Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

حقن مكروي التجسيمي من ناقلات فيروسية وإذ تعرب عن لجنة المساواة العرقية recombinase البكتيري المحور إلى دراسة دور الجينات المستهدفة في الكوكايين مكيفة مكان ميول

Published: July 30, 2013 doi: 10.3791/50600
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Graduate Program in Neuroscience, Weill Cornell Graduate School of Biomedical Sciences, 2Division of Pediatric Neurology, Department of Pediatrics, Weill Cornell Medical College

Summary

توضح هذه المقالة كيفية microinject ناقلات فيروسية في مخ الفأر ثم اختبار في تفضيل مكان الهواء نموذج يتضمن مرحلة الاستحواذ، وإعادة الانقراض.

Abstract

Microinjecting المؤتلف الفيروسية (rAAV) ناقلات adenoassociated معربا عن لجنة المساواة العرقية في recombinase البكتيري المحور الماوس متميزة مناطق الدماغ إلى انتقائية الجينات خروج المغلوب من الفائدة يسمح لتعزيز الرقابة زمانيا ومحددة إقليميا من حذف الجينات، مقارنة مع الأساليب القائمة. بينما الشرطي حذف يمكن أيضا أن يتحقق من خلال التزاوج الفئران التي تعبر عن لجنة المساواة العرقية recombinase البكتيري المحور تحت سيطرة المروجين جين معين مع الفئران يحمل الجين floxed، حقن مكروي التجسيمي يسمح لاستهداف مناطق الدماغ منفصلة في نقاط زمنية مجرب محدد من الفائدة. في سياق الكوكايين الهواء تفضيل مكان، وغيرها من النماذج السلوكية مثل الكوكايين الإدارة الذاتية أو التوعية الحركية التي يمكن أن تنطوي على الانسحاب، وانقراض و / أو إعادة مراحل، هذه التقنية مفيدة بشكل خاص في استكشاف مساهمة فريدة من الجينات المستهدفة لهذه متميزة مراحل من النماذج السلوكية للاللدونة الكوكايين التي يسببها. على وجه التحديد،هذا الأسلوب يسمح للالاجتثاث الانتقائي من الجينات المستهدفة خلال مراحل منفصلة من سلوك لاختبار مساهمتها في السلوك عبر الزمن. في نهاية المطاف، هذا الفهم يسمح للعلاجات أكثر المستهدفة التي هي الأقدر على معالجة عوامل الخطر الأكثر فعالية التي تطرح نفسها خلال كل مرحلة من مراحل السلوك الادمان.

Introduction

الكوكايين هو منبه نفسي يعزز إلى حد كبير. بعد التعرض المتكرر، تحدث العديد من التعديلات الجزيئية والخلوية في الثواب ذات الصلة دوائر الدماغ التي يعتقد أنها تؤدي إلى القهري المخدرات سلوك التماس، مما دفع ارتفاع معدلات الانتكاس التي تشكل مشكلة خطيرة السريرية 1. الكوكايين تمارس هذه الآثار السلوكية طويلة الأمد من خلال تنظيم التعبير الجيني. لدراسة التعديلات التي تنشأ عن استخدام الكوكايين المزمن، وقد استخدمت نماذج القوارض قبل السريرية على نطاق واسع. واحدة من هذه النموذج هو تفضيل مكان الهواء (CPP) نموذج. هذا النموذج ينطوي على تطوير جمعية المستفادة بين بيئة محايدة سابقا وخصائص مجزية من الكوكايين. بعد عدة أزواج من الكوكايين مع غرفة خاصة، ويسمح الحيوانات لاستكشاف البيئات الكوكايين مقترن وغير الكوكايين تقرن بحرية وإذا كانوا يفضلون المقصورة المخدرات إرفاقها، ويقال أنها قد حصلت على تناو التي يسببها الكوكايينه تفضيل. وعلاوة على ذلك، وبعد فترة التدريب الانقراض، هذا النموذج يمكن استخدامه لدراسة إعادة سياق محددة من الكوكايين في سلوك التماس.

بالمقارنة مع النماذج السلوكية الأخرى للسلوك الادمان مثل، مثل التوعية الحركية، والتي تستخدم لدراسة طويلة الأمد التي يسببها الكوكايين السلوكية واللدونة الجزيئية 2،3 والإدارة الذاتية (SA)، التي يعتقد أنها أكثر دقة تقليد الادمان مثل السلوك وجدت في البشر، ونموذج CPP هو إجراء بسيط لدراسة الكوكايين التعلم السياقية 4. بروتوكولات CPP يمكن تمديد ملائم لتشمل الانقراض ومراحل إعادة، على غرار SA، والتي تسمح للتحقيق في الآليات الكامنة وراء حنين المخدرات، ويعتقد 5-7 الانتكاس والتي لألخص جوانب ما يحدث في الإنسان المخدرات سلوك التماس والمخدرات - وجديلة الناجم عن الانتكاس 8-10.

