Summary
Cet article décrit comment micro-injection de vecteurs viraux dans le cerveau de la souris, puis tester dans un endroit paradigme de préférence conditionné qui comprend une phase d'acquisition, l'extinction et la réintégration.
Abstract
Microinjection viraux adéno-associé vecteurs recombinants (rAAV) exprimant la recombinase Cre dans les régions du cerveau de souris distinctes sélectivement les gènes de finale de l'intérêt permettent une régulation temporelle et régionale spécifique de délétion du gène, par rapport aux méthodes existantes. Alors que la suppression conditionnelle peut également être obtenue par des souris d'accouplement qui expriment la recombinase Cre sous le contrôle de promoteurs de gènes spécifiques avec des souris porteuses d'un gène floxé, la micro-injection stéréotaxique permet de cibler des zones discrètes du cerveau à des moments déterminés expérimentateur d'intérêt. Dans le cadre de la cocaïne préférence de place conditionnée, et d'autres paradigmes comportementaux de la cocaïne comme l'auto-administration ou de sensibilisation psychomoteur qui peuvent impliquer phases de réintégration retrait, l'extinction et / ou, cette technique est particulièrement utile pour explorer la contribution unique de gènes cibles de ces distinct phases de modèles comportementaux de la plasticité induite par la cocaïne. Plus précisément,cette technique permet l'ablation sélective des gènes cibles lors des phases distinctes d'un comportement à tester leur contribution au comportement dans le temps. En fin de compte, cette compréhension permet de thérapies plus ciblées qui sont mieux à même de s'attaquer aux facteurs de risque les plus puissants qui se présentent au cours de chaque phase du comportement addictif.
Introduction
La cocaïne est un psychostimulant très renfort. Après une exposition répétée, plusieurs adaptations moléculaires et cellulaires se produisent en récompense pertinente circuits du cerveau qui sont censés entraîner compulsif comportement cherchant le médicament, ce qui incite les taux élevés de rechute qui posent un sérieux problème clinique 1. La cocaïne exerce ces effets comportementaux durables en régulant l'expression des gènes. Pour étudier les adaptations qui découlent de l'utilisation chronique de la cocaïne, des modèles de rongeurs précliniques ont été utilisés. Un tel modèle est la préférence lieu (RPC) paradigme conditionné. Ce modèle implique le développement d'une association entre un environnement appris précédemment neutre et les propriétés gratifiantes de cocaïne. Après plusieurs paires de cocaïne d'une chambre particulière, les animaux sont autorisés à explorer librement les environnements de cocaïne appariés et non appariés cocaïne et s'ils préfèrent le compartiment drogue jumelés, ils auraient acquis une plac induite par la cocaïnee préférence. Par ailleurs, après une période de formation d'extinction, ce paradigme peut être utilisé pour étudier la réintégration du contexte spécifique de cocaïne comportement de recherche.
Par rapport à d'autres modèles de comportement des conduites addictives-like, comme la sensibilisation psychomoteur, qui est utilisé pour étudier à long terme induite par la cocaïne et de la plasticité comportementale moléculaire 2,3 et l'auto-administration (SA), qui est pensé pour plus de précision imiter dépendance -comme le comportement constaté chez les humains, le paradigme du RPC est une procédure simple pour étudier la cocaïne apprentissage contextuel 4. Protocoles RPC peuvent être facilement étendus pour inclure les phases de remise en extinction et, de manière similaire à SA, qui permettent d'enquête sur les mécanismes qui sous-tendent le besoin de drogue et la rechute 5-7 et qui sont soupçonnés de récapituler les aspects de ce qui se passe chez l'homme comportement cherchant le médicament et médicament - et cue-induite rechute 8-10.
