post-transfeksjon, vaskes cellene med 1 ml 1 x PBS og trypsinize med 1 ml 0,25% trypsin i 3 min. Supplere med 9 ml DMEM inneholder 10% FBS og 0,5 mM AZF. Suspender cellene og telle celletettheten. Vi bruker en standard hemocytometer.
- Pre-behandle en høy-bindende, klar-bunn 96-brønns plate med 100 ml 0,01 mg / ml poly-D-lysin per brønn. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur, vaskes flere ganger med 1 x PBS og lufttørket.
- Plate 200 pl av de transfekterte celler ved en tetthet på 6 x oktober 4 til 8 x 10 4 celler / brønn i 96-brønns plate og returnerer til 37 ° C i 5% CO2-atmosfære.
- Neste dag forberede celler for merking. Forsiktig vask tre ganger med 100 mL / brønn 1x PBS to fjerne AZF inneholder vekstmedier. Sikre celler forblir overholdt, for eksempel, ved å bruke PBS inneholdende Ca2 + og Mg 2 +.
- Forbered 50-200 mikrometer FLAG-triarylfosfin merkingsreagens i 1x HBSS / PBS fra et lager opprettholdt på 5-20 mm i PBS. Påfør 60 ml til hver brønn (in triplo for hvert rav mutant) og vende tilbake til 37 ° C i 30 minutter til 4 timer. Opprettholde et sett av brønner uten label behandling i 1x HBSS / PBS. Inkluderer også en wt GPCR kontroll for å sammenligne med AZF-GPCR varianter.
- Vask cellene 3 ganger med 100 ul / brønn av blokkeringsbuffer, BB (1 x PBS, 0,5% BSA), for å fjerne ikke-omsatt merket helt.
- Sett 100 ul / brønn av 4% paraformaldehyd (fremstilt fra en 16% lager i 1x PBS) til cellene. Inkuber i 20 min ved romtemperatur. Vask tre ganger med BB.
- Utfør standard celleoverflaten ELISA-protokollen til å oppdage merket reseptor og reseptor uttrykk. Inkuber med primært antistoff i 1,5 time på is etterfulgt av en sekundærtibody inkubasjon ved romtemperatur i 1 time.
- Legg 100 mL av anti-FLAG M2 antistoff (f.eks 1:2,000 fortynning av antistoff gjort i BB) for å oppdage FLAG peptidepitopen av FLAG-triarylfosfin merkingsreagens. Også probe ikke-label behandlede brønner som en negativ kontroll. Til anti-CCR5 2D7 (vi benytter en 1:500 fortynning) antistoff til et separat sett av brønner for å bestemme masse-eller AZF-GPCR celleoverflaten ekspresjon.
- Vask cellene tre ganger med BB, og inkuberes med 100 ul av HRP-konjugert anti-mus IgG sekundært antistoff (1:2,000 fortynning).
- Vask nøye celler fem ganger med BB. Tilsett 50 ul deteksjonsbuffer: Amplex Red, 20 mM H 2 O 2, 1 x PBS (1:10:90 ratio) og inkuber i 15 min ved romtemperatur. Samle spektrale data på en fluorescens multi-brønn plate leseren på λ ex = 530 og λ em = 590.
4. Bioorthogonal Fluorescent Merking av en GPCR
- Lyse10 7 høstede celler som uttrykker vekt-eller AZF-Rhodopsin varianter i 1 ml solubilization buffer inneholdende 1% (w / v) DM, 50 mM HEPES-eller Tris-HCl, pH 6,8, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl 2 og protease-inhibitorer i 1 time ved 4 ° C. Sentrifuger cellelysat ved 15.000 xg i 10 min, og samle supernatanten fraksjon.
- Tilsett 100 mL 1D4-MAB sefarose 2B harpiks å fange reseptor bruker konstruert C ende 1D4 epitop. Inkuber i 12 timer ved 4 ° C. Vask harpiksen tre ganger med 0,1% (w / v) DDM i 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 7,3.
- Til 0,1 mM Fluorescein-fosfin i et totalvolum på 0,3 til 0,5 ml for å merke reseptoren er immobilisert på immunoaffinitetskolonnerensing matrise (1D4-mAb sefarose 2B). Inkuber i 12 timer ved romtemperatur. Sentrifuger og fjern supernatanten. Vask harpiksen for å fjerne ureagert merket.