واحدة آلية والذي أدى إلىالكوكايين التي يسببها اللدونة السلوكية التي هي من سمات كل مرحلة من المراحل المتميزة من حزب الشعب الكمبودي، بما في ذلك الاستحواذ، انقراض، وإعادة، هو تفعيل التواقيع فريدة في التعبير الجيني داخل مناطق الدماغ المختلفة. لاختبار مباشرة التي الجينات داخل مناطق الدماغ ذات الصلة مكافأة توسط الكوكايين التي يسببها التغيرات السلوكية، فمن المفيد أن تكون قادرة على التلاعب بها بشكل انتقائي بطريقة محددة إقليميا. طريقة واحدة لتحقيق ذلك هو microinject المؤتلف الفيروسية ناقلات adenoassociated (rAAV) التي تعبر عن لجنة المساواة العرقية recombinase البكتيري المحور باستخدام جراحة التجسيمي، في مناطق الدماغ متميزة من الفئران التي لديها جينات المستهدفة يحيط بها مواقع LoxP (الفئران floxed). هذه الطريقة تسمح للسيطرة الزمانية والإقليمية دقيقة جدا على متى وأين يتم ذاب الجينات، في كل من الخلايا العصبية الانقسام وعدم تقسيم، دون إحداث الاستجابات المناعية 11-13. هذا المستوى من السيطرة يمثل ميزة هامة عبر تقنية جنة المساواة العرقية، LoxP التقليدية لتربية الفئران floxed ثالفئران إيث معربا عن لجنة المساواة العرقية recombinase البكتيري المحور تحت السيطرة على المروج الجين الذاتية، في أن توقيت وتوزيع حذف الجينات يمكن تنظيم أكثر إحكاما. بالإضافة إلى ذلك، ناقلات فيروسية بوساطة الجينات خروج المغلوب تلتف المحتملة الآثار التعويضية التنموية التي قد تحدث باستخدام استراتيجيات خروج المغلوب التقليدية.

بالإضافة إلى الكوكايين CPP، الذي يوصف هنا، Microinjection من rAAV-لجنة المساواة العرقية في الدماغ من الفئران floxed لتقييم دور جينات معينة يمكن تطبيقها بتواجد مطلق لنماذج السلوك التي تنطوي على مراحل منفصلة، ​​بما في ذلك الإدارة الذاتية والتوعية الحركية. على سبيل المثال، مختبرنا وقد استخدمت هذه التكنولوجيا rAAV-لجنة المساواة العرقية لدراسة دور الكالسيوم V 1.2 لتر من نوع كا 2 + قنوات في الكوكايين الحركية توعية 14. على وجه التحديد، تم microinjected rAAV-جنة المساواة العرقية في النواة المتكئة (NAC) من الفئران مع الجينات ترميز كا V 1.2 floxed، لإثبات أن كا الخامس 14،15. ومع ذلك، لا يمكن لاستراتيجية rAAV-لجنة المساواة العرقية أن تستخدم إذا الفئران مع الجينات floxed من مصلحة لا وجود لها، كما كان تجربتنا عند تقييم دور الكالسيوم V 1.3 لتر من نوع كا 2 + قنوات في التوعية الحركية. وبالتالي، وجود قيود على استخدام rAAV-لجنة المساواة العرقية يطرح نفسه حالة عدم وجود الفئران مشروط لجين معين من الفائدة. ومع ذلك، rAAVs التي تعبر عن سيرنا يمكن استخدامها لضربة قاضية الجينات المستهدفة، كما فعلنا لدراسة دور الكالسيوم V 1.3 قنوات 14،15.

Microinjecting rAAV-جنة المساواة العرقية في مناطق الدماغ منفصلة من الفئران floxed ثم اختبارها في نموذج CPP يسمح للتحقيق في الجينات المحددة التي توسط في مراحل مختلفة من السلوك الادمان مثل وحيث أنهم يتصرفون. استخدام هذا النموذج ساعد في فهمنا لكيفية إدارة الكوكايين المتكررة في جوهر يخطف مكتب الاتصالات الراديويةاهلية ت دائرة الإثابة تسبب تغيرات غير القادرة على التأقلم في الجزيئية مسارات نقل الإشارة والتعبير الجيني التي تؤدي إلى حالة المدمنين 1،16،17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وتجرى جميع الإجراءات وفقا لكلية طب وايل كورنيل المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام القواعد.

1. إعداد والإعداد لالتجسيمي تسليم ناقلات فيروسية

  1. إذا الملوثة صك، مسحة معقمة، أو من ناحية ارتداء القفازات المعقمة قبل ملامسة سطح غير معقمة، وتجاهل أو إعادة تعقيم أداة باستخدام حبة تعقيم الساخنة، وتجاهل مسحة أو تغيير لقفازات معقمة جديدة.
  2. ضع قفص الفأر مع الفراش على كتلة الحرارة لتدفئة للانتعاش بعد الجراحة.
  3. إعداد الحلاقة الكهربائية لحلق الرأس والإيثانول واليود لتعقيم فروة الرأس.
  4. مسح أسفل القضبان الأذن والفم عقد من stereotax مع الايثانول 70٪.
  5. باستخدام 5 ميكرولتر حقنة هاميلتون، ووضع 5 ميكرولتر من ناقلات فيروسية (1 × 10 6 الجسيمات الفيروسية / ميكرولتر) والتي أنشئت في حامل حقنة على stereotax.
  6. وسادة تسخين الميكروويف أو إيقاف وحة كهربائية علىالمركز الثاني على stereotax. تغطية مع لوحة ماصة نظيفة للحد من خطر الحروق. رصد الماوس درجة حرارة الجسم (بين 97 حتي 99،5 ° F) بشكل متكرر طوال الإجراء.
  7. حقن الفأر (وزنها بين 22-35 جرام) مع خليط من الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (20 ملغ / كلغ). مرة واحدة في الفأر هو تخدير، قرصة طرف الذيل للتحقق من ردود الفعل الماوس، وملاحظة أي حركة أو استجابة للتأكد من أن الفأر هو تخدير كاف.
  8. حلق الرأس بين الأذنين والعينين.
  9. تنظيف حليق الرأس بالتناوب مع تطبيقها الإيثانول واليود القطن المعقم.
  10. نقل الماوس لوحة ساخنة على stereotax.

