Summary
Koku ensheathing hücreleri (OECS), birincil koku nöronların büyümesine izin vermek nöral tepe hücreleri bulunmaktadır. Bu özel özellik, hücresel nakli için de kullanılabilir. Burada bir gırtlak sinir yaralanması modelinde OECS kullanımına göre hücre transplantasyonu bir model mevcut.
Abstract
Olfaktor ensheathing hücreleri (OECS) primer koku nöronların büyüme ve büyütme sağlayan nöral krest hücreleri vardır. Gerçekten de, birinci koku alma sistemi bile yetişkin hayvanlarda yeni nöron doğuran yeteneği ile karakterize edilmektedir. Bu özel yeteneği nöron için uygun bir mikro-ortam oluşturmak OECS varlığına kısmen kaynaklanmaktadır. OECS bu özelliği spinal kord yaralanması modellerde olduğu gibi hücresel nakli için kullanılmaktadır. Periferik sinir sistemi, merkezi sinir sistemi dışındaki sinir yaralanmasından sonra yeniden daha büyük bir kapasiteye sahip olmasına rağmen, tam bölümleri laringeal sinir kesisi yüz sonra özellikle aksonal yeniden gelişiminde sırasında yanlış iletilmesi neden. Özellikle, rekürren laringeal sinir (RLN) tam kesit ses tellerinin synkinesis sonuçlanan anormal aksonal çıkma neden olur. Bu özel modelde, OECS nakli akson büyümesini etkin bir şekilde arttırdığını göstermiştir.
ve_content "> OECS koku mukoza (OM-OECS) ve koku ampuller (OB-OECS) hem de, birden fazla alt popülasyonlarının oluşmaktadır. Burada içinde OECS bu farklı alt popülasyonlarının kullanımına dayanan hücresel nakli için bir model mevcut RLN yaralanma modeli. bu paradigmayı kullanarak, OB-OECS ve OM-OECS birincil kültürleri RLS bölümü ve anastomoz sonrası Matrigel'de nakledilmiştir. İki ay ameliyat sonrası, biz videolaryngoscopy dayalı tamamlayıcı analizler tarafından nakledilen hayvanların değerlendirildi, elektromiyografi (EMG) ve histolojik çalışmalar. Birincisi, videolaryngoscopy özellikle kas cocontractions fenomen. Ardından, EMG gösterdi zenginliği ve kas faaliyetleri senkronizasyonu analizleri. Nihayet, toluidin mavisi boyama dayalı histolojik çalışmalar numarası ve profil ölçümü izin, bize laringeal fonksiyonlarını değerlendirmek için izin miyelinli lif.Hep birlikte, biz, kültür, ide izole etmek için nasıl burada açıklamakOM ve OB ntify ve nakli OECS RLN bölüm-anastomoz ve nasıl aksonal büyütme ve laringeal fonksiyonları bu nakledilen hücrelerin etkinliğini değerlendirmek ve analiz etmek sonra.
Introduction
Koku mukoza (OM), merkezi sinir sistemindeki, periferik sinir sistemi ve koku ampul (OB) in, birinci koku alma sistemi, iki ayrı parçadan oluşmaktadır. Birincil koku alma sistemi, memeli türlerinde ömrü boyunca kendini yenilemek için birincil koku nöronların (PON) kapasitesi ile karakterize edilir. Bu özellik nedeniyle OM nöral kök hücrelerin varlığına mümkün olmaktadır. OM gelen OB PON büyüme ve büyütme koku ensheathing hücreleri olarak adlandırılan özel glial hücreler (OECS) tarafından kolaylaştırılır. OECS 1 OB OM gelen PON nöron için olumlu bir mikroortam oluşturmak nöral krest hücreleri vardır. Bu şekilde, hücre OECS 2,3 farklı alt-popülasyonunu oluşturan OM ve OB bulunabilir. OECS farklı özellikleri çeşitli sinir sistemi lezyonu paradigmalar 4 hücresel nakillerinde için bunları kullanmak kurşun bilim adamları var. Nitekim, OECS üretmek büyüme faktörleri, pr, glial korkuturuz azaltmakomote aksonal yeniden büyüme ve özgürce astrocytes 5,6 ile iç içe olabilir. Ancak, bu çalışmaların büyük çoğunluğu spinal kord yaralanması (SKY) dayalı, bunlardan birkaç periferik sinir hasarı (PNI) 7,8 sonra OECS kullandık.