Un mécanisme qui sous-tend l'induite par la cocaïne plasticité comportementale qui est caractéristique de chacune des phases distinctes du RPC, y compris l'acquisition, extinction, et la réintégration, est l'activation des signatures uniques de l'expression des gènes dans les différentes régions du cerveau. Pour tester directement les gènes dans les régions du cerveau récompense pertinents médiation cocaïne induit des changements de comportement, il est utile d'être capable de manipuler de manière sélective d'une manière spécifique à chaque région. Une façon d'y parvenir est de micro-injection des vecteurs recombinants ADENOASSOCIE virales (rAAV) qui expriment la recombinase Cre en utilisant la chirurgie stéréotaxique, dans des zones distinctes du cerveau de souris qui ont des gènes cibles flanqué par des sites loxP (souris floxés). Cette méthode permet un contrôle temporel et régional très précise où et quand les gènes sont ablation, dans les deux neurones division et non de division, sans induire des réponses immunitaires 11-13. Ce niveau de contrôle représente un avantage important sur la technologie Cre-loxP traditionnelle de la reproduction des souris floxés wvec des souris exprimant la recombinase Cre sous le contrôle d'un promoteur du gène endogène, en ce que le timing et la distribution de délétion du gène peuvent être plus étroitement réglementés. En outre, viral knock-out du gène vecteur médiée contourne effets compensatoires de développement potentiels qui peuvent survenir en utilisant des stratégies de finale traditionnels.
En plus de la cocaïne RPC, qui est décrit ici, la micro-injection de rAAV-Cre dans le cerveau de souris floxés d'évaluer le rôle des gènes spécifiques peuvent être appliquées ubiquitaire de paradigmes comportementaux qui impliquent des phases distinctes, y compris l'auto-administration et de sensibilisation psychomoteur. Par exemple, notre laboratoire a utilisé la technologie rAAV-Cre pour étudier le rôle de Ca v 1.2 L de type canaux Ca 2 + de la cocaïne psychomoteur sensibilisation 14. Plus précisément, VAAr-Cre a été micro dans le noyau accumbens (NAC) de souris avec le gène codant Ca v 1.2 floxé, pour démontrer que Ca v 14,15. Cependant, la stratégie VAAr-Cre ne peut pas être utilisé si des souris avec un gène floxé d'intérêt n'existent pas, comme cela a été notre expérience lors de l'évaluation du rôle de Ca v 1.3 L de type canaux Ca 2 + dans la sensibilisation psychomoteur. Par conséquent, une limitation de l'utilisation de rAAV-Cre se présente si les souris conditionnelles n'existent pas pour un gène d'intérêt particulier. Cependant, rAAVs qui siRNA Express peut être utilisé à des gènes cibles de knockdown, comme nous l'avons fait pour examiner le rôle de Ca v 1.3 canaux 14,15.
Microinjection VAAr-Cre dans des régions discrètes du cerveau de souris floxés puis de les tester dans le paradigme du RPC permet d'enquête sur les gènes spécifiques qui interviennent dans les différentes phases du comportement addictif-comme et où ils agissent. L'utilisation de ce paradigme a contribué à notre compréhension de la façon dont l'administration répétée de cocaïne en essence détourne le brains circuit de la récompense provoquant des changements inadaptés dans les voies de transduction du signal moléculaire et l'expression des gènes qui conduisent à l'état de dépendance 1,16,17.
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Protocol
Toutes les procédures sont menées en conformité avec le Weill Cornell Medical College Institutional Animal Care et les règles du Comité d'utilisation.
1. Préparation et installation de livraison stéréotaxique de vecteurs viraux
- Si un instrument, écouvillon stérile, ou porter des gants stériles main est contaminée en entrant en contact avec une surface non stérile, jeter ou re-stériliser l'instrument en utilisant un stérilisateur à billes chaud, jeter l'écouvillon ou changer pour de nouveaux gants stériles.
- Placez une cage de la souris avec la literie sur un bloc de chaleur pour réchauffer pour la récupération post-opératoire.
- Mettre en place un rasoir électrique pour tête de rasage et de l'éthanol et de l'iode pour stériliser le cuir chevelu.
- Essuyez barres d'oreilles et la bouche maintien de la stereotax avec 70% d'éthanol.
- L'utilisation d'un 5 pi seringue Hamilton, dresser 5 pi du vecteur viral (1 x 10 6 particules virales / pl) et mis en place dans le porte-seringue sur stereotax.