2. حقن مكروي التجسيمي من ناقلات فيروسية

  1. ارتداء القفازات المعقمة في جميع أنحاء عملية جراحية. إذا كانت ملوثة القفازات في أي لحظة عن طريق لمس أسطح غير معقمة، تغيير القفازات.
  2. صفر شريط الأسنان وموازين شريط الأذن.
  3. تعيين الأسنان في شريط الأسنان.
  4. المسمار في كمامة. إذا التلوي أو التحرك الطوليويلاحظ منة في أي وقت، إدارة جرعة معززة IP (~ 0.05 سم مكعب) من مزيج من الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (20 ملغ / كلغ).
  5. المسمار في الحانات الأذن.
  6. تليين العينين مع PuraLube.
  7. قطع فروة الرأس مفتوحة للخلف الأذنين مع مشرط.
  8. مكان كليب بلدغ على زوايا فروة الرأس لقشر الجلد بعيدا عن الجمجمة. و bregma امدا يجب أن تكون مرئية بسهولة.
  9. جعل متأكد من خياطة bregma لامدا يتم محاذاة على التوالي. إذا الخيط هو إعادة تكييف تحديد المواقع ملتوية من الرأس.
  10. تحقق للتأكد من وركزت جميع الإعدادات على stereotax.
  11. وضع إبرة في طرف المكان في bregma.
  12. قياس جميع الإحداثيات على حد سواء و bregma امدا. وهذا يشمل ظهري / بطني، الإحداثيات وسطي / الوحشي والأمامي / الخلفي.
  13. ضبط رئيس حتى إحداثيات بطني لو bregma امدا ضمن 0.02 ملم من بعضها البعض.
  14. مرة واحدة الانحياز، من bregma تذهب إعلامي الخروج إلى إحداثيات سطي / الوحشي (M / L). تأكديتم محاذاة الجانبين الأيسر والأيمن في غضون 0.02 ملم من بعضها البعض.
  15. في وسط إعادة طرف الإبرة على و bregma من هناك تحرك في الاتجاه الأمامي / الخلفي (A / P) للالأمامي / الخلفي تنسيق المطلوب.
  16. إذا لزم الأمر، إبرة زاوية في اتجاه واحد وتأكد من تأمين stereotax. الخروج إلى اليسار M / L تنسيق (+ / - 1.52)
  17. قياس موقف بطني من الجزء العلوي من الجمجمة لاستخدامها كمرجع بعد حفر البئر.
  18. حفر بئر باستخدام العقيمة قمة الحفر في الإحداثيات المطلوبة. تحقق من أن الإبرة يمكن أن يدخل دون انقطاع من خلال الجمجمة.
  19. خفض الإبرة إلى تنسيق بطني المطلوب.
  20. مرة واحدة يتم الوصول إلى تنسيق، وتراجع 0.015 مم أدناه ل~ 10 ثانية لخلق جيب صغير لناقلات الفيروسية.
  21. حقن حجم المطلوب من ناقلات الفيروسية بمعدل 0.1 ~ ميكرولتر / دقيقة. انتظر 3 دقائق لناقلات الفيروسية لنزع فتيل تماما. رفع إبرة غيض 0.015 ملم والانتظار لمدة 2 دقيقة إضافية.
  22. تراجع الإبرة (إذا فعل الحقن الزاوية) في الاتجاه المعاكس. مرة أخرى، وتسجيل موقف بطني كمرجع لأعلى الجمجمة.
  23. كرر نفس الخطوات على الجانب الأول لحقن النواقل الفيروسية على الجانب الآخر (إذا فعل الحقن الثنائية).
  24. تطبيق الشمع العظام على حد سواء الثقوب لختم لهم باستخدام نهاية خشبي من القطن المعقم طرف قضيب.
  25. خياطة فروة الرأس.
  26. تطبيق إحصار العصب إلى منطقة الجرحى.
  27. إزالة الماوس من stereotax ومكان في قفص تحسنت في كتلة الحرارة لاسترداد لمدة 45 دقيقة.
  28. رصد لعلامات الألم بما في ذلك: انخفض النشاط العام أو الأرق، وانخفاض استهلاك الغذاء والماء أو زيادة النطق. البوبرينورفين (0،05 حتي 0،2 ملغ / كلغ) ويمكن أن تدار مرتين يوميا لمدة أسبوع إذا كان ذلك ضروريا للألم. بدائل مقبولة تشمل: الميبيريدين (20-60 ملغ / كلغ)، بنتازوسين (10 ملغ / كلغ)، نالبوفين (4-8 ملغ / كلغ).