Periferik sinir sistemi, sinir yaralanmasından sonra yenilemek için büyük bir kapasiteye sahip olmasına rağmen, tam bölümleri anormal aksonal büyütme neden. Nitekim, (RLN) yüz veya rekürren laringeal sinirlerin tam kesilirken sonra misrouted akson synkinesis denilen kas cocontractions neden olur. Bu nedenle akson büyümesini ölçmek için değil, aynı zamanda kas kasılmaları etkinliğini değerlendirmek için PNI bir model önermek için birincil önem taşımaktadır. Literatürde tarif edilen en yaygın model fasyal sinir lezyonu 9,10 dayanmaktadır. Bu modelde, fonksiyonel değerlendirmeler bıyık hareketleri 10 kurtarma dayanmaktadır. Ancak MOV etkinliğini göstermek için karmaşık, anahtar kelimeleri ve kas cocontractions fenomenleri ayrımcılık. Biz burada bir RLN lezyon dayalı bir model öneriyoruz. Bu model aksonal yeniden büyümesi ve ses tellerinin hareketleri değil, aynı zamanda hücresel nakillerinde 11,12 sonra bu hareketlerin verimliliği ve fonksiyonelliği değil sadece değerlendirilmesini sağlar. Bu protokol bir RLN bölüm / anastomoz modelinde OM ve OB kültür ve nakli OECS için adım prosedürü bir adım sağlar ve ameliyat sonrası hayvanları değerlendirmek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Koku Mukozası ve Koku Ampuller İlköğretim Kültürleri
- Diseksiyon önce
- 44 ml ilave etmek suretiyle, 50 ml, orta Make kalsiyum içermeyen Dulbecco Modifiye Eagle / Fetal Sığır Serumu (FBS), 5 ml ve penisilin / streptomisin, 1 ml ile takviye edilmiş Ham F12 ortamı (DMEM/F12).
- Coat 75 cm, poli-L-lisin (50 ug / ml, 1.5 ug / cm 2), oda sıcaklığında 1 saat ile 2 şişe hazırlanmıştır.
- PBS 1x şişeler durulayın.
- 1 hafta kadar buzdolabında kaplı şişeler saklayın.
- Teşrih
- Ötenazi herhangi bir yöntem kurumun hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından önceden onaylanan ve kalifiye personel tarafından yapılmalıdır.
- Böyle Fischer sıçanlar gibi tabii fareleri seçin.
- Sıçan sodyum pentobarbital veya ketamin / ksilizin gibi anestezi diğer enjekte formları ile derin anestezi girmiş onaylandıktan sonra, onu ve r başını kesmekcildi birikimleri temizlenmelidir.
- Anterior posterior kısmına kafatası açın.
- Meninks önlemek için OB alarak bakım çıkarın.
- Aynı sıçan olarak, burun boşluğu sagittaly açın.
- OM solunum mukozasını önlemek için dikkat çekici Kaldır. OM epitel kolayca sarımsı renk ile tespit edilebilir olduğunu unutmayın.
- OM diseksiyonu hakkında ayrıntılı protokoller bir önceki bulmak olabilir J. Vis. Uzm . yayın 13.