- Coussin chauffant à micro-onde ou de tourner sur un bloc électriqueème place sur stereotax. Couvrir avec un tampon absorbant propre pour réduire le risque de brûlures. Surveillez la température du corps de la souris (entre 97 à 99,5 ° F) fréquemment tout au long de la procédure.
- Injecter souris (pesant entre 22-35 g) avec un mélange de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (20 mg / kg). Une fois que la souris est anesthésiée, extrémité de la queue de pincement pour vérifier les réflexes de la souris et notez tout mouvement ou une réponse à ce que la souris est correctement anesthésié.
- Raser la tête entre les oreilles et les yeux.
- Nettoyez la tête rasée avec de l'éthanol et de l'iode applicateurs de coton stériles alternatif.
- Transfert souris pour coussin chauffant sur stereotax.
2. La micro-injection stéréotaxique de vecteurs viraux
- Porter des gants stériles tout au long de l'opération. Si les gants sont contaminés à tout moment en touchant des surfaces non stériles, changer de gants.
- Zéro barre des dents et des écailles de la barre de l'oreille.
- Réglez les dents dans la barre de dent.
- Visser museau. Si tortillant ou moustache mouvementment est à noter, à tout moment, d'administrer une dose de rappel ip (~ 0,05 cm) d'un mélange de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (20 mg / kg).
- Visser dans les bars de l'oreille.
- Lubrifier les yeux avec PuraLube.
- Couper le cuir chevelu ouvert à tout juste derrière les oreilles avec un scalpel.
- Placez les clips de bouledogue sur les coins du cuir chevelu à peler la peau loin de crâne. Bregma et lambda doit être facilement visible.
- Assurez-vous de suture bregma au lambda est aligné droite. Si la suture est le positionnement réajuster tordu de la tête.
- Assurez-vous que tous les paramètres de la stereotax sont mis à zéro.
- Mettez pointe de l'aiguille en place au bregma.
- Mesurez toutes les coordonnées pour les deux bregma et lambda. Cela comprend les coordonnées dorsale / ventrale, interne / externe et antérieur / postérieure.
- Ajuster la tête jusqu'à ce que les coordonnées ventrales pour bregma et lambda est inférieur à 0,02 mm les uns des autres.
- Une fois aligné, à partir de bregma aller dedans sur les coordonnées interne / externe (M / L). S'assurerles côtés gauche et droit sont alignées à l'intérieur de 0,02 mm les uns des autres.
- Extrémité de l'aiguille Re-centre sur bregma et de là déplacer dans la direction antérieure / postérieure (P / A) pour la coordonnée antérieure / postérieure désirée.
- Si nécessaire, aiguille angle dans un sens et s'assurer que le stereotax est verrouillé. Allez vers la gauche M / L de coordonnées (+ / - 1,52)
- Mesurer la position ventrale de la partie supérieure du crâne à utiliser comme référence après le trou de forage est foré.
- Forer un trou de forage utilisant un trépan de forage stérile à la coordonnée désirée. Vérifiez que l'aiguille ne peut entrer sans interruption à travers le crâne.
- Abaissez l'aiguille à la coordonnée ventral souhaité.
- Une fois la coordonnée est atteinte, trempette 0.015 mm en dessous de ~ 10 sec pour créer une petite poche pour le vecteur viral.
- Injecter le volume désiré de vecteur viral à un taux d'environ 0,1 ul / min. Attendre 3 minutes pour vecteur viral pour diffuser complètement. Soulever le nez aiguille 0,015 mm et d'attendre 2 min de plus.
- Plonger l'aiguille (si cela injections inclinées) dans la direction opposée. Encore une fois, enregistrer la position ventrale comme une référence pour le sommet du crâne.
- Répétez les mêmes étapes que sur la première face à injecter vecteur viral sur le côté opposé (si cela injections bilatérales).
- Appliquer de la cire d'os pour les deux trous de les sceller avec l'extrémité en bois d'une pointe d'applicateur de coton stérile.