3. مكيفة مكان المفضل: AcquisitioN، الانقراض، وإعادة التنصيب

  1. مكان الفئران في الغرفة المركزية للثلاثي غرفة مكان جهاز تفضيل (ميد شركاه المحدودة، ألبانز، VT، الولايات المتحدة الأمريكية) لثانية فترة التعود 60 مع الأبواب مقصلة مغلقة.
  2. بعد التعود، والأبواب مفتوحة وتسمح المقصلة الفئران استكشاف خالية من جميع الغرف 3 ل1،200 ثانية، مع الوقت الذي يقضيه في كل غرفة يتم تسجيلها باستخدام MedPC الرابع البرمجيات (ميد شركاه، وشركة).
  3. تعيين الفئران إلى الغرف تكييف هواء بناء على أدائهم خلال فترة ما قبل الاختبار. باستخدام تصميم، الدواء الزوج منحازة خلال 3 أيام لاحقة مع المقصورة التي كانت الأقل تفضيلا خلال خط الأساس قبل الاختبار.
  4. خلال الأيام تكييف 3 القادم، حقن الفئران مع الكوكايين (10 ملغ / كغ؛ IP) خلال الجلسة الصباحية وحصرها في الغرفة المخصصة لهم ل1،200 ثانية مباشرة بعد الحقن. عودة الفئران لأقفاص وطنهم بعد الدورة. بعد 4 ساعات، حقن الفئران بمحلول ملحي (0.01 مل / زوزن الجسم) وجودهم مقتصرا على غرفة المعاكس للدورة بعد الظهر ثوانى 1،200.
  5. لاختبار اكتساب، مكان الفئران في الغرفة المركزية مع الأبواب مقصلة مغلقة لفترة ثانية التعود 60. الأبواب مفتوحة وتسمح المقصلة استكشاف مجانية ل1،200 ثانية، مع الوقت الذي يقضيه في جميع الدوائر التي سجلتها MedPC الرابع البرمجيات (ميد شركاه، وشركة). حساب تفضيل وذلك بطرح مقدار الوقت الذي يقضيه في قاعة المالحة الاقتران من مقدار الوقت الذي يقضيه في غرفة الكوكايين المقترنة.
  6. لإطفاء تفضيل مكان، فضح الفئران لمدة 20 دقيقة من جلسات استكشاف يومية مجانية في نفس الجهاز، مفصولة لا يقل عن 2 ساعة، ابتداء من 24 ساعة بعد اختبار لاكتساب. الوقت الذي يقضيه في كل الدوائر يجب أن تسجل مرة أخرى ويجب مقارنة حجم CPP الأولي مع أن كل دورة الانقراض.
  7. تحديد ما إذا كانت الفئران قد انطفأت تفضيل المخدرات التي يسببها من خلال تقييم ما إذا كان تفضيل قدم المساواةغرفة حتديدا عبر يومين متتاليين الانقراض هو أقل بكثير بالمقارنة مع النتيجة أفضلية الاستحواذ.
  8. إعادة الفئران بجرعة فتيلة من الكوكايين (5 أو 10 ملغ / كغ؛ IP) وإعادة فضح لجهاز الاستكشاف السماح الحرة وتسجيل الوقت الذي يقضيه في كل مقصورة.
  9. إدارة حل القتل الرحيم Euthasol (150 ملغ / كلغ). يروي Transcardially الفئران مع بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) وإجراء الفحص النسيجي للتحقق من صحة الصحيح موضع حقن مكروي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CPP

بعد أداء CPP على الفئران microinjected، ينبغي للمرء أن تحقق من أن الفوج من السيطرة حقن (rAAV-GFP) الفئران قد اكتسبت عادة تفضيل للغرفة التجارية المقترنة المخدرات (الشكل 1A، 1B). تعتبر الفئران لاكتسبوا تفضيلها لغرفة خاصة عندما تفضيل الكوكايين (الوقت الذي يقضيه في غرفة الكوكايين تقرن ناقص الوقت الذي يقضيه في قاعة المالحة إقران) هو أعلى بكثير بالمقارنة مع درجة تفضيل خط الأساس (الشكل 1B، A مقابل B) . إذا، كما أتراب، السيطرة على الفئران المحقونة لا تظهر تفضيل للغرفة الكوكايين إرفاقها، أو إظهار النفور، يجب التأكد من صحتها على الفور عبر التنسيب الأنسجة (انظر القسم الفرعي rAAV حقن) والفئران مع وضع غير صحيح وينبغي التخلص منها.

إذا تفضيل قد تم الحصول عليها عادة من قبل الفوج السيطرة المحقونة، يمكن للمرء أن تمتد لاحقا إلى نموذج من قبل انقراض بداية (الشكل 1A (1B الشكل، E3، E4، E5 مقابل A). في هذا الوقت، يمكن للمرء أن يعيد مع رئيس المخدرات (الشكل 1A، 1B). إذا كانت النتيجة تفضيل بعد إعطاء رئيس المخدرات لا يمكن تمييزه إحصائيا من ذلك في الاستحواذ، ثم يقال أن الفوج قد أعادت تفضيل المخدرات التي يسببها للغرفة المخدرات تقرن (1B الشكل، R مقابل A).