- Kültür
- 37 ° C'de 45 dakika boyunca% 0.1 tripsin içeren Hank tamponlu tuz çözeltisi (HBSS) içinde OB yerleştirin
- 37 ° C'de 45 dakika boyunca% 0.05 kolajenaz A içeren HBSS içinde OM yerleştirin
- Sıcak ortam 2 ml ilave etmek suretiyle enzimatik sindirim durdurun.
- Ortamı ile yıkayın ve 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
- 2 öğütün örnekleriHomojen bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar bir P1000 pipet kullanarak orta ml.
- Sıcak ortam, 25 ml önceden kaplanmış cam kaplarda (5-10 x 10 6 hücre / şişe) hücreleri Plate.
- % 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edilir ve hücreleri kültürü.
- Her 2 günde bir ortamın yarısı değiştirin.
- In vitro 6-8 gün sonra, küçük hücre örneklerinin p75 üzerinde pozitif hücrelerinin oranını kontrol sitometrisi veya immünositokimya akışı ile, kemirgenlerde OECS olduğu varsayılır. Bu analizler için, diğer belirteçler gibi GFAP ve S100β olarak ele alınabilir.
- Akış sitometri analizi
- "Hücresel transplantasyon" (bölüm aşağıdaki 2.2) de tarif edildiği gibi hücreler toplayın.
- 4 ° C'de 15 dakika boyunca p75 primer antikor (1:100) ile inkübe
- PBS-EDTA ile 2 ml hücreleri yıkanır ve 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
- 15 boyunca PE konjüge anti-fare ikincil antikoru ile hücrelerin inkübe(1:200) karanlıkta 4 ° C'de min.
- PBS-EDTA ile 2 ml hücreleri yıkanır ve 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
- PBS-EDTA 500 ul içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
- Akış-Sitometre 10-30 x 10 3 hücre analiz.
- İmmünositokimya analizi
- "Kültür" (aşağıda bölüm 1.1.2) de tarif edildiği gibi, 48 saat için kaplanmış, 6 oyuklu plakalar içerisinde hücreleri Plate.
- Hücrelerin PBS ile yıkayın.
- Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 4 PFA ile hücrelerin düzeltildi.
- Hücrelerin PBS ile yıkayın.
- Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS / Triton X100 (% 0.1) ile hücrelerin inkübe edin.
- Hücrelerin PBS ile yıkayın.
- Birincil antikor (1:200) ile hücrelerin inkübe: gece boyunca 4 ° C 'de p75, S100β ve GFAP
- Hücrelerin PBS ile yıkayın.
- Karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat boyunca, ikincil antikorlar (1:500) ile hücrelerin inkübe edin.
- Hücrelerin PBS ile yıkayın.
- R de Hoechst 10 dakika ile hücreleri inkübeKaranlıkta T.
- Hücrelerin PBS ile yıkayın.
- Bir floresan mikroskop kullanarak hücreleri analiz edin.
- GFP etiketleme hücreleri
- Beş gün önce, transplantasyon, geliştirilmiş GFP 20 (enfeksiyon çokluğu) barındıran lentiviral vektör ile gece boyunca OB ve OM kültürlerini enfekte.
- Küçük örnekler "kültür" (bölüm 1.1) daha önce açıklandığı gibi akış sitometri ile GFP pozitif hücrelerin oranı üzerinde transplantasyon önce check.
2. Cerrahi ve Transplantasyon
- Tekrarlayan sinir anastomoz
- Hayvanlarla Tüm deneyler kurumun hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından önceden onaylanan ve kalifiye personel tarafından yapılmalıdır.
- Önce cerrahi otoklav tüm araçlar ve cerrahi prosedürler boyunca sterilite korumak.
- Ketamin hidroklorür intraperitoneal enjeksiyon (12.5 mg / kg) ve klorpromazin hidroklorür ile (fare anestezisi0.625 mg / kg). Ameliyat öncesi ayak tutam tarafından anestezi yeterliliğini değerlendirmek.
- Dorsal yatar sıçan yerleştirin.