- Suturer le cuir chevelu.
- Appliquer bloc du nerf de la zone blessée.
- Retirer souris de stereotax et le placer dans la cage réchauffé sur le bloc thermique pour récupérer pendant 45 min.
- Surveiller les signes de la douleur, y compris: diminution de l'activité globale ou agitation, diminution de la nourriture et la consommation d'eau ou d'augmentation de vocalisation. La buprénorphine (0,05 à 0,2 mg / kg) peut être administré deux fois par jour pendant une semaine si nécessaire pour la douleur. Alternatives acceptables: la mépéridine (20-60 mg / kg), la pentazocine (10 mg / kg), nalbuphine (4-8 mg / kg).
3. Préférence de place conditionnée: Acquisition, Extinction, et Rétablissement
- Placez la souris dans la chambre centrale d'un appareil de préférence lieu à trois chambres (Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA) pour une période d'habituation 60 sec de portes à guillotine fermés.
- Après accoutumance, portes à guillotine ouverts et permettre souris exploration libre des 3 chambres pour 1.200 sec, le temps passé dans chaque chambre étant enregistrées en utilisant le logiciel MedPC IV (Med Associates, Inc.).
- Attribuer des souris à des chambres de conditionnement en fonction de leur performance lors du pré-test. En utilisant une conception, l'administration de médicaments paire biaisée pendant les suivantes 3 jours avec le compartiment qui était moins pratique au cours de la pré-test de référence.
- Durant les 3 prochains jours de conditionnement, d'injecter des souris avec de la cocaïne (10 mg / kg; ip) au cours de la séance du matin et les enfermer dans leur chambre attribué à 1,200 sec immédiatement après l'injection. Retour souris dans leur cage d'origine après la séance. Après 4 h, injecter des souris avec une solution saline (0,01 ml / gpoids corporel) et les confiner dans la chambre opposée à la session de 1200 sec l'après-midi.
- Pour tester l'acquisition, placez la souris dans la chambre centrale de portes à guillotine fermées pour une période d'habituation 60 sec. Portes à guillotine s'ouvrir et laisser le libre exploration pour 1200 sec, le temps passé dans toutes les chambres enregistrées par le logiciel MedPC IV (Med Associates, Inc.). Calculer préférence en soustrayant la quantité de temps passé dans la chambre saline apparié à partir de la quantité de temps passé dans la chambre de cocaïne appariés.
- Pour éteindre la préférence de place, exposer des souris à deux séances de 20 min de l'exploration libre tous les jours dans le même appareil, séparés par au moins 2 heures, en commençant 24 heures après le test d'acquisition. Le temps passé dans toutes les chambres devrait à nouveau être enregistrée et l'ampleur de l'initiale du RPC devrait être comparée à celle de chaque séance d'extinction.
- Déterminer si les souris ont éteint la préférence induite par le médicament en évaluant si la préférence pour un pied d'égalitéchambre particulière sur deux jours consécutifs extinction est nettement inférieur à celui du score de préférence d'acquisition.
- Rétablir souris avec une dose d'amorçage de la cocaïne (5 ou 10 mg / kg; ip) et ré-exposer à l'appareil permettant la libre exploration et d'enregistrer le temps passé dans chaque compartiment.
- Administrer la solution de l'euthanasie Euthasol (150 mg / kg). Transcardiaque perfuser des souris avec du paraformaldéhyde 4% (PFA) et d'effectuer un examen histologique de valider le placement de micro-injection correcte.
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Representative Results
RPC
Après l'exécution RPC sur des souris microinjectés, il faut vérifier que la cohorte de contrôle-injecté (rAAV-GFP) chez la souris ont normalement acquis préférence pour la chambre drogue apparié (Figure 1A, 1B). Les souris sont considérés comme ayant acquis préférence pour une chambre particulière lorsque préférence de cocaïne (temps passé dans la chambre de la cocaïne-appareillé moins de temps passé dans la chambre saline-apparié) est significativement plus élevée par rapport au score de préférence de base (figure 1B, A contre B) . Si, en tant que cohorte, les souris contrôle injectées ne montrent une préférence pour la chambre de cocaïne appariés, ou montrent une aversion, le placement doit être vérifiée immédiatement par histologie (voir paragraphe VAAr injections) et des souris avec des mauvais placement doit être jeté.