rAAV إبر دقيقة جدا

قبل متابعة استراتيجية تجريبية rAAV-لجنة المساواة العرقية ضمن أي نموذج السلوكية ينبغي لأحد أن تحقق من أن rAAV-لجنة المساواة العرقية قد طرقت في الواقع من الجينات في المصالح في الفئران microinjected بواسطة QPCR (الشكل 1C) و / أو لطخة غربية أو تحليل المناعى 18 </ سوب>. على سبيل المثال، بعد Microinjection من rAAV-جنة المساواة العرقية، GFP في حلف شمال الأطلسي من الفئران التي لديها نوع L-قناة الكالسيوم الإسوي كا V 1.2 floxed، تظهر rAAV-لجنة المساواة العرقية اللكمات حقن انخفاض كبير في التعبير الجيني (الشكل 1C). بالإضافة إلى ذلك، لقد أظهرنا عن طريق التحليل المناعى أن rAAV-لجنة المساواة العرقية يمكن خروج المغلوب كا V 1.2 بروتين في الدماغ الماوس 18. بعد كل التحليلات السلوكية والفئران ينبغي perfused transcardially مع بارافورمالدهيد 4٪ والمناعية فلوري ينبغي أن يقوم على البروتينات الفلورية الخضراء (GFP). إذا تم استهداف البنى الثنائية، يجب التأكد من صحتها التنسيب الثنائية السليم بواسطة فلوري تلطيخ المناعى (1D الشكل، ممثل استهداف بريدا). إذا كان قد تم بالفعل استهدف منطقة الصحيح، ينبغي أن يكون تلطيخ تصور حصرا في المنطقة المقصودة وليس خارجها. إذا كان واحد أو كل من الحقن هي خارج الهدف، ينبغي أن تكون الفئران بأثر رجعيلاي استبعادها من مجموعة البيانات CPP. استراتيجية أخرى لرؤية دقيقة استهداف مناطق الدماغ الفيروسي النواقل المصابة وتشريح لاحقة من المنطقة المصابة لتحاليل الكيمياء الحيوية، ويمكن تحقيق ذلك باستخدام مصباح يدوي GFP من إلقاء الضوء كما هو موضح في لى وولف (2011) 19.

الشكل 1
الشكل 1A. وmicroinjected الزمني التجريبي للrAAV-لجنة المساواة العرقية حقن مكروي ومكان تفضيل اقتناء، وانقراض وإعادة مراحل الهواء. rAAV-لجنة المساواة العرقية في المنطقة ذات الاهتمام قبل 2-3 أسابيع من بدء الاختبارات السلوكية. يبدأ الهواء تفضيل مكان مع ما قبل الاختبار للتأكد من أي تحيزات الأولي، تليها 3 أيام من تكييف مع الكوكايين (10 مغ / كغ، والملكية الفكرية). بعد أربع ساعات كل دورة تكييف الكوكايين والفئرانيتم التعامل مع المياه المالحة ويقتصر على غرفة المعاكس. ويتم اختبار اليوم التالي الفئران لاقتناء CPP. التدريب انقراض يبدأ 24 ساعة في وقت لاحق، وينطوي على 2 جلسات يومية، التي تكون مفصولة على الأقل 2 ساعة، التي تسمح بالوصول مجانا إلى جهاز كامل. مرة واحدة وقد وصلت الفئران المعيار الانقراض، يتم إعطاؤها حقنة فتيلة من الكوكايين (10 مغ / كغ، والملكية الفكرية) وقضى وقتهم في جميع دوائر الجهاز ويتم تقييم لاختبار لإعادة 1B الكوكايين سلوك التماس. الشكل. نتائج ممثلة من خط الأساس، تم علاج اقتناء والتدريب الانقراض، وإعادة. WT الفئران C57BL/6J مع الكوكايين خلال أيام 2 و 3 و 4 من تكييف. الفئران أظهرت الاستحواذ، وإعادة الكوكايين الانقراض الناجم عن (10 ملغ / كغ IP الكوكايين رئيس). *** P <0.001 مقابل خط الأساس (B)؛ # P <0.05 مقابل الاستحواذ (A). خط الأساس، B؛ اقتناء، A؛ الانقراض، E؛ إعادة التنصيب، R. الشكل 1C. Stereotaxتسليم IC من rAAV-جنة المساواة العرقية، GFP في حلف شمال الأطلسي من الكالسيوم V 1.2 الفئران floxed انخفضت بشكل ملحوظ كا V 1.2 مرنا. متماثل الجينات الكالسيوم V 1.2 الفئران floxed تم microinjected مع التحكم (rAAV-GFP) أو التجريبية (rAAV-جنة المساواة العرقية، GFP) ناقلات فيروسية . بعد تفعيل لجنة المساواة العرقية القصوى، تم التضحية الفئران وكانت معزولة مرنا وتم فحص مستويات التعبير النسبية عبر الكمي تفاعل البلمرة باستخدام كا V 1.2 الاشعال محددة. تسليم التجسيمي من rAAV-جنة المساواة العرقية، GFP في حلف شمال الأطلسي من الكالسيوم V 1.2 الفئران floxed انخفضت بشكل ملحوظ كا V 1.2 مستويات مرنا، مقارنة مع الفئران حقن مع AAV-GFP. † † P <0.001 مقابل rAAV-GFP. 1D الشكل. الخلايا العصبية microinjected مع rAAV-GFP في حلف شمال الأطلسي الماوس. تم microinjected متماثل الجينات الكالسيوم V 1.2 الفئران floxed مع rAAV-GFP للتحقق من وضع الثنائي السليم في حلف شمال الأطلسي. تم perfused الفئران مع 4٪ تم تنفيذ منهاج العمل والمناعية. GFP تلطيخ البرهانقسم التدريب والامتحانات السليم الاستهداف الثنائية من حلف شمال الأطلسي. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