- Eluer merket reseptor med 100 ml elueringsbuffer inneholdende 0,1% (w / v) DDM og 0,33 mg / ml nonapeptide (C9 peptid mot 1D4-epitopen)i 2 mM fosfatbuffer, pH 6,0 ved inkubasjon på is i 1 time.
- Løse merkede prøver ved hjelp av SDS-PAGE under reduserende betingelser. Vask gels kort i PBS og deretter visualisere merking av AZF-GPCR av i-gel fluorescens. For eksempel bruke en confocal fluorescens skanner med en 488-nm bølgelengde laser for å oppdage reseptor modifisert med fluorescein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi benyttet den unaturlig aminosyre mutagenese metodikk til site-spesifikt innføre molekylære prober inn en GPCR hjelp av rav kodonet undertrykkelse teknologi. Ordningen i Figur 1 skisserer de viktigste trinnene i metodikken og de ulike anvendelser av å innlemme den allsidige UAA, p-azido-L-fenylalanin (AZF), inn GPCRs. Expression of AZF-GPCRs i pattedyrceller muliggjør målrettet photocrosslinking til ligander, og målrettet peptid-epitop tagging eller fluorescerende modifikasjoner av en GPCR via bioorthogonal merking kjemi.
Den photocrosslinking teknikken kan brukes til å undersøke de strukturelle aspekter av GPCR-ligand-komplekser i levende celler (Figur 1a). Representative data oppnådd fra et slikt eksperiment er vist i figur 2.. 19. Her har vi brukt et radioaktivt merket små-molekyl ligand, tritiert maraviroc, for å identifisere dets bindings site på CCR5. I dette eksemplet, UV-bestråling på celler som uttrykker AZF-CCR5-varianter pre-inkubert med tritiert maraviroc resulterer i kovalent tverrbundne komplekser som kan identifiseres ved hjelp av den følsomme radioaktivt merke på liganden. Blant de flere posisjoner på CCR5 testet, I28azF og W86azF var i stand til å photocrosslink til tritiumbehandlet maraviroc som avbildet med betydelig høyere scintillation tellinger (røde søyler, bunnpanelet, Figur 2). Den vekt-reseptoren viste ingen tverrbinding av den radioaktive ligand.
Bioorthogonal merking kjemi kan brukes til å site-spesifikt modifisere AZF-GPCR varianter. Vi benyttet den Staudinger-Bertozzi ligation kjemi å merke to GPCRs: CCR5 og rhodopsin bruker fosfin derivater (Skjema 1). En strategi innebærer målrettet epitope tagging av en GPCR i levende celler ved hjelp av et peptid-konjugert etiketten (Figur 1b). Vi viser et slikt eksperiment, hvor en FLAG peptide-triarylfosfin merkingsreagens brukes til å site-spesifikt og selektivt endre AZF-CCR5 varianter. I figur 3 viser vi representative data fra en følsom og flertrinns ELISA deteksjon strategi som brukes for å identifisere posisjonene som er merket med FLAG-peptid. 30 Blant de posisjoner på CCR5 undersøkt, ble alle AZF-CCR5-varianter uttrykt på overflaten av cellen (rød barer, figur 3) og omtrent halvparten av dem med hell gjennomgikk målrettet epitop merking (Søylene, figur 3). wt CCR5 fungert som en negativ kontroll for epitope tagging, utstilt ved mangel på anti-FLAG signal. I en alternativ strategi, vi merket vaskemiddel-solubilisert AZF-GPCR immobilisert på en immunoaffinitets matrise, som for eksempel anti-mAb 1D4 konjugert til Sepharose-2B-harpiks, med en fluorofor-konjugert etikett (Figur 1c). Den in-gel fluorescens bildet vist i fig 4 viser den vellykkede fluorescerendeMerkingen av GPCR, rhodopsin, i tre forskjellige posisjoner innlemmet med AZF ved Staudinger-Bertozzi ligering ved hjelp av en fosfin-derivat av fluorescein. 29. Som forventet, wt rhodopsin viste ingen bakgrunnsmerking som sees ved fraværet av et fluoriserende bånd på den forventede molekylvekt av reseptoren.