Si la préférence a été normalement acquis par la cohorte de contrôle à injection, on peut ensuite étendre le paradigme d'extinction de début (figure 1A (figure 1B, E3, E4, E5 vs A). A cette époque, on peut rétablir un premier médicament (figure 1A, 1B). Si le score de préférence après l'administration du médicament principal est statistiquement indiscernable de celle de l'acquisition, alors que cette cohorte est dit avoir rétabli la préférence induite par le médicament pour la chambre drogue appariées (figure 1B, R vs A).
VAAr microinjections
Avant de poursuivre la stratégie expérimentale VAAr-Cre sein de tout paradigme comportemental il faut vérifier que VAAr-Cre a en effet éliminé le gène d'intérêt chez les souris microinjectés par qPCR (figure 1C) et / ou Western blot ou analyse immunohistochimique 18 </ Sup>. Par exemple, après microinjection de rAAV-Cre-GFP dans le CNA de souris qui avaient la L-calcique de type canal isoforme Ca v 1.2 floxé, VAAr-CRE poinçons injectés montrent une diminution significative de l'expression des gènes (figure 1C). En outre, nous avons montré par analyse immunohistochimique qui VAAr-Cre peut KO Ca v 1.2 protéine dans le cerveau de souris 18. Après toutes les analyses comportementales, les souris doivent être transcardiaque perfusés avec du paraformaldéhyde 4% et immunohistochimie fluorescente doit être effectuée pour la protéine fluorescente verte (GFP). Si les structures bilatérales ont été ciblés, le placement bilatéral approprié doit être vérifiée par coloration immunohistochimique fluorescent (figure 1D, représentant le ciblage de la NAC). Si la bonne zone a en effet été la cible, la coloration doit être visualisées exclusivement dans la région envisagée et non en dehors de celui-ci. Si l'un ou les deux injections sont hors cible, les souris doivent être rétroactifly exclue de l'ensemble de données RPC. Une autre stratégie pour la visualisation d'un ciblage précis des régions du cerveau vecteurs infectés virales et la dissection subséquente de la zone infectée pour les analyses biochimiques, peut être réalisé en utilisant une lampe de poche GFP-éclairage comme décrit dans Li et Wolf (2011) 19.
Figure 1A. Timeline expérimentale de préférence de place acquisition, l'extinction et le rétablissement phases climatisées VAAr-Cre microinjection et. VAAr-Cre est microinjecté dans la région d'intérêt 2-3 semaines avant le début des tests comportementaux. Préférence de place conditionnée commence par un pré-test pour vérifier les préjugés initiaux, suivis de 3 jours de conditionnement de la cocaïne (10 mg / kg, ip). Quatre heures après chaque séance de conditionnement de la cocaïne, les sourissont traitées avec une solution saline et confiné à la chambre opposée. Les souris de jour suivants sont testés pour l'acquisition d'un CPP. formation d'extinction commence 24 heures plus tard et implique 2 séances quotidiennes, qui sont séparées par au moins 2 heures, qui permettent un accès gratuit à l'ensemble du dispositif. Une fois les souris ont atteint le critère d'extinction, ils sont administrés par injection d'amorçage de la cocaïne (10 mg / kg, ip) et leur temps passé dans toutes les chambres de l'appareil est évalué pour tester le rétablissement de la cocaïne comportement de recherche. Figure 1B. Les résultats représentatifs de référence, l'acquisition, la formation d'extinction, et la réintégration. WT C57BL/6J souris ont été traitées avec de la cocaïne durant les jours 2, 3 et 4 de la climatisation. Les souris exposées acquisition, l'extinction et le rétablissement induite par la cocaïne (10 mg / kg ip cocaïne prime). *** P <0,001 par rapport au niveau de référence (B); # p <0,05 par rapport à l'acquisition (A). Baseline, B; Acquisition, A; Extinction, E; Rétablissement, R. figure 1C. Stereotaxlivraison ic de rAAV-Cre-GFP dans le CNA Ca v 1.2 souris floxés diminué de manière significative Ca v 1.2 ARNm. homozygotes Ca v 1.2 souris floxés ont été micro-injectés avec contrôle (rAAV-GFP) ou expérimentale (rAAV-Cre-GFP) des vecteurs viraux . Après l'activation Cre maximale, les souris ont été sacrifiées et l'ARNm a été isolé et les niveaux relatifs d'expression ont été examinés par réaction en chaîne par polymérase quantitative utilisant Ca v 1.2 amorces spécifiques. Livraison stéréotaxique de rAAV-Cre-GFP dans le CNA Ca v 1.2 souris floxés diminué de manière significative Ca v 1.2 niveaux d'ARNm, par rapport à des souris injectées avec AAV-GFP. 1D † † p <0,001 par rapport VAAr-GFP. Figure. Neurones microinjectés avec rAAV-GFP dans le CNA souris. Homozygotes Ca v 1.2 souris floxés ont été micro-injectés avec rAAV-GFP pour vérifier placement bilatéral approprié dans le CNA. Les souris ont été perfusés avec 4% PFA et immunohistochimie a été réalisée. GFP coloration démonstrationTES ciblage bilatéral approprié du CNA. Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Discussion
Régional et l'ablation d'un gène spécifique temporellement par micro-injection stéréotaxique de vecteurs viraux associés avec le RPC qui comporte des phases de remise en extinction et de permettre de retrouver les contributions spécifiques des gènes à trois phases distinctes de comportement addictif-like. Alors KO conditionnel qui est réalisé en utilisant le système Cre-loxP traditionnelle prévoit spatio-temporellement ablation génique limité, micro-injection stéréotaxique Cre-recombinase dans des zones discrètes du cerveau de souris floxés permet un contrôle encore plus serré de quand et où un gène est assommé. En outre, cette contourne la possibilité de changements compensatoires se produisent au cours du développement, ce qui explique parfois des variations phénotypiques limitée observée chez les souris knock-out. En outre, en utilisant des cohortes de souris qui ont été micro-injectés à différents moments pendant la conduite peut permettre de liens de causalité à faire entre un changement dans l'expression des gènes et un changement de comportement. Importantly, cette technique peut être appliquée à plusieurs différents paradigmes comportementaux de cocaïne, y compris l'auto-administration et de sensibilisation psychomoteur.
Il est important d'attendre au moins 10-14 jours après la chirurgie afin de s'assurer que l'activation maximale de la recombinase Cre a eu lieu 20. Prend tests comportementaux avant ce qui peut entraîner l'utilisation de souris avec une quantité inconnue d'expression Cre sous-maximal, ce qui rend les résultats difficiles à interpréter le comportement. Activation maximale de la CRE résultats dans KO complète d'un gène, mais cela ne se produit que dans les cellules qui sont en fait infectés. Selon le volume et le titre du vecteur viral, environ 50-70% des cellules sont infectées pour une région donnée résultant de la quantité correspondante d'ARNm et de protéine KO qui peut conduire à une certaine expression du gène résiduelle (figure 1C). Cependant, nous avons démontré que l'ARNm de 50-60% ce type de coup de grâce est suffisante pour altérer l'expressionde sensibilisation psychomoteur 14. De plus, cette méthode est idéale pour paradigmes plus comportementales, car une fois l'activation Cre se produit in vivo, l'expression et le knock-out du gène correspondant dure au moins 6 mois 21.
Si l'on s'intéresse à l'examen du rôle d'un gène sur une période plus discrète du temps cependant, ce n'est pas possible avec cette méthode particulière. Pour l'expression à court terme, l'herpès simplex virus vecteurs (HSV) peuvent être utilisés, qui infectent préférentiellement les neurones 22. Par rapport à l'expression rAAV de la recombinase Cre, qui persiste pendant des périodes plus longues que le promoteur n'est pas réduite au silence après quelques jours ou semaines in vivo 23, vecteurs HSV sont préférés pour l'expression transitoire car ils expriment in vivo pendant des jours. Vecteurs HSV sont également avantageux en ce qu'ils démontrent large efficacité de transduction et que les stocks exempts de virus helper exister 22. En outre, les vecteurs HSV peut également exprimer Cre recombinase et arbitrer l'excision des séquences floxés la fois dans la culture et in vivo 24. Cependant, la cytotoxicité occasionnelle a été trouvé.
Presque n'importe quelle région du cerveau peut être ciblé en utilisant cette technique de micro-injection. Lorsque vous essayez de cibler les petites sous-régions au sein d'une région plus vaste, on peut avoir besoin pour optimiser la quantité de vecteur viral utilisé. Par exemple, nous microinjectés 0,5 pi de rAAV-Cre-GFP pour cibler le CNA et l'aire tegmentale ventrale (VTA) 14, alors que lors du ciblage de grandes structures telles que l'hippocampe et le cortex, Ahmed et ses collègues ont utilisé 20 0,8 l de rAAV-Cre. Alternativement, en explorant diverses options de sérotype qui ont chacun propagation différentiel et les propriétés de l'infectiosité (voir Choi et al. (2005) 25 pour l'examen) peut aider à cibler une zone plus petite et plus défini. Inversement, si la tentative de cibler une région plus vaste, on peut augmenter le volume de vecteur viral microinjecté. Ce que jes plus efficace que d'utiliser des titres de vecteur plus que probable qu'ils donnent infections supplémentaires par cellule, par opposition à un plus grand nombre de cellules infectées au total 22. En outre, on peut effectuer des injections multiples au sein d'une région, ou dans plusieurs régions, d'infecter plus efficacement une plus grande zone 26.
L'utilisation de vecteurs rAAV est également avantageux par rapport aux autres vecteurs viraux qui sont utilisés pour examiner le fonctionnement du cerveau et la maladie. Plus précisément, les vecteurs adénoviraux traditionnelles se sont révélées problématiques en ce qu'elles induisent des réponses inflammatoires sévères, tandis que d'autres vecteurs tels que les rétrovirus et les lentivirus peuvent entraîner des problèmes avec mutagenèse d'insertion. VAAr est un parvovirus bénigne et il n'y a aucune maladie connue associée à l'infection VAAr. En outre, contrairement à d'autres vecteurs viraux, transduction avec VAAr se produit sans l'expression de protéines virales AAV indigènes 27, faisant des effets secondaires sur les cellules cibles beaucoup moins d'inquiétude.vecteurs rAAV peuvent être produites dans des titres élevés et peuvent transduire des neurones post-mitotiques dans le cerveau d'une manière très localisée spatialement 21,28. En outre, les vecteurs rAAV sont maintenant générés qui peuvent cibler des sous-types spécifiques de neurones dans le cerveau de souris 29 et des systèmes d'expression rAAV Cre-dépendants sont également de plus en plus largement utilisés (voir 30 Zhang et al. (2010) pour examen).
En résumé, la cocaïne RPC est un outil comportemental simple mais instructif d'étudier la cocaïne apprentissage contextuel pertinent pour l'acquisition, l'extinction, et la réintégration de la cocaïne comportement de recherche. Une combinaison de l'utilisation VAAr exprimant la recombinase Cre dans des souris porteuses d'un allèle floxé avec RPC offre une stratégie puissante pour explorer le rôle des gènes cibles dans des régions spécifiques du cerveau qui interviennent dans le comportement de recherche de cocaïne.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Anni Lee et Maureen Byrne pour leur aide dans l'établissement du protocole de préférence de place conditionnée prolongée.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Conditioned place preference activity chambers | Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA | MED-CPP-MS | |
| Stereotaxic alignment system for mouse | David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA | model 900 | |
| Hamilton syringes | Hamilton Company, Reno, Nevada, USA | 7634-01 | |
| rAAV2-Cre-GFP | Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA | 7016 | |
| rAAV2-GFP | Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA | 7004 |
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