إقليميا وزمنيا محددة الاجتثاث الجيني عبر حقن مكروي التجسيمي من ناقلات فيروسية جنبا إلى جنب مع CPP يتضمن الانقراض ومراحل إعادة يسمح للتحقيق في المساهمات المحددة من الجينات إلى ثلاث مراحل متميزة من السلوك الادمان مثل. في حين خروج المغلوب الشرطي الذي يتحقق الاستفادة من نظام لجنة المساواة العرقية-LoxP التقليدية ينص على المكانية والزمان محدود الاجتثاث الجينات، microinjecting stereotaxically جنة المساواة العرقية، recombinase البكتيري المحور في مناطق الدماغ منفصلة من الفئران floxed تسمح للسيطرة أكثر إحكاما حتى من ومتى وأين يتم طرقت الجين بها. بالإضافة إلى ذلك، هذا تلتف إمكانية حدوث تغيرات التعويضية التي تحدث أثناء التطور، الذي يمثل في بعض الأحيان لالتباين المظهري المحدودة التي لوحظت في الفئران خروج المغلوب. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام مجموعات من الفئران التي تم microinjected في نقاط زمنية مختلفة خلال السلوك يمكن أن تسمح للروابط السببية إلى أن يتم بين التغيير في التعبير الجيني وتغيير في السلوك. IMPOrtantly، ويمكن تطبيق هذه التقنية على عدة نماذج مختلفة السلوكية بما في ذلك الكوكايين الإدارة الذاتية والتوعية الحركية.

ومن المهم أن ننتظر 10-14 يوما على الأقل بعد الجراحات لضمان تفعيل القصوى من لجنة المساواة العرقية recombinase البكتيري المحور حدث 20. يمكن أن تبدأ الاختبارات السلوكية قبل هذه النتيجة في استخدام الفئران مع كمية غير معروفة من شبه القصوى التعبير لجنة المساواة العرقية، مما يجعل النتائج السلوكية يصعب تفسيرها. تفعيل القصوى من نتائج لجنة المساواة العرقية في خروج المغلوب كاملة من الجينات، ولكن هذا يحدث فقط في الخلايا التي هي في الحقيقة مصابة. اعتمادا على حجم وعيار من ناقلات فيروسية، يصاب ما يقرب من 50-70٪ من الخلايا لمنطقة معينة مما أسفر عن مبلغ مماثل من مرنا وخروج المغلوب البروتين الذي يمكن أن يؤدي إلى بعض التعبير الجيني المتبقية (الشكل 1C). ومع ذلك، لقد أثبتنا أن مرنا 50-60٪ هذا نوع من خروج المغلوب كافية لتغيير التعبيرمن توعية النفسي 14. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة مثالية للنماذج السلوكية يعد مرة واحدة كما يحدث تنشيط لجنة المساواة العرقية في الجسم الحي، وحرية التعبير وخروج المغلوب الجين المقابل يستمر لمدة 6 أشهر على الأقل 21.

إذا كان أحد يهتم في دراسة دور الجينات على مدى فترة من الوقت أكثر منفصلة ومع ذلك، لم يكن ذلك ممكنا مع هذا أسلوب معين. للتعبير على المدى القصير، والهربس البسيط الفيروسي (HSV) ناقلات يمكن استخدامها، والتي تصيب الخلايا العصبية بشكل تفضيلي 22. مقارنة التعبير rAAV من لجنة المساواة العرقية recombinase البكتيري المحور، التي استمرت لفترات أطول كما لم يتم إسكات المروج بعد أيام أو أسابيع في الجسم الحي 23، ويفضل ناقلات HSV للتعبير عابر لأنها تعبر في الجسم الحي لعدة أيام. ناقلات HSV هي أيضا مفيدة لأنها تثبت كفاءة تنبيغ واسعة وأن المساعد أسهم خالية من الفيروس موجود 22. وعلاوة على ذلك، يمكن للناقلات HSV أيضا عن لجنة المساواة العرقية RECombinase وتوسط في استئصال متواليات floxed على حد سواء في الثقافة والحية 24. ومع ذلك، فقد تم العثور على السمسة في بعض الأحيان.

يمكن أن تستهدف تقريبا أي منطقة في الدماغ باستخدام هذه التقنية حقن مكروي. عند محاولة لاستهداف مناطق فرعية أصغر داخل منطقة أوسع، واحدة قد تحتاج إلى تحسين كمية النواقل الفيروسية المستخدمة. على سبيل المثال، ونحن microinjected 0.5 ميكرولتر من rAAV-جنة المساواة العرقية، GFP لاستهداف حلف شمال الأطلسي والمنطقة الغشائية البطنية (VTA) 14، في حين عند استهداف البنى أكبر مثل الحصين والقشرة، وتستخدم أحمد وزملاؤه 20 0.8 ميكرولتر من rAAV-لجنة المساواة العرقية. بدلا من ذلك، واستكشاف مختلف خيارات النمط المصلي أن كل انتشرت الفرق وخصائص العدوى (انظر تشوي وآخرون (2005) 25 للمراجعة) يمكن أن تساعد في استهداف منطقة أصغر، أكثر تحديدا. على العكس، إذا محاولة استهداف منطقة أكبر، يمكن للمرء أن زيادة حجم ناقلات فيروسية microinjected. هذا أناو أكثر فعالية من استخدام أعلى التتر ناقلات لأنها من المرجح تسفر الإصابات إضافية لكل خلية في مقابل عدد أكبر من مجموع الخلايا المصابة 22. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن أداء الحقن متعددة داخل المنطقة، أو عبر مناطق متعددة، لتصيب أكثر فعالية مساحة أكبر 26.