Scheme en. Den Staudinger-Bertozzi ligerings-reaksjon mellom et triarylfosfin og et azid for å danne en stabil amid-bundet addukt.
Figur 1. Scheme illustrerer stedsspesifikke inkorporering av en UAA (AZF) og dets applikasjoner til S . tudy GPCRs Stedsspesifikk UAA mutagenese oppnås ved co-transfeksjon av tre separate plasmider i pattedyrceller som bærer: en utviklet ortogonal amino acyl-tRNA syntetase spesifikk for UAA, en ortogonal suppressor tRNA som gjenkjenner en amber stoppkodonet (UAG) og genet som koder for GPCR som inneholder en TAG-mutasjon i en ønsket posisjon. Celler dyrket i nærvær av UAA uttrykker et full-lengde GPCR med en sete-spesifikt innført AZF. Disse cellene kan deretter være (a) inkuberes med ligand og aktivert med UV-lys for å identifisere tverrbindinger mellom en GPCR og dens ligand, (b) som brukes til sete-spesifikt epitop tag-en GPCR i kultur med en peptid-konjugert kjemisk etikett, eller (c) oppløst for å rense GPCR, som deretter bioorthogonally modifisert med en fluorescerende markør under betingelser hvor reseptoren er immobilisert på et antistoff-konjugert sefarose-harpiks.0588/50588fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde
Figur 2. Målrettet photocrosslinking av en GPCR til en tritierte ligand. Vist her er de representative resultater fra en tverrbindings eksperiment mellom AZF-CCR5 varianter og en tritium-merket lite molekyl ligand, maraviroc. Øvre panel: The Western immunoblotanalyse ble generert etter en typisk forsøk, som viser ekspresjonen av de testede AZF-CCR5-varianter. De fargede segmenter markere hvor PVDF membran ble kuttet for scintillasjonstelling og svarer til de oppdagede scintillation teller tegnet inn i søylediagrammet i det nederste panelet. Den røde segment representerer den forventede molekylmasse (omtrent 40 kDa) av den kovalente tverrbundne kompleks mellom reseptor og ligand. Dendifor vil vi forvente å detektere tritium i disse segmenter når AZF innføres ved en posisjon i reseptoren som er i umiddelbar nærhet til den ligand-bindende lomme, og kan danne en kovalent tverrbinding med liganden. Gjengitt (tilpasset) med tillatelse fra Grunbeck, A., et al. Genetisk kodede foto-kryssbindere kartlegge bindingssetet til et allosterisk stoff på en G-protein-koblet reseptor. ACS Chemical Biology 7, 967-972 (2012). Copyright (2012) American Chemical Society. Klikk her for å se større bilde
Figur 3. ELISA deteksjon av målrettet epitop-tagging av en GPCR Topplate:. Cell overflate uttrykk for HEK 293T cells uttrykker AZF-CCR5 varianter og wt og mock transfekterte kontroller analysert med anti-CCR5 MAB 2D7 bruker hele cellebasert ELISA (røde søyler). Bunnplate: Celler fra den samme transfeksjon ble behandlet med 0,05 mM FLAG-triarylfosfin i 1 time i levende celler og deretter kvantifisert ved etterfølgende ELISA ved bruk av anti-FLAG mAb M2 for å bestemme graden av peptid-epitop-merking ved hver posisjon (Søylene) . Feil søylene representerer standard feil av gjennomsnittet for to eller flere replikere datasett. Gjengitt (tilpasset) med tillatelse fra Naganathan, S., et al. Stedsspesifikk epitope merking av GPCR ved bioorthogonal modifisering av en genetisk kodet unaturlig aminosyre Biokjemi DOI:. 10.1021/bi301292h (2013). Copyright (2013) American Chemical Society. Klikk her for å se større bilde
Figur 4 Fluorescent merking av rhodopsin AZF innlemmet i forskjellige posisjoner. Vekt og AZF-Rhodopsin mutanter immobilisert på en immunoaffinitets matrise merket med fluorescein-fosfin.. Rensede prøver ble separert ved 4-12% SDS-PAGE, og den in-gel fluorescens bildet vist ble tatt med en konfokal 488-nm laser fluorescens skanner ved hjelp av en emisjonsfiltersettet fluorescein optimalisert for deteksjon. Figur tilpasset fra Huber, T., et al. Bioorthogonal merking av funksjonelle G protein-koblede reseptorer ved genetisk kodede azido grupper. legges (2013). Klikk her for å se større bilde
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver her en robust metode for stedsspesifikke inkorporering av en reaktiv sonde, AZF, inn GPCRs og demonstrere tre nyttige anvendelser av dette verktøyet for å studere strukturen og dynamikken i GPCRs. Vår metode for å site-spesifikt innlemme UAAS omgår et grunnleggende problem med en alternativ strategi som er basert på kjemisk merking 32, 33 eller feste fotokryssbindere 34 til en enkelt tilgjengelig cystein mutant. Selv om kjemi som er rettet mot cystein tiol grupper har blitt brukt til å feste fluorescerende prober, nødvendiggjør en slik strategi generering av en cystein-fri protein bakgrunn. Dette kan være begrensende siden alle GPCR har mer enn ett cystein, hvorav mange kan være avgjørende for å opprettholde riktig reseptorfunksjonen. Derfor er muligheten for å innføre en UAA som er mottagelig for kjemisk modifikasjon eller de kan bli aktivert av UV-lys svært attraktiv.
Den covalent reaksjon av en bildetoactivatable crosslinker med et mål molekyl er avhengig av avstand og nabosidekjeder. Derfor kan disse probene bli anvendt til å identifisere interaksjoner som er innenfor en bestemt avstand fra tverrbinder, for eksempel, er benzofenon-baserte tverrbindingsmidler foreslått å ha en avstand avhengighet av 3 Å. 35. Vi har tidligere innført både AZF og BzF, en UAA inneholder en benzophenone reaktiv gruppe, for å identifisere rester i en GPCR som er innenfor en definert avstand fra en fluorescein eller tritium merket ligand. 18, 19 Den generelle anvendelsen av denne teknologien er berre avhengig av tilgjengeligheten av slike markerte ligander og generering av rav mutanter av et mål GPCR. I tillegg, i teorien denne målrettede photocrosslinking teknikken kan bli anvendt for å identifisere interaksjoner mellom GPCR og deres andre bindingspartnere som for eksempel en G-protein eller β-arrestin. Dataene oppnådd fra disse tverrbindingsstudier kan bli brukt til å lage mer nøyaktig molecular modeller av GPCR signalkomplekser.
Flere bioorthogonal kjemiske reaksjoner er blitt beskrevet i litteraturen som gjør det mulig for den setespesifikke modifikasjon av UAA rester. Den UAA, ACF, for eksempel, i besittelse av en keto-gruppe som kan delta i hydrazone eller oksim ligation reaksjoner. 36, 37 Vi har tidligere i forhold til endring av keto-grupper og azido grupper med biotinylerte og fluoriscerende konjugerte reagenser. 29 Våre observasjoner indikerte at azido gruppe AZF er virkelig mer bioorthogonal enn sin keto motstykke. Derfor senere fokuserte vi på bruken av Staudinger-Bertozzi ligation å modifisere to GPCRs med en peptidepitopen tag eller et fluorescerende etiketten. Det er verdt å merke seg imidlertid at Staudinger-Bertozzi ligation viser sub-støkiometriske 38 og fattige kinetiske egenskaper av merking. Videre fosfiner er svært utsatt for luft oksidasjon. 25 Vi har observert at Staudinger-Bertozzi ligation bare oppnår 30% merking etter inkubasjon i 12 timer ved romtemperatur. 29 For disse grunner, er vi for tiden evaluerer alternative merking kjemi som CuAAC og SpAAC til site-spesifikt merke AZF-GPCR.
Riktignok ulempene ved Staudinger-Bertozzi ligation reaksjoner, viser vi her bruk av en levende celle-peptid-epitop-merking strategi for å identifisere posisjoner på et mål GPCR som er tilgjengelig for fremtidig fluorescerende merking. I tillegg har denne epitop-merking strategi rekke andre nyttige bruksområder, for eksempel, innføring av en epitop tag på et enkelt modifisert residuum i motsetning til å sette hele epitop ved å erstatte innfødte sekvenser. Dette trekk er av spesiell betydning med GPCR, siden den endrer lengden og sekvensen av høyt konservert sløyfe segmenter kan dramatisk endre funksjon. Til slutt har vi også illustrert her de proof-of-concept eksperimenter å merke GPCRs med fluorophores, makongen dem egnet for single-molekyl gjenkjenning eksperimenter.
