Summary
Biz GPCRs çeşitli hedef konumlarda doğal olmayan amino asit, p-azido-L-fenil alanin-kodlayan ve genetik olarak farklı uygulamalarda Azido grubunun çok yönlülüğünü gösterir. Bunlar, bir GPCR olan ligand bağlama cebinde tortuları tanımlamak için hedef foto-çapraz teknolojisi ve bir peptid epitop ya da flüoresan probu ile GPCRs alana özgü bioorthogonal modifikasyonunu içerir.
Abstract
Kompleksler sinyal G protein-eşli reseptör (GPCR) yapı ve dinamik çalışma kolaylaştırmak için, yeni yaklaşımlar reseptör fonksiyonunu bozmayan ifade edilen reseptörlerine bilgi sondaları veya etiket tanıtmak için gereklidir. Bu genetik olarak kodlamak için amber kodonunun bastırılması teknolojisi kullanılan doğal olmayan bir amino asit, heterolog memeli hücrelerinde ifade GPCRs çeşitli hedef konumlarda p-azido-L-fenilalanin (azf). Azido grubunun çok yönlülüğü kendi doğal hücre ortamında veya deterjan çözündürülmüş koşullar altında GPCR'ler çalışma için farklı uygulamalar burada gösterilmektedir. İlk olarak, bir trityum etiketli küçük moleküllü ligand genetik olarak kodlanmış bir azido amino asit çapraz bağlı bir GPCR olan ligand bağlama cebinde kalıntılarını belirlemek için hücre bazlı bir foto-çapraz hedeflenen teknoloji göstermektedir. Daha sonra bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligasyon mina ile reaksiyona göre GPCRs siteye özgü modifikasyonunu göstermekfosfin türevleri kullanılarak azido grubunu hedef tion. Biz, bir bütün hücre bazlı bir ELISA yaklaşım kullanarak in-kültür ve algılama ifade zar proteinlerinin hedef peptide epitop etiketleme için genel bir strateji tartışılmıştır. Son olarak, AZF-GPCR'ler seçici floresan probları ile etiketlendi edilebileceğini göstermektedir. Ilke olarak aktif bir sinyal kompleksi sorgulamak için GPCR ifade edilen herhangi bir amino asit pozisyonunda uygulanabilir olduğu tartışılan yöntemler, geneldir.
Introduction
Heptahelikal G-protein bağlı reseptörler (GPCR'ler) önemli ve çeşitli hücre-dışı sinyallerin aracılık eden yüksek dinamik zar proteinlerinin bir üst ailesidir içermektedir. Klasik paradigmada, reseptör aktivasyonu ligand bağlı şekilsel değişiklikleri ile birleştirilmiştir. 1 GPCRs yapısal biyoloji 2 Son gelişmeler zar sinyalizasyon moleküler mekanizmaları üzerinde önemli fikir vermiştir. 3-5 Ancak, daha büyük kimyasal hassasiyet ile anlamak için fonksiyonel mekanizma ve GPCR'dir sinyal yapısal dinamikleri, yaklaşımları bir araç aktif bir sinyal kompleksleri sorgulamak için bilgilendirici moleküler ve kimyasal sondalar dahil etmek gereklidir.
Bu amaçla, site-spesifik olarak, daha önce Schultz ve c öncülük bastırma teknolojisi kullanılarak amber kodonu doğal olmayan amino asit (UAA) mutagenez göre ifade edilen reseptörlerine olmayan veya minimal bozucu probları tanıtmak için bir yöntem adapteoworkers. 6 Bu örneğin memeli hücreleri dışındaki çok heterolog ifade sistemlerinin zordur GPCRs gibi proteinler için yüksek verim ekspresyonu ve mutagenez sistem elde etmek için UAA mutagenez yöntemi optimize edilmiştir. Ortogonal bir mühendislik bastırma tRNA kullanarak ve belirli bir UAA için aminoasil-tRNA sentetaz çifti gelişti, site-spesifik ifade hedef GPCRs içinde UAA'lar tanıttı. UAAS başarıyla dahil edilmesi, p-asetil-L-fenilalanin (ACF), p-benzoil-L-fenilalanin (BZF) ve p-azido-L-fenilalanin (azf) bizim modeli GPCRs olarak gösterilmiştir - rodopsin ve insan CC kemokin alıcısı, CCR5. 7, 8
Prensip olarak, bir UAA genetik olarak protein dizisi içinde herhangi bir pozisyonda kodlanabilir ve bir hedef GPCR tek kodon tarama olanak olarak bu özelliği bir değerli biyokimyasal bir araçtır. Biz bir reaktif Azi olan UAA, azf, çok yönlülük, özellikle burada odakparçasını yapmak. 9 AZF aynı zamanda komşu birincil aminler ya da alifatik hidrojenlerin ile reaksiyona sokularak bir ışıkla çapraz bağlayıcı olarak hizmet edebilir, bir kızıl ötesi (IR) probu, 8, olarak hizmet ek olarak. Buna ek olarak, biyolojik açıdan atıl azido grubu bioorthogonal etiketleme reaksiyonlarda bir seçici kimyasal tutma yeri olarak katılabilir. İşte biz böyle tuzak hedefli foto çapraz bir reseptör-ligand kompleksi ve bioorthogonal epitop etiketleme ve floresan etiketleme stratejilerinin GPCRs modifikasyonu gibi GPCRs, içine AZF site-spesifik esas yararlı uygulamaları gösteren örnekler sunuyoruz.
Işıkla aktive reaktifler 1960'lardan beri biyolojik sistemler incelemek için kullanılmıştır. Bu dönemde 10, reseptör-ligand çapraz bağlama deneylerinin bir bolluk GPCR kompleksleri incelemek için rapor edilmiştir, burada en fotoafinite ligandları kullanımını içeriyordu. 11, 12 Bununla birlikte, bu Onlar gerektirmeyen gibi uygulamalar teknik, sınırlıBir çapraz bağlama grubu taşıyan ligandların e sentezi. 13-15 Ayrıca, liganddaki çapraz bağlayıcı parça ile, bu GPCR'nin üzerinde çapraz link yerini belirlemek zordur. Site özel bastırma teknolojisi kodonu kullanılarak sarı proteinlere UAAS olarak foto-çapraz grupların dahil değerli bir gelişmedir. 16, 17 Biz, bir reseptör-ligand kompleksinin oluşmasına katılan bir reseptör üzerinde bağlayıcı arayüzü tanımlamak için bir foto-çapraz bağlı bir teknik geliştirdi GPCRs içine fotolabil gruplar getirerek hücreleri canlı. 18, 19 Burada, bir küçük moleküllü ligand bağlama sahası, CCR5 üzerinde tritiye Maraviroc tanımlamak için bu hedef foto-çapraz teknolojiyi uygulamak için, deney protokolü ve veri analizi yöntemi tarif etmektedir. Bu yöntem, doğal ligandın kimyasal yapısını koruyarak ek olarak, ligand üzerindeki radyoaktif kolu, kesin miktar istifade eder.
Floresans-tabanlı teknikler, doğrudan reseptörünün oluşum durumunu tarama ile reseptör aktivasyonunun yapısal temeli tam görüşü destekler. 20, 21 Bununla birlikte, GPCRs flüoresan etiketler tanıtmak için esneklik sahip teknikler site-spesifik olarak sınırlı bulunmaktadır. Biz GPCR sinyalizasyon komplekslerin tek-molekül algılama (SMD) kolaylaştırmak için bioorthogonal kimyasal modifikasyon stratejileri istihdam ilgilendi. 22. Azido grubu, Stadinger-Bertozzi ligasyon, 23, 24 bakır-germeli terfi azid-olarak bioorthogonal kimyaları katılabilir alkin siklo-(SpAAC) 25 ve bakır ile katalize edilen azit-alkin siklo (CuAAC). 26 İletişim bir azid ve bir fosfin arasındaki özel reaksiyon içerir Staudinger Bertozzi-bağlama reaksiyonu, burada odaklanır. Bir peptid epitop (FLAG peptidi) veya bir fluoresan bir etiket maddeye konjüge iki farklı fosfin türevlerinin kullanımını göstermektedirGPCRs siteye özgü modifikasyonu elde etmek için (fluorescein).
Biz daha önce maruz çözücüdür hedef siteleri seçmek için X-ışını kristal yapıya ve dinamik simülasyonları kullanarak azf varyantları rodopsin site-spesifik etiketleme koşullarını optimize edilmiş. 27., 28. Biz de by background-serbest etiketleme ulaşmak için fizibilite resimli Staudinger- Bertozzi ligasyon. 29 İletişim burada immün afinite matrisi üzerinde hareketsiz hale getirildi ve daha sonra in-jel floresan ile görselleştirilmiştir bir deterjan-çözünebilir reseptörünün floresan etiketleme elde etmek için kullanılan genel prosedürü göstermektedir. Ayrıca, bilinmeyen yapı, CCR5'in bir reseptör üzerinde etiketleme için uygun pozisyonları belirlemek için bu etiketleme strateji üzerinde yararlı bir uzantısı göstermektedir. Bu AZF-GPCR, hücre bazlı bir yarı yüksek bir ürün formatında varyantları bioorthogonal modifikasyonu dayanır bir hedef peptid epitop etiketleme stratejisi kullanılarak gerçekleştirilir. 30 Buyöntem etiketleme olayları izlemek için bir hücre-yüzey ELISA çok adımlı algılama özelliklerini kullanır.
Biz burada tartışmak metodolojiler genel ve ilkesel olarak bastırma teknolojisi kodon sarı kullanarak azf ile dahil herhangi GPCR'nin uygulanabilir. Ayrıntılarıyla GPCRs yapısal ve dinamik çalışma kolaylaştırmak için doğal olmayan bir amino asit mutagenez yöntemi ve bunların daha sonraki uygulamaları kullanılarak bu azf gibi UAAS ile dahil reseptörlerin Memeli hücre ekspresyonunda söz konusu olan adımlar Burada yer alan protokollerde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. GPCRs içine Doğal olmayan amino asitlerin bölge spesifik genetik Incorporation
- % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş DMEM içinde HEK293T hücreler (glukoz 4.5 g / L, 2 mM glutamin) koruyun.
- Lipofektamin Plus tepkin maddesi kullanılarak 10 cm'lik bir plaka içerisinde% 60-80 konflüansa büyütülmüştür hücreleri transfekte.
- 750 ul DMEM için, arzu edilen bir pozisyonda amber durdurma kodonu ihtiva eden 10 ul Plus tepkin maddesi, GPCR cDNA 3.5 ug (pMT4. Rho veya pcDNA 3.1. CCR5), 3.5 baskılayıcı tRNA cDNA'nın (pSVB.Yam) arasında ve 0,35 ug ug eklemek p-azido-L-fenilalanin (pcDNA.RS) için, mutant bir amino asil-tRNA sentetaz cDNA. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Ayrıca, bir kontrol olarak hizmet etmek üzere ağırlıkça GPCR cDNA (bir amber durdurma kodonu içeren) kullanılarak da benzer bir transfeksiyon gerçekleştirin. 17 ul Lipofektamin ile DMEM 750 ul bu karışımı ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika sonra dengeye getirmek4 ml toplam hacim.
- 10 cm'lik bir tabakta aspire ortam hücrelere transfeksiyon karışımı uygulanır ve CO2 atmosfer,% 5 37 ° C'de geri dönün. 4-6 saat sonra,% 20 FBS ve 1 mM azf içeren 4 ml DMEM hücreleri ek.
- Ertesi gün, DMEM,% 10 FBS ve 0.5 mM azf içeren büyüme ortamı değiştirin.
- Hasat hücreleri 48 saat sonrası transfeksiyon, ifadesini analiz ya da aşağıdaki bölümlerde açıklanan foto-veya etiketleme prosedürleri devam etmek.
- Büyüme ortamı içinde UAA mevcudiyetinde GPCR sarı mutant ifadesini teyit edin. Biz Batı bağışıklık algılama bunu. Lyse% 1 hücre topağı (ağ / hac) 20 mM Tris-HCI, pH dodesil-β-D-maltozit (DDM) 7.5, 4 ° C 'de 1 saat süre ile 100 mM NaCl 16,000 xg'de lizat santrifüj ve SDS-PAGE ile indirgeyici koşullar altında süpernatantı çözmek. Bir PVDF membrana aktarılır ve inci kullanılarak tam uzunluktaki reseptör ifadesini tespit etmek için bağışıklık-beneklenme analizi gerçekleştirmekreseptörün C-ucunda bir epitopu tanır tasarlanmış e 1D4 mAb (National Hücre Kültürü Merkezi),. 31
2. Hedefli foto-kullanarak Ligand Bağlama Sitesi Haritalama
- 48 saat post-transfeksiyon, hücrelerden aspire ortam ve 4 ml 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile değiştirin. 15 dakika boyunca 37 ° C'de geri dönün.
- 1x PBS ile tekrar süspansiyon hücreleri ve bir Falcon tüp transfer. Pelet hücreleri ve süpernatan aspire 2 dakika boyunca 1500 rpm'de santrifüj.
- 20 mM HEPES, pH 7.5,% 0.2 BSA ve reseptör-ligand kompleksi oluşmasını sağlamak için, zaman ve sıcaklığın gerekli uzunluğu için bağlanma satürasyon konsantrasyonu da üçlü ligand içeren 1x Hank Tamponlu Tuz Çözeltisi içinde hücre pelletini.
- 4 ° C'de 15 dakika boyunca (örneğin, UV-A lambası kullanın) 365 nm'de azf fotoaktivasyon için bir 24 oyuklu veya 96 oyuklu plakaya transfer hücre süspansiyonu Maintain buz üzerinde plaka numune ısıtma ve hücre parçalanmasını önlemek için.
- Pelet hücreleri, bir Eppendorf tüpü, santrifüje hücreleri aktarın, süpernatant kaldırmak ve analiz geçin. Topaklar gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
- (W / v) DDM, 20 mM Tris-HCI, pH 7.5 ve proteaz inhibitörleri% 1 ihtiva eden liziz tamponu içinde hücre topakları yeniden süspanse edin. 4 ° C'de 1 saatlik inkübasyondan sonra, 16,000 x g'de 10 dakika boyunca hücre lizat santrifüj ve yeni bir tüpe süpernatantı aktarın.
- Süpernatana 1D4 mAb-sefaroz 2B reçine ilave edin ve işlenmiş C-terminal 1D4 mAb epitop kullanılarak GPCR immunopurify için 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilir. Ertesi gün, liziz tamponu ile pek çok kez yıkayın boncuklar. Çalkalanarak 1 saat boyunca 37 ° C'de% 1 SDS ile Elute örnekleri.
- Bir 15 ml şişe ihtiva eden sintilasyon sıvısına, elüsyon bir kısmını aktarın ve inci olan toz haline getirilmiş olan bağlayıcının spesifik bağlanmasındaki yer değiştirme miktarını belirlemek için bir beta parıldama sayacında sayılıre reseptörü.
- Standart jel elektroforezi ile kalan 1D4 mAb saflaştırılmış eluen gidermek. Bir 4-12% SDS-PAGE jel ve bağışıklık boyama için bir PVDF membrana daha sonra yarı-kuru aktarımı kullanın. Biz de moleküler ağırlığı görsel yaklaşımı rehberlik standart protein merdiven ile bir şerit bulunur.
- % 0.05 Tween-20 içeren TBS tampon maddesi içinde% 5 süt, PVDF membranı ile bloke edin. HRP-konjuge edilmiş anti-fare IgG ikincil antikor, ardından 1D4 mAb ile tam uzunluklu reseptör ifadesini teyit etmek için membran kontrol edin.
- Gelişmiş chemiluminescence (ECL) reaktif ile tedavi ve bantları görselleştirmek için filmi otoradyografıye membran maruz.
- Özel moleküler ağırlık belirteçler kesilerek ardından her numune şerit ayırmak için bir tıraş bıçağı ile membran kesin. Sintilasyon akışkan maddesi ihtiva eden tüplere zar segmentleri aktarın. Bir beta-parıldama sayacında sayılarak, her zar segmentte trityum miktarını ölçmek.
- Pozitif tespitGPCR ve ligandın bunun toplamına eşit görünür moleküler kütlesi de trityum algılama ile photocrosslink.
3. Epitop Etiketleme ve Hücre yüzey Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Hedeflenen
- 24 saat post-transfeksiyon PBS'de 1 x 1 ml yıkama hücreleri ve 3 dakika boyunca 1 ml% 0.25 tripsin ile tripsinize edin. ,% 10 FBS ve 0.5 mM azf içeren 9 ml DMEM ile Supplement. Hücrelerin tekrar ve hücre yoğunluğu saymak. Biz standart bir Hemasitometre kullanın.
- 0.01 mg / ml, oyuk başına poli-D-lisin, 100 ml ile yüksek bağlanma, berrak tabanlı, 96 oyuklu plaka ön tedavi. 1x PBS ve kuru hava ile tekrar tekrar yıkama, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Levha 200 6 x 10 4 yoğunluğunda transfekte edilmiş hücrelerin ul - 8 x 10 4 hücre / oyuk, 96 oyuklu plakaya ve CO2 atmosfer,% 5 37 ° C'de geri dönün.
- Ertesi gün etiketleme için hücreleri hazırlamak. Yavaşça 100 ul / göz PBS 1x t ile üç kez yıkayıno herhangi AZF içeren büyüme ortamı çıkarın. Hücreler PBS Ca 2 + ve Mg2 + ihtiva eden kullanılarak, örneğin, yapışık kalmasını sağlayın.
- PBS içinde 5-20 mM'de tutulan bir stok 1x HBSS / PBS içinde 50-200 uM FLAG-triarilfosfin etiketleme reaktifi hazırlayın. Her bir (her sarı mutant için üç kopya halinde) 60 ml uygulanır ve 30 dakika ila 4 saat boyunca 37 ° C'de geri dönün. 1x HBSS / PBS içinde etiket tedavisiz gözenekli bir grup kullanın koruyun. Ayrıca AZF-GPCR'dir varyantları ile karşılaştırmak için bir ağırlık GPCR'dir kontrolü içerir.
- Zamanda, bloke edici tampon içinde 100 ul / ile hücreler 3 kez yıkanmakta, BB (1 x PBS,% 0.5 BSA), tamamen reaksiyona girmemiş etiket çıkarmak için kullanılır.
- Hücrelere 100 ul / oyuk (1 x PBS içinde% 16 stoktan hazırlandı)% 4 paraformaldehid uygulanır. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. BB ile üç kez yıkayın.
- Etiketli reseptör ve reseptör ekspresyonunu tespit etmek için standart hücre yüzeyi ELISA protokolü yapın. İkinci An ve ardından, buz üzerinde 1.5 saat için primer antikor ile inkübe1 saat oda sıcaklığında inkübasyon tibody.
- FLAG-triarilfosfin etiketleme reaktifi FLAG peptit epitopunun tespit etmek için bir anti-FLAG M2 antikoru 100 ul (BB yapılan antikorun örneğin 1:2,000 seyrelti) ilave edin. Aynı zamanda, negatif kontrol olarak etiketli olmayan tedavi kuyu sonda. Wt veya AZF-GPCR, hücre yüzeyi ekspresyonunu belirlemek için kuyu ayrı bir dizi antikoru (1:500 seyreltme bir kullanımı), anti-CCR5 2D7 ekleyin.
- BB ile hücreler üç kez yıkayın ve HRP ile konjüge edilmiş anti-fare IgG ikincil antikor (1:2,000 seyreltme), 100 ul ile inkübe edin.
- Dikkatle BB ile hücreleri beş kez yıkayın. 50 ul tampon algılama ekleyin Amplex Red, 20 mM 2 H 2 O, 1 x PBS (1:10:90 oranı) ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. Λ ex = 530 bir floresan çoklu-plaka okuyucu üzerinde spektral veri toplamak ve λ em 590 =.
4. Bir GPCR ve Bioorthogonal floresan etiketleme
- LyseWt veya AZF-rodopsin% 1 ihtiva eden 1 ml tampon maddesi içinde çözündürme varyantları (w / v) DM, 50 mM HEPES ve Tris-HCI, pH 6.8, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2 ve 1 proteaz inhibitörleri eksprese eden 10 7 hücre hasat 4 ° C'de hr 10 dakika boyunca 15,000 xg'de santrifüj hücre lizatı ve süpernatan fraksiyonu toplamak.
- Işlenmiş C terminus 1D4 epitopu ile reseptörün yakalamak için 100 ul mAb 1D4-sefaroz reçinesi 2B ekleyin. 4 ° C'de 12 saat boyunca inkübe 0.1 M sodyum fosfat tampon maddesi, pH 7.3 (w / v)% 0,1 ile DDM, reçineyi üç defa yıkanır.
- Immün afinite matrisi (mAb 1D4-sefaroz 2B) üzerinde hareketsizleştirilmiş reseptörü etiketlemek için 0.5 ml - 0.3 arasında bir toplam hacim içinde 0.1 mM Fluorescein-fosfin ekleyin. Oda sıcaklığında 12 saat boyunca inkübe edin. Santrifüj ve süpernatant kaldırmak. Girmemiş etiketi kaldırmak için reçine yıkayın.
- (W / v) DDM ve 0.33 mg / ml nonapeptit (1D4 epitopuna karşı C9 peptid)% 0.1 ihtiva eden 100 ml yıkama tampon maddesi ile işaretlenmiş reseptörü Zehir2 mM fosfat tampon maddesi içinde 1 saat için buz üzerinde kuluçkalama ile pH 6.0.
- Indirgeyici koşullar altında SDS-PAGE ile etiketli örnekleri giderin. PBS kısaca jeller yıkayın ve sonra-jel floresan ile AZF-GPCR'nin etiketleme görselleştirmek. Örneğin, floresan ile modifiye reseptörünü tespit etmek için, 488 nm dalga boyu lazer konfokal floresan tarayıcıyı kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu spesifik yerinde bastırma teknolojisi kodonu kullanılarak sarı renkte bir GPCR olarak molekül probları tanıtmak için doğal olmayan bir amino asit mutagenez yöntemi kullanılabilir. Şekil 1'de şema metodoloji belirgin adımlar ve GPCRs içine, çok yönlü, UAA, p-azido-L-fenilalanin (azf) içeren çeşitli uygulamalarını açıklar. Memeli hücrelerinde AZF-GPCRs sentezlenmesi ligandlarına foto-çapraz hedefli ve bioorthogonal etiketleme kimyasalları ile peptid epitop ya da etiketleme bir GPCR floresan değişiklik hedef sağlar.
Foto-çapraz teknik canlı hücrelerde GPCR-ligand kompleksleri (Şekil 1a) yapısal özelliklerini araştırmak için kullanılabilir. Böyle bir deneyden elde edilen veriler, Şekil Örnek 2 'de gösterilmiştir. 19. Burada bağlanma oturmak belirlemek için radyoaktif işaretli, küçük moleküllü ligand tritiated Maraviroc, elCCR5'in e. Bu örnekte, AZF-CCR5 ifade eden hücrelerin UV ışınlaması ligand üzerindeki duyarlı radyoaktif etiket kullanılarak tespit edilebilir kovalent bağlarla çapraz bağlanan kompleksler tritiye maravirok sonuçlar ile önceden inkübe varyantları. Test CCR5'e üzerinde çeşitli pozisyonlarda arasında, I28azF ve W86azF anlamlı yüksek ışıma sayısı (kırmızı barlar, alt panelinde, Şekil 2) ile tasvir trityumlu Maraviroc için photocrosslink başardık. Wt reseptör radyoaktif ligand için bir çapraz bağlanma gösterdi.
Bioorthogonal etiketleme kimyaları için kullanılabilir yerinde özellikle AZF-GPCR varyantlar ve değişiklikler. CCR5 ve rodopsin fosfin türevleri (Şema 1) kullanılarak: İki GPCR'ler etiketlemek için Staudinger-Bertozzi bağlama kimyası kullanılır. Bir strateji, bir peptid-birleştirilmiş bir etiket (Şekil 1b) kullanılarak canlı hücrelerde bir GPCR hedeflenen epitopu etiketleme içerir. Biz, böyle bir deney göstermek hangi bir BAYRAK peptide-triarilfosfin etiketleme reaktif sitesine spesifik için kullanılan ve seçici AZF-CCR5 varyantlar ve değişiklikler edilir. Şekil 3 de FLAG peptit ile etiketlenmiş pozisyonları. CCR5'e incelenmiştir üzerindeki pozisyonların arasında 30 tanımlamak için kullanılan bir hassas ve çok adımlı ELISA saptama stratejisi temsili verileri görüntüleyebilir, tüm AZF-CCR5 varyantlar hücre yüzeyinde (kırmızı ifade edildi Bunlardan barlar, Şekil 3) ve yaklaşık yarısı başarıyla (mavi barlar, Şekil 3) etiketleme hedef epitopunu uygulandı. wt CCR5 anti-FLAG sinyalinin olmaması tarafından sergilenen epitop etiketleme için bir negatif kontrol olarak görev yapmıştır. Alternatif bir yaklaşımda, bir florofor ile konjüge edilmiş bir etiket (Şekil 1c) ile, 2B reçine sepharoza konjüge edilmiş anti-1D4 mAb olarak bir immün afinite matrisi üzerinde hareketsizleştirilmiş deterjan çözündürülmüş AZF-GPCR'ler, etiketli. Şekil 4'te gösterilen in-jel floresan görüntü başarılı floresan gösteriyorbeklenen bir floresan bant yokluğu ile görüldüğü gibi floresan bir fosfin türevi kullanılarak Staudinger-Bertozzi ligasyon ile azf ile dahil üç farklı konumlarda GPCR, rodopsin etiketlenmesi. 29. Beklendiği gibi, ağırlık olarak rodopsin arka plan etiketleme gösterdi reseptörünün moleküler ağırlığa sahiptir.
Şema 1. Bir triarilfosfin ve kararlı bir amid-bağlı ilave maddesinin meydana getirilmesi için bir azid arasındaki Staudinger-Bertozzi Ligasyon reaksiyonu.
Şekil 1. Şema bir UAA (azf) ve uygulamaları s site-spesifik birleşmesini gösteren . bir amber durdurma kodonu (UAG) tanır UAA, bir ortogonal baskılayıcı tRNA için spesifik bir gelişmiş bir ortogonal amino asil-tRNA sintetaz: tudy GPCR'ler Site özel mutajenez UAA taşıyan memeli hücrelerine üç ayrı plasmidin birlikte-transfeksiyonu ile elde edilir ve arzu edilen bir pozisyonda bir mutasyon içeren bir TAG GPCR kodlayan gen. UAA mevcudiyetinde büyütülen hücreler, bir site-spesifik olarak ortaya azf ile tam boy bir GPCR ifade eder. Bu hücreler daha sonra, (a) bir ligand ile inkübe edilir ve bir GPCR ve ligandı arasında çapraz bağlar belirlemek için UV-ışığı ile aktive edilmiş, (b), bir peptid-birleştirilmiş kimyasal etiket ile kültür içinde site spesifik epitop etiketi, bir GPCR için kullanılabilir ya da (c) daha sonra bioorthogonally reseptör, bir antikor ile konjuge edilmiş sepharoz reçinesi üzerinde hareketsiz kılınmış olduğu koşullar altında bir floresan etiket ile modifiye edilir GPCR'ler, saflaştırmak için çözünebilir.0588/50588fig1highres.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için tıklayın
Şekil 2. Bir üçlü ligandın bir GPCR hedeflenen foto-çapraz. Burada Gösterilen AZF-CCR5 varyantları ve trityum-etiketli ligandın, küçük bir molekül, Maraviroc arasında bir çapraz bağlama deneyden temsil sonuçlardır. Üst panel: test AZF-CCR5 varyantlarının ekspresyonunu gösteren tipik bir deney sonra üretilen Western immunoblot. Renkli segmentler PVDF membran sintilasyon sayımı için kesilmiştir burada vurgulamak ve alt panelinde çubuk grafikte çizilen tespit sintilasyon sayımı karşılık gelir. Kırmızı kademeli bir reseptör ve ligand arasındaki kovalent çapraz bağlı kompleks (yaklaşık 40 kDa) beklenen molekül ağırlığı gösterir.refore biz AZF ligand bağlayıcı cebe yakın olduğu ve ligand ile bir kovalent çapraz bağ oluşturabilen reseptörde bir pozisyonda sokulur sadece bu segmentlerde Trityum tespit etmek için beklenir. Ve diğerleri Grünbeck, A. izniyle (uyarlanmış) yayımlanmaktadır. Olarak şifrelenmiş verilmedi çapraz-bağlayıcılar, G protein-eşli reseptörü üzerinde bir alosterik ilacın bağlanma yerinden mesafededir. ACS Chemical Biology 7, 967-972 (2012). Copyright (2012) American Chemical Society. resmi büyütmek için buraya tıklayın
Şekil 3,. . GPCR bir üst panel hedef epitop etiketleme ELISA saptaması: HEK 293T cel hücre yüzey ifadesiTam bir hücre esaslı ELISA (kırmızı bar) kullanılarak anti-CCR5 mAb 2D7 ile problanmıştır AZF-CCR5 varyantları ve ağırlık ve sahte transfekte edilmiş kontrol ifade ls. Alt panel: aynı transfeksiyon hücreler canlı hücreler içinde 1 saat boyunca 0,05 mM FLAG-triarilfosfin ile muamele edildi ve daha sonra her bir konumda (beyaz çubuklar) peptid-epitop etiketleme kapsamını belirlemek için, anti-FLAG M2 mAb kullanılarak takip eden ELISA ile nicelleştirilmiştir . Hata çubukları, iki ya da daha çok tekrarlanan veri kümeleri için ortalamanın standart hatasını temsil eder. Ark Naganathan, S., izni ile (uyarlanmış) yayımlanmaktadır. Genetik olarak kodlanmış doğal olmayan bir amino asit modifikasyonu ile bioorthogonal GPCRs Site spesifik epitop etiketleme Biochemistry DOI:. 10.1021/bi301292h (2013). Copyright (2013) American Chemical Society. resmi büyütmek için buraya tıklayın
Şekil 4. Çeşitli pozisyonlarda. Wt ve floresan fosfin ile etiketlenmiş bir immünoafinite matris üzerinde hareketsiz AZF-rodopsin mutantlar da dahil rodopsin azf Floresan etiketleme. Saflaştırılmış örnekler 4-12% SDS-PAGE ile ayrılmış ve gösterilen in-jel floresan görüntü fluorescein tespiti için optimize edilmiş bir emisyon filtre seti kullanılarak bir eş odaklı 488-nm lazer floresan tarayıcı ile alınmıştır. Huber, T., genetik olarak kodlanmış azido fonksiyonel gruplara G-protein bağlı reseptörlerin et al. Bioorthogonal etiketleme uyarlanmıştır Şekil. (2013) sunulmalıdır. resmi büyütmek için buraya tıklayın
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz GPCRs içine, reaktif bir prob, AZF site-spesifik birleşme için buraya sağlam bir metodoloji tarif ve GPCRs yapısını ve dinamiklerini incelemek için bu aracı üç yararlı uygulamaları göstermek. Bizim yöntem sitede-özellikle UAA'lar kimyasal 32, 33 etiketleme veya tek erişilebilir sistein mutant foto 34 bağlama dayalı alternatif bir strateji ile temel bir problemi aşılmaktadır dahil. Sistein tiyol grupları hedef kimyaları flüoresan millerini takmak için kullanılmış olsa da, böyle bir strateji, bir sistein içermeyen protein arka üretilmesini gerektirir. Tüm GPCR'ler uygun reseptör fonksiyonunu korumak için gerekli olabilir çoğu birden fazla sistein, sahiptir, bu durum sınırlayıcı olabilir. Bu nedenle, kimyasal modifikasyon için uygun olan ya da UV ışığı ile aktive edilebilir bir UAA tanıtmak için fizibilite son derece çekicidir.
Bir phot kovalent Reaksiyon, bir hedef molekül ile çapraz bağlayıcı oactivatable mesafe ve komşu yan zincirleri bağlıdır. Bu nedenle, bu problar, çapraz bağlantı belirli bir mesafede olan etkileşimleri belirlenmesi, örneğin, benzofenon-3, çapraz bağlayıcı bazlı bir mesafe bağımlı olması önerilmektedir kullanılabilir. 35. Daha önce, azf ve BZF, bir UAA hem de tanıtılan ligand. 18, 19 bu teknolojinin genel bir uygulanabilirliği sadece bu etiketli ligandların kullanılabilirliği ve sarı mutantların üretilmesine bağlıdır etiketli bir floresein veya trityum ile tanımlanmış bir mesafede olan bir GPCR olarak tortuları tanımlamak için bir benzofenon reaktif grubu ihtiva eden Bir hedef GPCR. Buna ek olarak, teorik olarak, bu hedef foto-çapraz teknik GPCRs ve bir G protein veya β-arrestin olarak diğer bağlayıcı ortaklar, arasındaki etkileşimi belirlemek için uygulanabilir. Bu çapraz bağlama çalışmalarından elde edilen veriler, daha doğru mo oluşturmak için kullanılabilirGPCR sinyal komplekslerinin Molecular modelleri.
Çeşitli bioorthogonal kimyasal reaksiyonlar UAA artıkların site-spesifik bir modifikasyon itibarıyla izin literatürde tarif edilmiştir. UAA, ACF, örneğin, hidrazon veya oksim ligasyon reaksiyonlarında katılmak bir keto grubuna sahiptir. 36, 37 Daha önce biyotinile edilmiş ve floresan konjuge reaktifler ile keto grupları ve azido grupları modifikasyonunu karşılaştırdık. 29 gözlemlerimiz belirtilen bu azido AZF grup kendi keto meslektaşı daha gerçekten daha bioorthogonal olduğunu. Böylece, daha sonra, bir peptid epitop ya da bir floresan etiket ile iki GPCR'ler değiştirmek için Staudinger-Bertozzi ligasyon kullanımına odaklanmıştır. Bu Staudinger-Bertozzi ligasyon etiketleme için 38 alt-stokiyometrik ve zayıf kinetik özellikler sergileyen, ancak, dikkat çekicidir. Ayrıca, fosfınler hava oksidasyona karşı oldukça duyarlıdır. 25. Biz Stadinger-Be olduğunu gözlemledimrtozzi ligasyon sadece oda sıcaklığında 12 saat boyunca inkübasyondan sonra,% 30 etiketleme elde edilir. bu nedenlerle 29, şu anda bu tür CuAAC ve SpAAC gibi alternatif etiketleme kimyasallar değerlendiren yerinde özellikle AZF-GPCR'ler etiket.
Staudinger-Bertozzi ligasyon reaksiyonları sakıncaları da olsa, burada ileride floresan etiketleme için erişilebilir bir hedef GPCR yerlerini belirlemek için bir canlı hücre epitopu, peptid-etiketleme stratejisi kullanımını göstermektedir. Ayrıca, bu epitop etiketleme bir yöntem, doğal dizilerin değiştirilmesi ile tüm epitopu sokulması aksine tek bir modifiye edilmiş kalıntısında bir epitop etiketi tanıtımı gibi çok sayıda başka faydalı uygulamalar vardır. Bu özellik, büyük ölçüde fonksiyon değiştirebilir yüksek oranda muhafaza döngü kesimlerinin uzunluğu ve dizisi değiştirilerek Başlangıcı GPCRs ile özel bir önem taşımaktadır. Nihayet, biz de flüoroforlar, ma ile GPCR'ler etiketlemek için buraya proof-of-concept deneyleri resimlitek-molekül algılama deneyleri için uygun kralı onları.
Sonuç olarak, azf GPCRs yapısı ve fonksiyonu çalışma için çok yönlü bir araçtır. Biz AZF Site özel söndürme sistemi kodonu sarı kullanılarak memeli hücrelerinde ifade GPCRs dahil olduğunu göstermiştir. Bu sadece tek bir konumda bir GPCR değişimine olanak sağlar. Etiketlenmiş reseptörünün yapısı ve işlevi daha sonra yerli plazma zarı ortamında veya bir deterjan çözeltisi içinde ya da değerlendirilebilir. Biz şimdi azf sonda esnekliği ile GPCR'dir sinyal kompleksleri araştırmak için gurur duyuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz birkaç vakıf ve hayırsever bağışçıların cömert desteği (SakmarLab.org bakınız) teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid pSVB. Yam | (Ye et al., 2008) | ||
| Plasmid pcDNA.RS for azF | (Ye et al., 2009) | ||
| Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5 | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position | ||
| HEK 293T cells | Adherent cells | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 10566 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14200 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Lipofectamine Plus | Invitrogen | Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015 |
|
| p-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | 6162 | |
| Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials | |||
| Maxima ML-3500S UV-A lamp | Spectronics Corporation | azF is activated by 365-nm light | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14065 | |
| HEPES | Irvine Scientific | 9319 | |
| Bovine serum albumin | Roche | 3117405001 | |
| Tritium-labeled ligand | From collaborator (Grunbeck et al., 2012) | ||
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| 1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166 | |
| NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Trans-Blot SD apparatus | Biorad | Apparatus for semi-dry transfer | |
| Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Non-fat powered milk | Fisher Scientific | NC9934262 | |
| Tween-20 | Aldrich | 274348 | |
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | Scintillation fluid |
| Scintillation vials | Fisher Scientific | 333726 | |
| LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter | Perkin Elmer | Beta-Scintillation counter | |
| Anti-rhodopsin 1D4 mAb | National Cell Culture Center | custom | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG | KPL, Inc. | 474-1806 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
| Hyblot CL AR film | Denville | E3018 | |
| Table 2. Targeted photocrosslinking materials | |||
| 0.25% Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
| FLAG-triarylphosphine | Sigma | GPHOS1 | |
| M2 FLAG mAb | Sigma | F1804 | |
| anti-CCR5 2D7 mAb | BD Biosciences | 555990 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| 96-well plate | Costar | 3601 | Clear bottom, high binding EIA/RIA |
| Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium) | Gibco | 14040 | |
| 16% Paraformaldehyde | EMS | 28908 | |
| HRP-conjugated | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| anti-rabbit IgG | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 | |
| Hydrogen peroxide | DE Healthcare Products | 97-93399 | |
| CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader | Perseptive Biosystems | ||
| Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials | |||
| Fluorescein-phosphine | (Huber et al., submitted 2012) | ||
| Nonapeptide (C9 peptide) | AnaSpec | 62190 | Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH |
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner | GE Healthcare | discontinued | Scanner with 488-nm wavelength laser |
| Table 4. Fluorescent labeling materials |
References
- Huber, T., Menon, S., Sakmar, T. P. Structural basis for ligand binding and specificity in adrenergic receptors: Implications for GPCR-targeted drug discovery. Biochemistry. 47, 11013-11023 (2008).
- Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current opinion in structural biology. 21, 567-572 (2011).
- Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Wu, B., et al. Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists. Science. 330, 1066-1071 (2010).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301, 964-967 (2003).
- Ye, S., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. The Journal of biological chemistry. 283, 1525-1533 (2008).
- Ye, S., Huber, T., Vogel, R., Sakmar, T. P. FTIR analysis of GPCR activation using azido probes. Nature chemical biology. 5, 397-399 (2009).
- Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464, 1386-1389 (2010).
- Singh, A., Thornton, E. R., Westheimer, F. H. The photolysis of diazoacetylchymotrypsin. The Journal of biological chemistry. 237, 3006-3008 (1962).
- Nakayama, T. A., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bovine rhodopsin determined by cross-linking using a photoactivatable analog of 11-cis-retinal. The Journal of biological chemistry. 265, 15762-15769 (1990).
- Chen, Q., Pinon, D. I., Miller, L. J., Dong, M. Molecular basis of glucagon-like peptide 1 docking to its intact receptor studied with carboxyl-terminal photolabile probes. The Journal of biological chemistry. 284, 34135-34144 (2009).
- Huang, K. S., Radhakrishnan, R., Bayley, H., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bacteriorhodopsin as studied by cross-linking using a photosensitive analog of retinal. The Journal of biological chemistry. 257, 13616-13623 (1982).
- Zoffmann, S., Turcatti, G., Galzi, J., Dahl, M., Chollet, A. Synthesis and characterization of fluorescent and photoactivatable MIP-1alpha ligands and interactions with chemokine receptors CCR1 and CCR5. Journal of medicinal chemistry. 44, 215-222 (2001).
- Janz, J. M., et al. Direct interaction between an allosteric agonist pepducin and the chemokine receptor CXCR4. Journal of the American Chemical Society. 133, 15878-15881 (2011).
- Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11020-11024 (2002).
- Hino, N., et al. Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid. Nature. 2, 201-206 (2005).
- Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50, 3411-3413 (2011).
- Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS chemical biology. 7, 967-972 (2012).
- Dunham, T. D., Farrens, D. L. Conformational changes in rhodopsin. Movement of helix f detected by site-specific chemical labeling and fluorescence spectroscopy. The Journal of biological chemistry. 274, 1683-1690 (1999).
- Maurel, D., et al. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nature. 5, 561-567 (2008).
- Huber, T., Sakmar, T. P. Escaping the flatlands: new approaches for studying the dynamic assembly and activation of GPCR signaling complexes. Trends in pharmacological sciences. 32, 410-419 (2011).
- Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
- Kiick, K. L., Saxon, E., Tirrell, D. A., Bertozzi, C. R. Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 19-24 (2002).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted [3 + 2] azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems. Journal of the American Chemical Society. 126, 15046-15047 (2004).
- Kolb, H. C., Sharpless, K. B. The growing impact of click chemistry on drug discovery. Drug discovery today. 8, 1128-1137 (2003).
- Huber, T., Botelho, A. V., Beyer, K., Brown, M. F. Membrane Model for the G-Protein-Coupled Receptor Rhodopsin: Hydrophobic Interface and Dynamical Structure. Biophys. J. 84, 2078-2100 (2004).
- Okada, T., et al. The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 Å crystal structure. J. Mol. Biol. 342, 571-583 (2004).
- Huber, T., Tian, H., Ye, S., Naganathan, S., Kazmi, M. A., Duarte, T., Sakmar, T. P. Bioorthogonal labeling of functional G protein-coupled receptors at genetically encoded azido groups. , submitted (2013).
- Naganathan, S., Ye, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Site-specific epitope tagging of GPCRs by bioorthogonal modification of a genetically-encoded unnatural amino acid. Biochemistry. , (2013).
- Molday, R. S., MacKenzie, D. Monoclonal antibodies to rhodopsin: characterization, cross-reactivity, and application as structural probes. Biochemistry. 22, 653-660 (1983).
- Gether, U., et al. Agonists induce conformational changes in transmembrane domains III and VI of the beta2 adrenoceptor. The EMBO journal. 16, 6737-6747 (1997).
- Hubbell, W. L., Altenbach, C., Hubbell, C. M., Khorana, H. G. Rhodopsin structure, dynamics, and activation: A perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking. Advances in Protein Chemistry; Membrane Proteins. 63, 243-290 (2003).
- Cai, K., Itoh, Y., Khorana, H. G. Mapping of contact sites in complex formation between transducin and light-activated rhodopsin by covalent crosslinking: use of a photoactivatable reagent. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4877-4882 (2001).
- Dorman, G., Prestwich, G. D. Benzophenone photophores in biochemistry. Biochemistry. 33, 5661-5673 (1994).
- Zhang, Z., et al. A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo. Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).
- Dirksen, A., Hackeng, T. M., Dawson, P. E. Nucleophilic catalysis of oxime ligation. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7581-7584 (2006).
- Yanagisawa, T., et al. Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification. Chemistry & biology. 15, 1187-1197 (2008).