استخدام ناقلات rAAV هو أيضا من المفيد مقارنة مع النواقل الفيروسية الأخرى التي يتم استخدامها لفحص وظائف الدماغ والمرض. على وجه التحديد، وثبت ناقلات الفيروسة الغدانية التقليدية إشكالية في أن اقنعوا الاستجابات الالتهابية الحادة، في حين ناقلات أخرى مثل الفيروسات القهقرية وlentiviruses يمكن أن تنطوي على مشاكل مع الطفرات غرزي. rAAV هو البارفو حميدة وليس هناك مرض المعروفة المرتبطة عدوى rAAV. وعلاوة على ذلك، على عكس ناقلات فيروسية أخرى، تنبيغ مع rAAV يحدث دون التعبير عن البروتينات الفيروسية AAV الأصلي 27، مما يجعل الآثار الثانوية على الخلايا المستهدفة أقل بكثير من القلق.يمكن أن تنتج نواقل rAAV في التتر عالية، ويمكن تنبيغ الخلايا العصبية بعد الإنقسامية في الدماغ بطريقة المترجمة مكانيا للغاية 21،28. وعلاوة على ذلك، يجري حاليا إنشاء ناقلات rAAV التي يمكن أن تستهدف أنواع فرعية محددة من الخلايا العصبية في الدماغ الماوس 29 ونظم التعبير rAAV لجنة المساواة العرقية التي تعتمد هي أيضا أصبحت أكثر تستخدم على نطاق واسع (انظر تشانغ وآخرون (2010) 30 للمراجعة).