I konklusjonen, er AZF et allsidig verktøy for studiet av struktur og funksjon av GPCR. Vi har vist at AZF er site-spesifikt innlemmet i GPCRs uttrykt i pattedyrceller ved hjelp av den gule kodonet undertrykkelse system. Dette gir mulighet for modifisering av en GPCR ved bare en enkelt posisjon. Strukturen og funksjonen av den merkede reseptor kan deretter bli evaluert enten i den opprinnelige plasma membran miljø eller i en detergentoppløsning. Vi er nå klar til å undersøke GPCR signalkomplekser med fleksibiliteten i AZF sonde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker sjenerøs støtte fra flere stiftelser og filantropiske donorer (se SakmarLab.org).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid pSVB. Yam | (Ye et al., 2008) | ||
| Plasmid pcDNA.RS for azF | (Ye et al., 2009) | ||
| Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5 | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position | ||
| HEK 293T cells | Adherent cells | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 10566 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14200 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Lipofectamine Plus | Invitrogen | Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015 |
|
| p-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | 6162 | |
| Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials | |||
| Maxima ML-3500S UV-A lamp | Spectronics Corporation | azF is activated by 365-nm light | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14065 | |
| HEPES | Irvine Scientific | 9319 | |
| Bovine serum albumin | Roche | 3117405001 | |
| Tritium-labeled ligand | From collaborator (Grunbeck et al., 2012) | ||
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| 1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166 | |
| NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Trans-Blot SD apparatus | Biorad | Apparatus for semi-dry transfer | |
| Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Non-fat powered milk | Fisher Scientific | NC9934262 | |
| Tween-20 | Aldrich | 274348 | |
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | Scintillation fluid |
| Scintillation vials | Fisher Scientific | 333726 | |
| LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter | Perkin Elmer | Beta-Scintillation counter | |
| Anti-rhodopsin 1D4 mAb | National Cell Culture Center | custom | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG | KPL, Inc. | 474-1806 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
| Hyblot CL AR film | Denville | E3018 | |
| Table 2. Targeted photocrosslinking materials | |||
| 0.25% Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
| FLAG-triarylphosphine | Sigma | GPHOS1 | |
| M2 FLAG mAb | Sigma | F1804 | |
| anti-CCR5 2D7 mAb | BD Biosciences | 555990 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| 96-well plate | Costar | 3601 | Clear bottom, high binding EIA/RIA |
| Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium) | Gibco | 14040 | |
| 16% Paraformaldehyde | EMS | 28908 | |
| HRP-conjugated | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| anti-rabbit IgG | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 | |
| Hydrogen peroxide | DE Healthcare Products | 97-93399 | |
| CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader | Perseptive Biosystems | ||
| Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials | |||
| Fluorescein-phosphine | (Huber et al., submitted 2012) | ||
| Nonapeptide (C9 peptide) | AnaSpec | 62190 | Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH |
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner | GE Healthcare | discontinued | Scanner with 488-nm wavelength laser |
| Table 4. Fluorescent labeling materials |
References
- Huber, T., Menon, S., Sakmar, T. P. Structural basis for ligand binding and specificity in adrenergic receptors: Implications for GPCR-targeted drug discovery. Biochemistry. 47, 11013-11023 (2008).
- Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current opinion in structural biology. 21, 567-572 (2011).
- Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Wu, B., et al. Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists. Science. 330, 1066-1071 (2010).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301, 964-967 (2003).
- Ye, S., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. The Journal of biological chemistry. 283, 1525-1533 (2008).
- Ye, S., Huber, T., Vogel, R., Sakmar, T. P. FTIR analysis of GPCR activation using azido probes. Nature chemical biology. 5, 397-399 (2009).
- Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464, 1386-1389 (2010).
- Singh, A., Thornton, E. R., Westheimer, F. H. The photolysis of diazoacetylchymotrypsin. The Journal of biological chemistry. 237, 3006-3008 (1962).
- Nakayama, T. A., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bovine rhodopsin determined by cross-linking using a photoactivatable analog of 11-cis-retinal. The Journal of biological chemistry. 265, 15762-15769 (1990).
- Chen, Q., Pinon, D. I., Miller, L. J., Dong, M. Molecular basis of glucagon-like peptide 1 docking to its intact receptor studied with carboxyl-terminal photolabile probes. The Journal of biological chemistry. 284, 34135-34144 (2009).
- Huang, K. S., Radhakrishnan, R., Bayley, H., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bacteriorhodopsin as studied by cross-linking using a photosensitive analog of retinal. The Journal of biological chemistry. 257, 13616-13623 (1982).
- Zoffmann, S., Turcatti, G., Galzi, J., Dahl, M., Chollet, A. Synthesis and characterization of fluorescent and photoactivatable MIP-1alpha ligands and interactions with chemokine receptors CCR1 and CCR5. Journal of medicinal chemistry. 44, 215-222 (2001).
- Janz, J. M., et al. Direct interaction between an allosteric agonist pepducin and the chemokine receptor CXCR4. Journal of the American Chemical Society. 133, 15878-15881 (2011).
- Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11020-11024 (2002).
- Hino, N., et al. Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid. Nature. 2, 201-206 (2005).
- Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50, 3411-3413 (2011).
- Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS chemical biology. 7, 967-972 (2012).
- Dunham, T. D., Farrens, D. L. Conformational changes in rhodopsin. Movement of helix f detected by site-specific chemical labeling and fluorescence spectroscopy. The Journal of biological chemistry. 274, 1683-1690 (1999).
- Maurel, D., et al. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nature. 5, 561-567 (2008).
- Huber, T., Sakmar, T. P. Escaping the flatlands: new approaches for studying the dynamic assembly and activation of GPCR signaling complexes. Trends in pharmacological sciences. 32, 410-419 (2011).
- Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
- Kiick, K. L., Saxon, E., Tirrell, D. A., Bertozzi, C. R. Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 19-24 (2002).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted [3 + 2] azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems. Journal of the American Chemical Society. 126, 15046-15047 (2004).
- Kolb, H. C., Sharpless, K. B. The growing impact of click chemistry on drug discovery. Drug discovery today. 8, 1128-1137 (2003).
- Huber, T., Botelho, A. V., Beyer, K., Brown, M. F. Membrane Model for the G-Protein-Coupled Receptor Rhodopsin: Hydrophobic Interface and Dynamical Structure. Biophys. J. 84, 2078-2100 (2004).
- Okada, T., et al. The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 Å crystal structure. J. Mol. Biol. 342, 571-583 (2004).
- Huber, T., Tian, H., Ye, S., Naganathan, S., Kazmi, M. A., Duarte, T., Sakmar, T. P. Bioorthogonal labeling of functional G protein-coupled receptors at genetically encoded azido groups. , submitted (2013).
- Naganathan, S., Ye, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Site-specific epitope tagging of GPCRs by bioorthogonal modification of a genetically-encoded unnatural amino acid. Biochemistry. , (2013).
- Molday, R. S., MacKenzie, D. Monoclonal antibodies to rhodopsin: characterization, cross-reactivity, and application as structural probes. Biochemistry. 22, 653-660 (1983).
- Gether, U., et al. Agonists induce conformational changes in transmembrane domains III and VI of the beta2 adrenoceptor. The EMBO journal. 16, 6737-6747 (1997).
- Hubbell, W. L., Altenbach, C., Hubbell, C. M., Khorana, H. G. Rhodopsin structure, dynamics, and activation: A perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking. Advances in Protein Chemistry; Membrane Proteins. 63, 243-290 (2003).
- Cai, K., Itoh, Y., Khorana, H. G. Mapping of contact sites in complex formation between transducin and light-activated rhodopsin by covalent crosslinking: use of a photoactivatable reagent. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4877-4882 (2001).
- Dorman, G., Prestwich, G. D. Benzophenone photophores in biochemistry. Biochemistry. 33, 5661-5673 (1994).
- Zhang, Z., et al. A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo. Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).
- Dirksen, A., Hackeng, T. M., Dawson, P. E. Nucleophilic catalysis of oxime ligation. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7581-7584 (2006).
- Yanagisawa, T., et al. Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification. Chemistry & biology. 15, 1187-1197 (2008).