- Bir neşter ile 2 cm dikey orta servikal deri kesi yapmak.
- Medial beyaz çizgi izleyen infrahyoid kasların dikey bir kesi yapmak.
- Infrahyoid kaslar arasındaki autostatic ekartörünü kullanarak Larenksi Açığa.
- Rln Açığa.
- Mikroskobik kontrolünde, yedinci trakeal halka seviyesinde microscissors tam olarak sinir kesti.
- Mikroskopik kontrol altında 11.0 sütür bir noktasını kullanarak anastomoz gerçekleştirin. Bu ameliyat gırtlak belirli bir motor denervasyon yol açar.
- Hücre transplantasyonu
- Sadece transplantasyonundan önce, 37 ° C'de 5 dakika boyunca% 0.05 tripsin EDTA kullanılarak tabaklardan hücreleri çıkarmak
- Sıcak ortam 2 ml ilave etmek suretiyle enzimatik sindirim durdurun.
- 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
- Aşılama önce 1.5 ml bir tüp içinde DMEM/F12-Matrige l 01:02 karışımı (bu deneyde 30 ve 60 ul) ile hücre hazırlık yapmak ve buz üzerine yerleştirin. , Belirsiz etkilerini önlemek Matrigel azaltılmış büyüme faktörü kullanın.
- Sadece transplantasyon öncesinde Matrigel-orta karışımı ısınmak için birkaç saniye için elinizde tüpü tutmak.
- Bir pipet kullanarak anastomoz üzerinde karışımı azletmek ve yaralı sinir üzerinde karışım kendini kurullarının kadar bekleyin.
- Bir 4.0 sütür ile kaslar ve cilt kapatın.
- Ev fareler tek tek ve 24 saat için bir ısıtma lambası altında tutun.
3. Değerlendirme
- Laringoskopide
- Intraperit tarafından sıçan anestezisiketamin hidroklorür (12.5 mg / kg) ve klorpromazin hidroklorür (0.625 mg / kg) enjeksiyonu oneal. Onay sıçan önceki protokol ile devam bir ayak tutam ile anestezi uygulanmıştır.
- Dorsal yatar sıçan yerleştirin.
- Gırtlak en iyi görünümü sağlamak için ayarlanabilir bir 30 ° videolaryngoscope yerleştirin. Her kayıt için aynı görünüm çoğaltmak anatomik yerler belirleyin.
- Videolaryngoscope (5-10 dizileri / hayvan) kullanılarak vokal kord hareketleri kaydedin. Her hayvan için ardışık maksimal adduksiyonda ve maksimal kaçırılma üç dizileri seçmek.
- Görüntü analizi yazılımı kullanılarak laringeal fonksiyonunu analiz. Maksimal kaçırılması ve ses tellerinin maksimal adduksiyon hareketi arasındaki farkı ölçerek mutlak açısal hareketini belirlemek. Hareket genliği ölçülerek dinamik puanı belirler. Synkinesis ve paradoksal hareketlerini ölçerek fonksiyonel skoru belirleyin.
- Elektromiyografi (EMG)
- "Tekrarlayan sinir anastomoz" (bölüm 2.1) daha önce açıklandığı gibi cilt ve kasların açarak gırtlak ve trakea Açığa.
- Krikotiroid kıkırdak Açığa.
- Microscissors kullanarak posterior krikoaritenoid (PCA) kas maruz krikotiroid kıkırdak açın.
- PCA kas monopolar iğne elektrodu (38 x 0.45 mm) tanıtmak.
- Spontan ventilasyon sırasında bir toplama sistemi kullanılarak PCA kasın elektriksel kas aktivitesini kaydedin.
- Solunum ile zenginliği ve senkronizasyon açısından kas aktivitesini analiz. , Zengin aktivite ile izleme kafiyeli: artan solunum ile izleme kafiyeli, ama kötü tracing (neurogen), 2: ilham, 1 sırasında kafiyesiz aydınger, artış olmadan: 0: EMGs analiz etmek, aşağıdaki ölçeği kullanarak 0-3 nitel bir puan atamak 3: bir i oluşturan, çok zengin izleme kafiyelimaksimal kasıtlı aktivitesine benzer nterference model.
- Gecikme ve potansiyel süresini ölçmek için vagus siniri ortaya. RLN nedeniyle küçük boyutu uyarılması sırasında zarar görebilir çünkü vagus siniri uyarımı yeri olarak seçilir.
- Bir elektrod ile vagus siniri uyarır.
- PCA kas elektrik sinyallerini kaydedin. Gecikme ve potansiyel süresini ölçün. Mümkünse bu tür Powerlab sistemi gibi kas aktivitesini, gecikme ve potansiyel süresini kaydetmek için bir satın alma modülünü kullanabilirsiniz.
- Histoloji
- Pentobarbital doz aşımı ile hayvan Euthanize.
- Mikroskopik kontrol altında RLS distal güdük çıkarın. RLS distal kısmı anastomoz ve gırtlak arasındaki bir parçası olarak tanımlanır. Bu 11.0 sütür emilemeyen dikiş çünkü birkaç hafta cerrahi sonrası anastomoz site bulmak mümkün olduğunu unutmayın.
- 0.1 M fosfat ile% 2 glutaraldehid RLS distal kısmını yerleştirin4 ° C'de 2 saat boyunca (pH = 7.3)
- Dikkatle koronal bölümleri gerçekleştirmek için örnekleri yönlendirmek.
- Fosfat tamponunda örnekleri yıkayın.
- % 1 kakodilat içinde, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca küçük parçaları (3-4 mm uzunluk) ve postfix'i in kesin OsO 4 ve etanol ile susuz tamponlu.
- Orient silikon kalıplara örnekler ve, POLYBED 812, DDSA ve MNA olarak oluşan reçineler gömülü hızlandırıcı BDMA% 2 ilave edilmiştir.
- Bir Pyramitome Ultramikrotom Sistemi kullanılarak yarı-ince enine kesitler (1 Pm'lik-kalın) yapmak.
- , 70 ° C'de 75 saniye süre ile% 1 sodyum tetraborat içinde% 0.1 Toluidin Mavisi ile leke
- Bir sayma analiz sistemi ile RLN örnekleri analiz. Elyaf sayısını ve miyelin kılıfının dış ve iç sınır belirleyerek miyelinli sinir lifleri profillerini ölçmek.
- Transplantasyon
- Nakli için hücrelerin hazırlanması ve daha önce tarif hücreleri nakli"hücresel transplantasyon" (bölüm 2.2).
- Analiz
- Pentobarbital doz aşımı ile hayvan Euthanize. Hayvanların bu sabitleme PFA intrakardiyak enjeksiyonu% 4 kullanılarak gerçekleştirilebilir edin.
- RLS yaklaşık 2 cm çıkarın. Proksimal ve RLS distal parçaları kullanın.
- Sıvı azot içinde RLN örnek düzeltildi.
- -80 ° C'de saklayın örnekleri
- Kesim örnekleri boyuna sirostat (10-20 mikron kalınlığında) kullanarak.
- GFP pozitif hücreleri algılamak için floresan mikroskop altında örnekleri analiz. Anti-GFP floresan emisyonu antikor geliştirmek için ve costainings gerçekleştirmek için kullanılabilir unutmayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kontrol ve (bölüm / anastomoz) hayvanlar innerve olmuş sahip çizimler sonuçları (OM, OB veya OM + OB) gerçekleştirilen hücre nakillerinde bağlı olarak değişebilir olarak seçilmiştir.
Hücre kültürü
Hücreler plastik yüzeye yapışır ve hızlı bir şekilde uzatılmış ya da gittikçe incelen, üçgen, çok kutuplu veya iğ şeklinde olan hücrelerin paralel parçaya içine ayrılmış oldu (Şekil 1A ve 1B). Sitometri analizi vitro akışta 8 gün sonra, p75 pozitif hücrelerin oranı, birincil OB% 71 ve birinci OM kültürlerinde% 13 (Şekil 1C ve 1D) gösterir.
Hücre transplantasyonu ve cerrahi
Hücreler ağızlaşmak RLS üzerinde bir Matrigel-orta karışımı nakledilmektedir. RLS anastomoz 11.0 sütür bir noktada (Şekil 2) ile yapılır.
Değerlendirmeler
Videolaryngoscopyala iki ay naklinden sonra, laringeal fonksiyonları videolaryngoscopy ve elektromiyografi ile analiz edildi. Gerçekleştirmek için videolaryngoscopy anatomik oluşumlar kaçırılması ve adduksiyon arasındaki fark (Şekil 3) ölçmek için seçildi.
Elektromiyografi
Bu tamamlamak için EMG çalışmaları PCA kaslarda implante monopolar iğne elektrot kullanılarak gerçekleştirilen analizler. Normal ve innerve olmuş (bölüm / anastomoz) hayvanlar için tipik izleri Şekil 4'te sunulmaktadır.
Histolojik analizler
Bu hayvanlar için, RLS histolojik analizleri toluidin mavi lekeleme testi ile gerçekleştirilmiştir. Normal ve innerve olmuş (bölüm / anastomoz) hayvanlar için tipik fiber profilleri Şekiller 5A ve 5B 'de sunulmuştur. Bu histolojik analizler tamamlamak için, GFP pozitif hücrelerin izleme yapıldı. Şekil 5C t görüntülemektedir intra-sinir nakli sonrası siyatik sinir içine GFP pozitif hücrelerin de varlığı. RLN boyutlu içi sinir nakli izin vermez siyatik sinir kontrol olarak kullanılmıştır.
OB ve OM Şekil 1. Morfolojik özellikleri ve in vitro olarak OB (A ve C) ve OM (B ve D) birincil kültürlerinde P75 ekspresyonu. (A ve B) OECS primer kültürleri, uzun üçgen veya iğ şekilli morfolojiye eksprese . (C ve D) ve OB OM primer kültürlerinde p75 hücre yüzeyi ekspresyonu akış sitometrisiyle belirlendi. Sayılar, toplam nüfus ve belirtilen kapı bölgelerde bulunan hücrelerin yüzdesini gösterir. Lütfen / 50590fig1highres.jpg "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. RLS bir anastomoz Resim 11.0 sütür ile gerçekleştirildi. (A) Kesitli RLN ameliyat öncesi. Proksimal ve RLS distal güdük arasında, (B) anastomoz. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
"Src =" / files/ftp_upload/50590/50590fig3.jpg "/>
Şekil 3,. Sıçan Glottis planının tipik endoskopik görünümleri. Değerlendirmeler sırasında, görülecek her kayıt için görüş aynı alanı olması için belirlenir. Sunulan görünümünden maksimal kaçırma (A) ve maksimal adduksiyon (B) iki ölçülür. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 4,. PCA kasta solunum sırasında elde edilen EMG izlerinin örnekler. (A) kontrol grubunda Hayvanlar ilham sırasında bir artış ile, zengin bir elektriksel kas aktivitesini sundu. (
Şekil 5. Histolojik sinir çalışmaları. (A ve B) kontrol grubundan RLS koronal bölümleri örneği. Bu analiz, kontrol grubu miyelinli liflerin, daha yüksek bir dizi sunulmuştur gösterdi. (A) Büyütme 3.960 X ve (B) büyütme 11.900 X. OB etiketli (C) GFP-OECS ezilmiş siyatik sinire lezyon yerinde kalmıştır. Büyütme 100X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan teknikler OECS periferik sinir hasarı modellerinde hücresel nakli incelemek için yararlı bir model olun. Hücre kültürü protokol nispeten basittir ve kolayca gerçekleştirilebilir. Öte yandan, cerrahi işlemler, RLS belirli bir bölüm / anastomozlarda, deneyim gerektiren ve kalifiye personel tarafından yapılmalıdır.
Bu protokol açıklanan prosedürler mümkün olan en iyi sonuçları elde etmek için odaklanmak önemli faktörler vurgulayın. İlk olarak, OM ayrışma sırasında, biz sadece koklama ve solunum değil epitel elde etmek için dikkatli bir diseksiyon öneririz. İkincisi, RLS anastomoz için, biz 11.0 sütür ile tek bir nokta performans öneririz. Üçüncü olarak, değerlendirme esnasında tüm hayvanlar arasındaki anestezi derinliği ile aynı olması çok önemlidir. Özel olarak, derin anestezi videolaryngoscopy sırasında ses tellerinin hareketinin genliğini azaltır. Biz r öneriyorhayvanların asfiksi önlemek için en kısa sürede larengoskop emoving. EMG kaydı sırasında, nedeniyle PCA kasların boyutuna dikkatle monopolar iğne elektrot yerleştirerek öneririz. Son olarak, histolojik çalışmalar için dikkatli koronal bölümleri elde etmek için RLN örnekleri yönlendirmek için önemlidir. Bu Wallerian dejenerasyon meydana geldiği RLS distal kısmını çıkarmak ve analiz etmek için de çok önemlidir.
Burada açıklanan protokoller kolayca OB ve OM den OECS saflaştırılmış kültürleri üretmek amacıyla modifiye edilebilir. OB OECS saflaştırılması için biz Nash, 14 tarafından tarif edilen teknik tavsiye ve OM den OECS saflaştırılması için biz Bianco 15 tarafından tarif edilen bir yöntem önerilir. Bu iki spesifik saflaştırma yöntemleri son derece OECS (% 90) saf hale kültürleri gibi ve daha önce de kendi 14,15 yazarlar tarafından tarif edilmiştir izin verir. Başka bir olası değişiklik transplantasyon işlemdir nereyee hücreler siyatik sinir 7 için daha önce tarif edildiği gibi bir periferal sinir içine direkt olarak enjekte edilebilir. Bu durumda, hücreler, Matrigel olmadan enjekte edilebilir. Bu nedeniyle doğrudan bu sinir hücreleri içine enjekte etmek mümkün değildir RLS büyüklüğüne dikkat etmek önemlidir. Sonunda başka bir olası değişiklik EMG protokolünün optimizasyonu olduğunu. Nitekim, PCA ve diyafram kaslarının kas aktivitesi kayıtları laringeal ve solunum kasları arasında senkronizasyon için ihtiyacı ortadan kaldırarak, birlikte yapılabilir.
Mevcut protokoller, diğer sinir lezyonu paradigmasında uygulanabilir. Biz zaten böyle siyatik ve vagus sinirleri PNI çeşitli modellerinde OECS naklettiklerini, bu tedavilerin kolayca diğer PNI kullanılabilir 8,11,12,16 paradigmalar. OECS Daha ilginci hücresel transplantasyon özellikle SCI merkezi sinir sistemi hastalıkları için uzatılabilir. Laringeal ölçümü için burada tarif edildiği gibi bir yöntemRLN bölüm / anastomoz sonra işlev, aynı zamanda diğer hücresel transplantasyon protokolleri için de kullanılabilir. Nitekim, laringeal modelleri aksonal yeniden büyüme ve synkinesis olayları değerlendirmek için çok güçlü olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar yazının düzenleme için mali destek ve Dr Fanie Barnabé-Heider ADIR (İkametgah aux Insuffisants Respiratoires à Aide) ve Fondation de l'Avenir kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | E3521T | |
| FBS | Invitrogen | E3387M | |
| Penicilin/streptomycin | Invitrogen | 1152-8876 | |
| HBSS | Invitrogen | M3467Y | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | M3513P | |
| Cacodylate | Merck | 1.03256.0100 | |
| DDSA | Biovalley | 00563-450 | |
| MNA | Biovalley | 00886-450 | |
| BDMA | Biovalley | 00141-100 | |
| Polybed 812 | Biovalley | 08791-500 | |
| PE anti-mouse | BD Bioscience | 550589 | |
| Matrigel GFR | BD Bioscience | 356231 | |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
| Mouse anti P75 | Chemicon | MAB 365 | |
| 11.0 Wire | Ethicon | FG 2881 | |
| Toluidine Blue | Ral Diagnostics | 361590-0025 | |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 2-16PK | |
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| Laminar flow hood | Faster | BH-EN 2003 S | |
| Flow cytometer | BD Bioscience | FACSCalibur | |
| Microscope | Zeiss | ||
| Videolaryngoscope | Karl Storz Endoskope | Telecam SL NLSC 20212120 | |
| Acquisition system | AD Instruments | Powerlab system | |
| Pyramitome Ultramicrotomy System | Leica | Ultracut S | |
| Image analysis system | Explora Nova | Mercator |
References
- Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21040-21045 (2010).
- Guerout, N., et al. Comparative gene expression profiling of olfactory ensheathing cells from olfactory bulb and olfactory mucosa. Glia. 58, 1570-1580 (1002).
- Honore, A., et al. Isolation, characterization, and genetic profiling of subpopulations of olfactory ensheathing cells from the olfactory bulb. Glia. 60, 404-413 (2012).
- Franssen, E. H., de Bree, F. M., Verhaagen, J. Olfactory ensheathing glia: their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord. Brain Res. Rev. 56, 236-258 (2007).
- Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes. Glia. 32, 214-225 (2000).
- Woodhall, E., West, A. K., Chuah, M. I. Cultured olfactory ensheathing cells express nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor, glia cell line-derived neurotrophic factor and their receptors. Brain Res. Mol. Brain Res. 88, 203-213 (2001).
- Dombrowski, M. A., Sasaki, M., Lankford, K. L., Kocsis, J. D., Radtke, C. Myelination and nodal formation of regenerated peripheral nerve fibers following transplantation of acutely prepared olfactory ensheathing cells. Brain Res. 1125, 1-8 (2006).
- Guerout, N., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells promotes axonal regeneration and functional recovery of peripheral nerve lesion in rats. Muscle Nerve. 43, 543-551 (2011).
- Guntinas-Lichius, O., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells stimulates the collateral sprouting from axotomized adult rat facial motoneurons. Exp. Neurol. 172, 70-80 (2001).
- Makoukji, J., et al. Lithium enhances remyelination of peripheral nerves. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109, 3973-3978 (2012).
- Guerout, N., et al. Co-transplantation of olfactory ensheathing cells from mucosa and bulb origin enhances functional recovery after peripheral nerve lesion. PloS one. 6, 22816 (2011).
- Paviot, A., et al. Efficiency of laryngeal motor nerve repair is greater with bulbar than with mucosal olfactory ensheathing cells. Neurobiol. Dis. 41, 688-694 (2011).
- Girard, S. D., et al. Isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans. J. Vis. Exp. , (2011).
- Nash, H. H., Borke, R. C., Anders, J. J. New method of purification for establishing primary cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb. Glia. 34, 81-87 (2001).
- Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose. Glia. 45, 111-123 (2004).
- Paviot, A., Bon-Mardion, N., Duclos, C., Marie, J. P., Guerout, N. Although olfactory ensheathing cells have remarkable potential to sustain nerve regeneration, they cannot be applied to a severe vagus nerve section/resection model. Muscle Nerve. 43, 919-920 (2011).