في ملخص، الكوكايين CPP بمثابة أداة سلوكية بسيطة لكنها مفيدة لدراسة الكوكايين التعلم السياقية ذات الصلة في الحصول، انقراض، وإعادة من الكوكايين في سلوك التماس. مزيج من الاستفادة rAAV معربا عن لجنة المساواة العرقية recombinase البكتيري المحور في الفئران تحمل أليل floxed مع CPP يوفر استراتيجية قوية لاستكشاف دور الجينات المستهدفة في مناطق محددة في الدماغ التي تتوسط الكوكايين تسعى السلوك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر انى لي ومورين بيرن لمساعدتهم في تأسيس الهواء بروتوكول تفضيل مكان الموسعة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Conditioned place preference activity chambers Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA MED-CPP-MS
Stereotaxic alignment system for mouse David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA model 900
Hamilton syringes Hamilton Company, Reno, Nevada, USA 7634-01
rAAV2-Cre-GFP Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA 7016
rAAV2-GFP Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA 7004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nestler, E. J. Molecular neurobiology of addiction. American Journal on Addictions. 10 (3), (2001).
  2. Thomas, M. J., Kalivas, P. W., Shaham, Y. Neuroplasticity in the mesolimbic dopamine system and cocaine addiction. British Journal of Pharmacology. 154 (2), (2008).
  3. Robinson, T. E., Browman, K. E., Crombag, H. S., Badiani, A. Modulation of the induction or expression of psychostimulant sensitization by the circumstances surrounding drug administration. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (2), (1998).
  4. Tzschentke, T. M. Measuring reward with the conditioned place preference (CPP) paradigm: update of the last decade. Addiction Biology. 12 (3-4), (2007).
  5. Mueller, D., Stewart, J. Cocaine-induced conditioned place preference: reinstatement by priming injections of cocaine after extinction. Behavioural Brain Research. 115 (1), (2000).
  6. Itzhak, Y., Martin, J. L. Cocaine-induced conditioned place preference in mice: Induction, extinction and reinstatement by related psychostimulants. Neuropsychopharmacology. 26 (1), (2002).
  7. Kreibich, A. S., Blendy, J. A. cAMP response element-binding protein is required for stress but not cocaine-induced reinstatement. Journal of Neuroscience. 24 (30), (2004).
  8. Obrien, C. P., Childress, A. R., McLellan, T., Ehrman, R. Integrating systematic cue exposure with standard treatment in recovering drug dependent patients. Addictive Behaviors. 15 (4), (1990).
  9. O'Brien, C. P., Childress, A. R., McLellan, A. T., Ehrman, R. A learning model of addiction. Research publications - Association for Research in Nervous and Mental Disease. 70, (1992).
  10. Stewart, J. Psychological and neural mechanisms of relapse. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 363 (1507), (2008).
  11. Bueler, H. Adeno associated viral vectors for gene transfer and gene therapy. Biological Chemistry. 380, (1999).
  12. Xiao, X., Li, J., McCown, T. J., Samulski, R. J. Gene transfer by adeno-associated virus vectors into the central nervous system. Experimental Neurology. 144 (1), (1997).
  13. Alexander, I. E., Russell, D. W., Spence, A. M., Miller, A. D. Effects of gamma irradiation on the transduction of dividing and nondividing cells in brain and muscle of rats by adeno-associated virus vectors. Human Gene Therapy. 7 (7), (1996).
  14. Schierberl, K., Hao, J., Tropea, T. F., Ra, S., Giordano, T. P., Xu, Q., Garraway, S. M., Hofmann, F., Moosmang, S., Striessnig, J., Inturrisi, C. E., Rajadhyaksha, A. M. Ca(v)1.2 L-Type Ca2+ Channels Mediate Cocaine-Induced GluA1 Trafficking in the Nucleus Accumbens, a Long-Term Adaptation Dependent on Ventral Tegmental Area Ca(v)1.3 Channels. Journal of Neuroscience. 31 (38), (2011).
  15. Schierberl, K., Giordano, T., Satpute, S., Hao, J., Kaur, G., Hofmann, F., Moosmang, S., Striessnig, J., Rajadhyaksha, A. Ca(v)1.3 L-type Ca2+ channels mediate long-term adaptation in dopamine D2L-mediated GluA1 trafficking in the dorsal striatum following cocaine exposure. Channels. 6 (1), 11-17 (2012).
  16. Nestler, E. J., Bergson, C. M., Gultart, X., Hope, B. T. Regulation of neural gene expression in opiate and cocaine addiction. NIDA Research Monograph. 125, (1993).
  17. Hyman, S. E., Malenka, R. C. Addiction and the brain: The neurobiology of compulsion and its persistence. Nature Reviews Neuroscience. 2 (10), (2001).
  18. Lee, A. S., Ra, S., Rajadhyaksha, A. M., Britt, J. K., De Jesus-Cortes, H., Gonzales, K. L., Lee, A., Moosmang, S., Hofmann, F., Pieper, A. A., Rajadhyaksha, A. M. Forebrain elimination of cacna1c mediates anxiety-like behavior in mice. Molecular Psychiatry. 17 (11), (2012).
  19. Li, X., Wolf, M. E. Visualization of virus-infected brain regions using a GFP-illuminating flashlight enables accurate and rapid dissection for biochemical analysis. Journal of Neuroscience Methods. 201 (1), 177-179 (2011).
  20. Ahmed, B. Y., Chakravarthy, S., Eggers, R., Hermens, W., Zhang, J. Y., Niclou, S. P., Levelt, C., Sablitzky, F., Anderson, P. N., Lieberman, A. R., Verhaagen, J. Efficient delivery of Cre-recombinase to neurons in vivo and stable transduction of neurons using adeno-associated and lentiviral vectors - art. no. 5. BMC Neuroscience. 5, (2004).
  21. Kaspar, B. K., Vissel, B., Bengoechea, T., Crone, S., Randolph-Moore, L., Muller, R., Brandon, E. P., Schaffer, D., Verma, I. M., Lee, K. F., Heinemann, S. F., Gage, F. H. Adeno-associated virus effectively mediates conditional gene modification in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2320-2325 (2002).
  22. Neve, R. L., Neve, K. A., Nestler, E. J., Carlezon, W. A. Use of herpes virus amplicon vectors to study brain disorders. Biotechniques. 39 (3), 9 (2005).
  23. Pohl, M., Braz, J. Gene therapy of pain: emerging strategies and future directions. European Journal of Pharmacology. 429 (1-3), (2001).
  24. Rinaldi, A., Marshall, K. R., Preston, C. M. A non-cytotoxic herpes simplex virus vector which expresses Cre recombinase directs efficient site specific recombination. Virus Research. 65 (1), (1999).
  25. Choi, V. W., McCarty, D. M., Samulski, R. J. AAV hybrid serotypes: Improved vectors for gene delivery. Current Gene Therapy. 5 (3), (2005).
  26. Passini, M. A., Dodge, J. C., Bu, J., Yang, W., Zhao, Q., Sondhi, D., Hackett, N. R., Kaminsky, S. M., Mao, Q. W., Shihabuddin, L. S., Cheng, S. H., Sleat, D. E., Stewart, G. R., Davidson, B. L., Lobel, P., Crystal, R. G. Intracranial delivery of CLN2 reduces brain pathology in a mouse model of classical late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis. Journal of Neuroscience. 26 (5), (2006).
  27. Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses - normal integration does not require viral gene-expression. Journal of Virology. 63 (9), (1989).
  28. Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., Omalley, K. L., During, M. J. Long-term gene-expression and phenotypic correction using adenoassociated virus vectors in the mammalian brain. Nature Genetics. 8 (2), (1994).
  29. Johansen, J. P., Hamanaka, H., Monfils, M. H., Behnia, R., Deisseroth, K., Blair, H. T., LeDoux, J. E. Optical activation of lateral amygdala pyramidal cells instructs associative fear learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (28), (2010).
  30. Zhang, F., Gradinaru, V., Adamantidis, A. R., Durand, R., Airan, R. D., de Lecea, L., Deisseroth, K. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nature Protocols. 5 (3), (2010).

Tags

السلوك، العدد 77، علم الأعصاب، علم الأعصاب، علم التشريح، علم وظائف الأعضاء، الهندسة الطبية، الطب، الصيدلة، الحيوانات، معدلة وراثيا، والسلوك، والحيوان، المخدرات سلوك التماس، علم النفس الفسيولوجي والسلوك وآليات السلوك، ناقلات فيروسية، جراحة التجسيمي، حقن مكروي، مشروطة مكان تفضيل، والماوس، والسلوك، علم الأعصاب، انقراض، إعادة الكوكايين التي يسببها، نموذج حيواني
حقن مكروي التجسيمي من ناقلات فيروسية وإذ تعرب عن لجنة المساواة العرقية recombinase البكتيري المحور إلى دراسة دور الجينات المستهدفة في الكوكايين مكيفة مكان ميول
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A.… More

Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference. J. Vis. Exp. (77), e50600, doi:10.3791/50600 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter