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Behavior

Stereotaktische Mikroinjektion von viralen Vektoren ausdrücken Cre-Rekombinase, um die Rolle der Zielgene in Cocaine konditionierte Platzpräferenz Studieren

Published: July 30, 2013 doi: 10.3791/50600

Summary

Dieser Artikel beschreibt, wie man virale Vektoren in Mäusegehirn microinject und dann in einem konditionierten Platzpräferenz Paradigma, das eine Akquisition, Aussterben und Wiedereinstellung Phase umfasst testen.

Abstract

Mikroinjizieren rekombinante virale adenoassoziierten (rAAV) Vektoren, die Cre-Rekombinase in verschiedene Maus Hirnregionen gezielt Knockout Gene von Interesse ermöglicht verbesserte zeitlich und regional-spezifische Kontrolle der Gen-Deletion, im Vergleich zu bestehenden Methoden. Während bedingte Löschung kann auch durch Kreuzen Mäusen erreicht werden, dass express Cre-Rekombinase unter der Kontrolle von spezifischen Gen-Promotoren mit Mäusen, die ein floxed Gen stereotaktischen Mikroinjektion zum Targeting von diskreten Hirnarealen bei Experimentator festgelegten Zeitpunkten von Interesse ermöglicht. Im Zusammenhang mit der Kokain klimatisierten Platzpräferenz und andere Kokain Verhaltensparadigmen wie Selbstverwaltung oder psychomotorische Sensibilisierung das kann Rücktritt, Aussterben und / oder Wiedereinstellung Phasen beinhalten, ist diese Technik besonders nützlich in der Erforschung der einzigartigen Beitrag der Zielgene zu diesen unterschiedlichen Phasen der Verhaltensmodelle von Kokain-induzierte Plastizität. InsbesondereDiese Technik ermöglicht die selektive Ablation von Zielgenen in diskreten Phasen des Verhaltens zu ihrem Beitrag zu dem Verhalten in der Zeit zu testen. Letztlich ermöglicht dieses Verständnis für eine gezieltere Therapie, die am besten in der Lage, die stärksten Risikofaktoren, die sich präsentieren in jeder Phase der Suchtverhalten anzusprechen sind.

Introduction

Kokain ist eine stark verstärkende Psychostimulanzien. Nach wiederholter Exposition auftreten mehreren molekularen und zellulären Anpassungen in Lohn-relevante Schaltkreise im Gehirn, die glaubten, in zwanghaften führen, sind Drogen-sucht Verhalten, woraufhin hohen Rückfall, die eine schwerwiegende klinische Problem 1 darstellen. Kokain übt diese langanhaltende Auswirkungen auf das Verhalten von der Regulation der Genexpression. Um die Anpassungen, die an chronischer Kokainkonsum entstehen studieren, haben präklinischen Tiermodellen wurde intensiv genutzt. Ein solches Modell ist das konditionierte Platzpräferenz (CPP) Paradigma. Dieses Modell beinhaltet die Entwicklung eines gelernt Assoziation zwischen einer zuvor neutralen Umgebung und der lohnenden Eigenschaften von Kokain. Nach mehreren Paarungen von Kokain mit einer bestimmten Kammer werden Tiere frei erkunden die Kokain-gepaarten und nicht-Kokain-gepaarten Umgebungen und wenn sie die Droge-gepaarten Fach lieber, man sagt, sie erwarb eine Kokain-induzierte Plac habene Vorlieben. Darüber hinaus ist nach einer vom Aussterben Einarbeitungszeit kann dieses Paradigma verwendet, um kontext-spezifischen Wiedereinsetzung von Kokain-seeking Verhalten zu studieren.

Im Vergleich zu anderen Verhaltensmodelle der süchtig-ähnliches Verhalten, wie psychomotorische Sensibilisierung, die verwendet werden, um langfristige Kokain-induzierte Verhaltens-und molekulare Plastizität 2,3 und Selbstverwaltung (SA) zu studieren ist, das gedacht wird, genauer nachahmen süchtig -ähnliches Verhalten beim Menschen gefunden wird, ist die CPP Paradigma ein einfaches Verfahren, um Kokain kontextuellen Lernen 4 studieren. CPP-Protokolle lassen sich bequem erweitert werden, um Auslöschung und Wiedereinstellung Phasen umfassen, ähnlich wie SA, die für die Untersuchung der Mechanismen, die Gier nach Drogen und Rückfall 5-7 und von denen angenommen wird, um Aspekte von dem, was geschieht in der menschlichen rekapitulieren Drogen-sucht Verhalten und Drogen erlauben - und Cue-induzierten Rückfall 8-10.

Ein Mechanismus zugrunde liegt, dass dieKokain-induzierte Verhaltensänderungen Plastizität, die charakteristisch für jede der verschiedenen Phasen von CPP, einschließlich Erwerb, Löschung und Wiedereinstellung ist, ist die Aktivierung eindeutige Signaturen der Genexpression in verschiedenen Hirnregionen. Um direkt zu testen, welche Gene in Lohn-relevanten Hirnregionen vermitteln Verhaltensänderungen Kokain-induzierte, ist es sinnvoll, in der Lage sein, sie zu manipulieren selektiv in einem regional-spezifische Art und Weise. Eine Möglichkeit, dies zu erreichen ist, um rekombinante virale adenoassoziierten (rAAV)-Vektoren, die express Cre-Rekombinase mit stereotaktischen Chirurgie, in verschiedene Hirnareale von Mäusen, die Zielgene von LoxP Websites (floxed Mäuse) flankiert microinject. Dieses Verfahren ermöglicht eine sehr genaue zeitliche und regionale Kontrolle darüber, wann und wo Gene abgetragen werden, in beiden Teilen und nicht teilende Neuronen, ohne eine Immunantwort 11-13. Dieser Grad der Kontrolle stellt einen wichtigen Vorteil gegenüber herkömmlichen Cre-loxP Technologie der Zucht floxed Mäuse wit Mäusen, die Cre-Rekombinase unter der Kontrolle eines endogenen Gen-Promotor, dadurch gekennzeichnet, daß der Zeitpunkt und die Verteilung der Gen-Deletion kann mehr genau reguliert werden. Außerdem umgeht viralen Vektor-vermittelte Gen-Knockout Potenzial für Entwicklungsstörungen kompensatorische Effekte, die auftreten, mit traditionellen Ko-Strategien können.

Neben Kokain CPP, die hier beschrieben wird, Mikroinjektion von rAAV-Cre in das Gehirn von Mäusen floxed, um die Rolle von spezifischen Genen kann zu Verhaltensstörungen ubiquitär Paradigmen, die einzelnen Phasen, einschließlich Selbstverwaltung und psychomotorische Sensibilisierung beinhalten angewendet werden zu beurteilen. Zum Beispiel hat unser Labor die rAAV-Cre-Technologie verwendet, um die Rolle von Ca v 1.2 L-Typ-Ca 2 +-Kanäle in Kokain psychomotorische Sensibilisierung 14 studieren. Insbesondere wurde rAAV-Cre in den Nucleus accumbens (NAC) von Mäusen, die mit dem Gen Ca v 1.2 floxed, Mikroinjektion zu zeigen, dass Ca v 14,15. Doch die rAAV-Cre-Strategie kann nicht verwendet werden, wenn Mäuse mit einem floxed Gen von Interesse nicht vorhanden sind, wie es unsere Erfahrung bei der Beurteilung der Rolle der Ca v 1.3 L-Typ-Ca 2 +-Kanäle in psychomotorische Sensibilisierung. Daher stellt eine Einschränkung bei der Verwendung rAAV-Cre selbst wenn bedingte Mäusen nicht für ein bestimmtes Gen von Interesse vorhanden sind. Allerdings rAAVs dass express siRNA Knockdown auf Zielgene verwendet werden können, wie wir es getan, um die Rolle von Ca v 1.3 Kanäle 14,15 untersuchen haben.

Mikroinjizieren rAAV-Cre in diskrete Hirnregionen floxed Mäusen und dann testen sie in der CPP Paradigma ermöglicht Untersuchung der spezifischen Gene, die die verschiedenen Phasen der süchtig-ähnliches Verhalten und wo sie tätig sind, zu vermitteln. Verwenden Sie dieses Paradigmas ist in unserem Verständnis geholfen, wie wiederholte Kokain Verwaltung im Wesentlichen die br entführtains Lohn-Schaltung verursacht maladaptive Veränderungen in der molekularen Signalwege und Genexpression, dass zu den süchtigen Zustand 1,16,17 führen.

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Protocol

Alle Vorgänge werden in Übereinstimmung mit dem Weill Cornell Medical College Institutional Animal Care und Use Committee Regeln durchgeführt.

1. Vorbereitung und Einstellung für Stereotaktische Lieferung von viralen Vektoren

  1. Wenn ein Instrument, sterilen Tupfer oder Hand tragen sterile Handschuhe durch den Kontakt mit einem nicht-sterilen Oberfläche verschmutzt ist, verwerfen oder erneut sterilisieren das Instrument mit einem Wulst heißen Sterilisator, entsorgen Sie den Tupfer oder ändern, um neue sterile Handschuhe.
  2. Legen Sie eine Maus Käfig mit Decken auf einem Heizblock für post-operative Erholung erwärmen.
  3. Einrichten elektrischen Rasierer für Scherkopf und Ethanol und Jod, um die Kopfhaut zu sterilisieren.
  4. Wischen Sie Ohr Bars und Mund halten der stereotax mit 70% Ethanol.
  5. Mit einem 5 ul Hamilton Spritze, auszuarbeiten 5 ul viralen Vektor (1 x 10 6 Viruspartikel / ul) und Einrichten in Spritzenhalter auf stereotax.
  6. Mikrowelle Heizkissen oder drehen Heizkissen auf einend am stereotax. Mit einem sauberen saugfähigen Unterlage, um das Risiko von Verbrennungen zu verringern. Überwachung der Maus Körpertemperatur (zwischen 97-99,5 ° F) häufig den ganzen Vorgang.
  7. Injizieren Maus (mit einem Gewicht von 22-35 g) mit einer Mischung aus Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (20 mg / kg). Sobald eine Maus ist betäubt, um Prise Schwanzspitze überprüfen die Maus Reflexe und beachten Sie jegliche Bewegung oder Reaktion, um sicherzustellen, dass die Maus ausreichend betäubt ist.
  8. Shave Kopf zwischen den Ohren und Augen.
  9. Reinigen Sie rasierten Kopf mit wechselnden Ethanol und Jod sterile Wattestäbchen.
  10. Übertragen Maus Heizkissen auf stereotax.

2. Stereotaktische Mikroinjektion von viralen Vektoren

  1. Tragen Sie sterile Handschuhe während der Operation. Werden Handschuhe an irgendeinem Punkt durch Berühren unsterilen Oberflächen kontaminiert sind, die Handschuhe wechseln.
  2. Null Zahn bar und Ohr bar Skalen.
  3. Set Zähne Zahn in bar.
  4. Schrauben in der Mündung. Wenn wackeln oder Whisker Umzugment jederzeit festgestellt wird, verwaltet ein IP Auffrischimpfung (~ 0,05 cm) von einer Mischung aus Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (20 mg / kg).
  5. Schrauben in Ohr Bars.
  6. Schmieren Sie die Augen mit Puralube.
  7. Kopfhaut aufgeschnitten, nur hinter den Ohren mit einem Skalpell.
  8. Platz Bulldogge Clips an den Ecken der Kopfhaut zu schälen die Haut vom Schädel. Bregma und Lambda sollte gut sichtbar sein.
  9. Stellen Sie sicher, Nahtmaterial von Bregma Lambda ist gerade ausgerichtet. Wenn die Naht ist krumm nachjustieren Positionierung des Kopfes.
  10. Überprüfen Sie, ob alle Einstellungen auf dem stereotax Null sind.
  11. Setzen Nadelspitze in Ort bei Bregma.
  12. Messen Sie alle Koordinaten für beide Bregma und Lambda. Dazu gehören dorsal / ventral, medial / lateral und anterior / posterior-Koordinaten.
  13. Stellen Sie den Kopf, bis die ventralen Koordinaten für Bregma und Lambda innerhalb 0,02 mm von einander sind.
  14. Einmal ausgerichtet, gehen von Bregma medial aus den medialen / lateralen (M / L) Koordinaten. Stellen Sie sicher,die linken und rechten Seiten in 0,02 mm zueinander ausgerichtet sind.
  15. Re-Zentrum Nadelspitze auf Bregma und von dort aus bewegen sich in der anterioren / posterioren (A / P) in Richtung auf die gewünschte anterioren / posterioren Koordinate.
  16. Gegebenenfalls Winkel Nadel in einer Richtung und sicherzustellen, dass die stereotax gesperrt ist. Gehe nach links M / L-Koordinate (+ / - 1,52)
  17. Messen Sie die Position des ventralen Spitze des Schädels als Referenz zu verwenden, nachdem das Bohrloch gebohrt.
  18. Bohren eines Bohrlochs mit einem sterilen Bohrer an den gewünschten Koordinatensystem. Prüfen Sie, ob die Nadel durch den Schädel geben ununterbrochen.
  19. Senken Sie die Nadel an die gewünschte ventralen Koordinate.
  20. Sobald die Koordinaten erreicht ist, dip 0,015 mm unten ~ 10 Sek. eine kleine Tasche für den viralen Vektor zu erstellen.
  21. Injizieren Sie die gewünschte Lautstärke von viralen Vektor mit einer Rate von ~ 0,1 ml / min. Warten Sie 3 min für viraler Vektor vollständig diffundieren. Heben Sie die Nadelspitze 0,015 mm und warten Sie eine weitere 2 min.
  22. Tauchen der Nadel (wenn dies abgewinkelten Injektionen) in die entgegengesetzte Richtung. Wieder, notieren Sie die Bauchlage als Referenz für die Oberseite des Schädels.
  23. Wiederholen Sie die gleichen Schritte wie auf der ersten Seite zu viralen Vektors auf der gegenüberliegenden Seite zu injizieren (wenn dies bilateralen Injektionen).
  24. Bewerben Knochenwachs zu beiden Löcher, um sie zu versiegeln mit dem hölzernen Ende einer sterilen Watteträger Spitze.
  25. Naht die Kopfhaut.
  26. Bewerben Blockade der verwundeten Bereich.
  27. Entfernen Maus von stereotax und in erwärmt Käfig auf Heizblock für 45 min erholen.
  28. Monitor für Anzeichen von Schmerzen einschließlich: verminderte Aktivität oder Ruhelosigkeit, verminderte Futter-und Wasseraufnahme oder erhöhte Lautäußerungen. Buprenorphin (0,05-0,2 mg / kg) kann zweimal täglich für eine Woche verabreicht werden, wenn notwendig, zur Schmerztherapie. Akzeptable Alternativen sind: Meperidin (20-60 mg / kg), Pentazocin (10 mg / kg), Nalbuphin (4-8 mg / kg).

3. Klimatisierte Platz Vorlieben: Acquisition, Extinction und Wiedereinsetzung

  1. Platz Mäuse in die zentrale Kammer eines Drei-Kammer Platzpräferenz Vorrichtung (Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA) für eine 60 sec Eingewöhnungszeit mit Guillotine Türen geschlossen.
  2. Nach Gewöhnung, offene Türen und Guillotine erlauben Mäuse freien Erforschung aller 3 Kammern für 1.200 sec, mit der Zeit in jeder Kammer aufgezeichnet mit MedPC IV Software (Med Associates, Inc.) verbracht.
  3. Weisen Mäuse Klimakammern auf ihre Leistung während der Pre-Test. Mit einem vorgespannten Design, Paar Medikamentengabe während der folgenden 3 Tagen mit dem Fach, das am wenigsten bevorzugte während der Baseline-Vortest war.
  4. In den nächsten 3 Tagen Klimaanlage, injizieren Mäusen mit Kokain (10 mg / kg; ip) am Vormittag und beschränken sie auf ihren zugewiesenen Kammer für 1.200 sec unmittelbar nach der Injektion. Zurück Mäuse ihre Käfige nach der Sitzung. Nach 4 Stunden, injizieren Mäuse mit Kochsalzlösung (0,01 ml / gKörpergewicht) und beschränken sie auf die gegenüberliegende Kammer für die 1.200 Sek. Nachmittagssitzung.
  5. Um für den Erwerb zu testen, geschlossen Ort Mäuse in der zentralen Kammer mit Guillotine Türen für einen 60 sec Eingewöhnungszeit. Offene Türen und Guillotine ermöglichen die freie Exploration 1.200 sec, mit der Zeit in allen Kammern durch MedPC IV Software (Med Associates, Inc.) aufgezeichnet verbracht. Berechnen Vorlieben, indem die Menge an Zeit in der Saline-gepaart Kammer von der Höhe der Zeit in der Kokain-gepaarten Kammer verbracht wird.
  6. Um die Platzpräferenz löschen, setzen Mäuse auf zwei 20 min Sitzungen des freien Exploration täglich in der gleichen Apparatur, um mindestens 2 Stunden getrennt, beginnend 24 Stunden nach der Prüfung für den Erwerb. Zeit in allen Kammern verbracht sollten wieder aufgenommen werden, und die Größe des anfänglichen CPP sollte, dass jedes Aussterben Sitzung verglichen werden.
  7. Bestimmen Sie, ob Mäuse haben die Arzneimittel-induzierte Bevorzugung durch die Beurteilung, ob Präferenz für ein par erloschendere Kammer über zwei aufeinanderfolgende Tage Aussterben ist deutlich niedriger im Vergleich zum Erwerb Vorlieben der Gäste.
  8. Wiedereinsetzung der Mäuse mit einer Anfangsdosis von Kokain (5 oder 10 mg / kg; ip) und an das Gerät eine freie Exploration erneut aussetzen und notieren Sie die Zeit in jedem Abteil verbracht.
  9. Verwalten Euthasol Euthanasie-Lösung (150 mg / kg). Transkardial perfundieren Mäuse mit 4% Paraformaldehyd (PFA) und führen Sie eine histologische Untersuchung, um die korrekte Platzierung Mikroinjektion validieren.

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Representative Results

CPP

Nach Durchführung CPP auf mikroinjizierten Mäuse, sollte man sicherstellen, dass die Kohorte der Kontrolle injizierten (rAAV-GFP) Mäusen haben normalerweise Präferenz für die Droge-gepaart Kammer (1A, 1B) erworben. Mäuse werden als erworben Präferenz für eine bestimmte Kammer haben, wenn Kokain Vorlieben (Zeit in der Kokain-gepaarten Kammer minus Zeit in der Saline-Zweikammer aufgewendet) ist deutlich höher im Vergleich zum Ausgangswert Vorlieben der Gäste (Abbildung 1B, A vs B) . Wenn, wie einer Kohorte, Kontroll-injizierten Mäusen zeigen keine Vorliebe für die Kokain-gepaarten Kammer oder zeigen eine Abneigung, Platzierung sollte sofort über Histologie (siehe Unterabschnitt rAAV Injektionen) und Mäuse mit falschen Platzierung bestätigt werden muss verworfen werden.

Wenn Präferenz wurde normalerweise von der Steuer-injizierten Kohorte erworben, kann man nachträglich erweitern das Paradigma von Anfang Aussterben (Abbildung 1A (Abbildung 1B, E3, E4, E5 vs A). Zu diesem Zeitpunkt kann man mit einem Medikament prime (1A, 1B) wieder einzustellen. Wenn die Vorlieben der Gäste nach der Verabreichung des Medikaments eine Primzahl ist statistisch ununterscheidbar von der bei Erwerb, dann, dass Kohorte soll wieder die Arzneimittel-induzierte Präferenz für die Droge-gepaarten Kammer (Abbildung 1B, R vs A) haben.

rAAV microinjections

Vor der Verfolgung der rAAV-Cre experimentelle Strategie innerhalb eines Verhaltens-Paradigma ein sicherzustellen, dass rAAV-Cre hat in der Tat klopfte das Gen von Interesse in mikroinjizierten Mäusen durch qPCR (1C) und / oder Western-Blot-oder immunhistochemische Analyse 18 sollte </ Sup>. Zum Beispiel, nach Mikroinjektion von rAAV-Cre-GFP in den NAc von Mäusen, die die L-Typ Calcium-Kanal-Isoform Ca v 1.2 floxed hatten, zeigen rAAV-Cre injiziert Schläge eine signifikante Abnahme der Genexpression (Abbildung 1C). Darüber hinaus haben wir durch immunhistochemische Analyse gezeigt, dass rAAV-Cre kann knockout Ca v 1.2-Protein im Gehirn der Maus 18. Nach allen Verhaltens-Analysen sollten Mäuse transkardial mit 4% Paraformaldehyd und fluoreszierende Immunhistochemie durchblutet werden sollte für das grün fluoreszierende Protein (GFP) durchgeführt werden. Wenn bilateralen Strukturen wurden gezielte, sollte die richtige Platzierung von bilateralen fluoreszierenden immunhistochemische Färbung (1D, Vertreter Ausrichtung der NAc) überprüft werden. Wenn der richtige Bereich ist in der Tat ins Visier genommen, sollte Färbung visualisiert werden ausschließlich in der Region bestimmt und nicht außerhalb davon. Wenn eine oder beide der Injektionen Off-Target sind, sollten Mäuse rückwirkendly von der CPP Datensatz ausgeschlossen. Eine weitere Strategie zur Visualisierung der genauen Ausrichtung der viralen Vektor-infizierten Hirnregionen und anschließende Präparation des infizierten Bereich für biochemische Analysen, kann unter Verwendung eines GFP-leuchtenden Taschenlampe als in Li und Wolf (2011) 19 beschrieben.

Abbildung 1
1A. Experimentelle Timeline von rAAV-Cre Mikroinjektion und klimatisierte Platzpräferenz Erwerb, Löschung und Wiedereinstellung Phasen. RAAV-Cre in der Region von Interesse 2-3 Wochen vor dem Beginn des Verhaltenstests mikroinjiziert. Klimatisierte Platzpräferenz beginnt mit einem Pre-Test, um alle anfänglichen Vorurteile, von 3 Tagen nach der Konditionierung mit Kokain (10 mg / kg, ip) gefolgt ermitteln. Vier Stunden nach jeder Sitzung Kokain Klimaanlage, Mäusemit Kochsalzlösung behandelt und beschränkt sich auf die gegenüberliegende Kammer. Am folgenden Tag Mäuse werden für den Erwerb eines CPP getestet. Extinction Training beginnt 24 Stunden später und beinhaltet 2 täglichen Sitzungen, die von mindestens 2 Stunden voneinander getrennt sind, die freien Zugang zu der gesamten Vorrichtung zu ermöglichen. Sobald Mäusen haben das Aussterben Kriterium erreicht, werden sie eine Grundierung Injektion von Kokain (10 mg / kg, ip) verabreicht und ihre Zeit in allen Kammern des Apparates wird bewertet, um die Wiedereinsetzung von Kokain-seeking Verhalten. 1B testen. Repräsentative Ergebnisse der Basislinie wurden Erwerb, Aussterben Ausbildung und Wiedereinstellung. WT C57BL/6J-Mäusen mit Kokain während den Tagen 2, 3 und 4 der Anlage behandelt. Mäuse zeigten Erwerb, Löschung und Kokain-induzierte Wiedereinstellung (10 mg / kg ip Kokain prime). *** P <0,001 im Vergleich zum Ausgangswert (B); # p <0,05 im Vergleich Erwerb (A). Baseline, B; Erwerb, A; Extinction, E; Wiedereinsetzung, R. 1C. Stereotaxic Lieferung von rAAV-Cre-GFP in den NAc von Ca v 1.2 floxed Mäusen signifikant verringert Ca v 1.2 mRNA. Homozygote Ca v 1.2 floxed Mäuse wurden mit Kontrolle (rAAV-GFP) oder experimentelle (rAAV-Cre-GFP) mikroinjiziert virale Vektoren . Nach maximal Cre Aktivierung wurden die Mäuse getötet und die mRNA wurde isoliert und relativen Expressionsniveaus wurden durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von Ca v 1.2 Primer untersucht. Stereotaktische Lieferung von rAAV-Cre-GFP in den NAc von Ca v 1.2 floxed Mäusen signifikant verringert Ca v 1.2-mRNA-Spiegel im Vergleich zu Mäusen, die mit AAV-GFP injiziert. † † p <0,001 vs rAAV-GFP. 1D. Neuronen mikroinjiziert mit rAAV-GFP in der Maus NAc. Homozygote Ca v 1.2 floxed Mäusen mit rAAV-GFP wurden mikroinjiziert um die richtige Platzierung im bilateralen NAc überprüfen. Mäuse wurden mit 4% PFA und Immunhistochemie wurde durchgeführt, perfundiert. GFP Färbung Demonstrationtes richtigen bilateralen Ausrichtung der NAK. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

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Discussion

Regional-und zeitlich-spezifische Gen-Ablation über stereotaktischen Mikroinjektion von viralen Vektoren mit CPP kombiniert das Aussterben und Wiedereinstellung Phasen beinhaltet ermöglicht die Untersuchung der spezifischen Beiträge von Genen zu drei verschiedene Phasen der Sucht-Verhalten. Während konditionellen Knockout, die erreicht werden, indem die traditionelle Cre-loxP-System sorgt für räumlich-zeitlich beschränkt Genablation, stereotaxically Mikroinjizieren Cre-Rekombinase in diskrete Hirnareale von floxed Mäusen ermöglicht sogar strengere Kontrolle, wann und wo ein Gen ausgeknockt. Außerdem umgeht dies die Möglichkeit von Ausgleichszahlungen Veränderungen während der Entwicklung, die manchmal entfallen begrenzten phänotypische Variation in Knockout-Mäusen beobachtet. Darüber hinaus können mit Kohorten von Mäusen, die zu verschiedenen Zeitpunkten während des Verhaltens wurden mikroinjiziert für kausale Zusammenhänge zwischen einer Änderung in der Genexpression und eine Änderung des Verhaltens gemacht werden können. Importantly, kann diese Technik auf verschiedene Kokain Verhaltensparadigmen einschließlich Selbst-Verabreichung und psychomotorische Sensibilisierung eingesetzt werden.

Es ist wichtig, eine Wartezeit von mindestens 10-14 Tage nach Operationen, um zu gewährleisten, dass die maximale Aktivierung der Cre-Rekombinase wurde 20 aufgetreten ist. Beginnend Verhaltenstests vor kann dies bei der Verwendung von Mäusen mit einer unbekannten Menge von submaximalen Cre Expression führen, so dass Verhaltensänderungen Ergebnisse schwer zu interpretieren. Maximal Aktivierung des Cre führt zu einer vollständigen Knockout eines Gens, aber diese tritt nur in Zellen, die tatsächlich infiziert sind. Abhängig von dem Volumen und der Titer des viralen Vektors, sind etwa 50-70% der Zellen für eine bestimmte Region, was zu der entsprechenden Menge an mRNA und Protein-Knockout die etwas restliches Genexpression (1C) führen kann infiziert. Wir haben jedoch gezeigt, dass eine 50-60% mRNA diese Art von Knockout ausreichend zum Ausdruck zu ändern istSensibilisierung der psychomotorischen 14. Darüber hinaus ist diese Methode ideal für längere Verhaltensparadigmen wie einst Cre Aktivierung erfolgt in vivo ist, dauert seine Expression und das entsprechende Gen-Knockout für mindestens 6 Monate 21.

Wenn man daran interessiert, die Überprüfung der Rolle eines Gens in einer diskreten Zeit jedoch ist das nicht mit diesem Verfahren nicht möglich. Für kurzfristigere Ausdruck, Herpes simplex-Virus (HSV)-Vektoren verwendet werden können, die bevorzugt infizieren Neuronen 22. Im Vergleich zu rAAV Expression der Cre-Rekombinase, die für längere Zeit bestehen bleibt, wie der Promotor nicht nach Tagen oder Wochen in vivo 23 zum Schweigen gebracht werden HSV-Vektoren für transiente Expression bevorzugt, da sie in vivo für Tage auszudrücken. HSV-Vektoren sind ebenfalls vorteilhaft, da sie breite Transduktion und dass Helfervirus-freie Bestände existieren 22 demonstrieren. Darüber hinaus kann auch HSV-Vektoren ausdrücken Cre recombinase und vermitteln die Exzision floxed Sequenzen sowohl in der Kultur und in vivo 24. Allerdings hat gelegentlich Zytotoxizität gefunden.

Fast jede Region innerhalb des Gehirns kann gezielt mit diesen Mikroinjektionstechnik werden. Bei dem Versuch, kleinere Unterbereiche innerhalb eines größeren Zielregion kann man, um die Menge des viralen Vektors zu optimieren. Zum Beispiel, wir mikroinjiziert 0,5 ul rAAV-Cre-GFP, die NAC und ventralen Tegmentum (VTA) 14 Ziel, während beim Anvisieren größeren Strukturen wie dem Hippocampus und Kortex, Ahmed und Kollegen 20 0,8 ul rAAV-Cre verwendet. Alternativ erforschen verschiedene Optionen, die Serotyp jedes differentielle Verbreitung und Infektiosität Eigenschaften haben (siehe Choi et al. (2005) 25 für die Überprüfung) kann in Aktionen in einem kleineren, abgegrenzten Gebiet zu unterstützen. Umgekehrt, wenn Sie versuchen, eine größere Region ansprechen, kann man erhöhen das Volumen der viralen Vektor mikroinjiziert. Das is wirksamer als die Nutzung höherer Vektortiter als sie liefern wahrscheinlich zusätzliche Infektionen pro Zelle zu einer höheren Zahl von insgesamt 22 infizierten Zellen entgegen. Zusätzlich kann man mehrere Injektionen in einem Bereich oder in mehreren Bereichen durchzuführen, um effektiver zu infizieren eine größere Fläche 26.

Verwendung von rAAV Vektoren ist auch von Vorteil, wenn sie mit anderen viralen Vektoren, die verwendet werden, um die Funktion des Gehirns und Krankheit untersuchen, verglichen werden. Insbesondere erwies traditionellen adenoviralen Vektoren problematisch, dass sie schwere Entzündungsreaktion induziert, während andere Vektoren, wie Retroviren, Lentiviren und Probleme mit Insertionsmutagenese beinhalten kann. rAAV ist eine gutartige Parvovirus und es gibt keine bekannte Krankheit, die mit rAAV-Infektion assoziiert. Darüber hinaus, im Gegensatz zu anderen viralen Vektoren, tritt Transduktion mit rAAV ohne die Expression von nativen AAV 27 virale Proteine, so dass sekundäre Effekte auf Zielzellen viel weniger ein Problem.rAAV Vektoren können in hohen Titern produziert werden können und post-mitotischen Neuronen im Gehirn in einem stark räumlich lokalisiert Weise 21,28 Transduktion. Darüber hinaus werden rAAV Vektoren jetzt erzeugt werden, die spezifische Subtypen von Neuronen im Gehirn der Maus 29 und Cre-abhängigen rAAV Expressionssysteme sind auch immer mehr verbreitet (siehe Zhang et al. (2010) 30 für die Überprüfung) zielen.

Zusammenfassend dient Kokain CPP als einfache, aber informative Verhaltens Werkzeug, um Kokain kontextuellen Lernen relevant für den Erwerb, Löschung und Wiedereinsetzung von Kokain-seeking Verhalten zu studieren. Eine Kombination der Verwendung von rAAV exprimieren Cre-Rekombinase in Mäusen, die eine floxed Allel mit CPP bietet eine leistungsstarke Strategie für die Erkundung der Rolle der Zielgene in spezifischen Hirnregionen vermitteln, dass Kokain suche Verhalten.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Die Autoren bedanken sich bei Anni Lee und Maureen Byrne für ihre Hilfe danken, die Gründung der erweiterten Klimaanlage Platzpräferenz Protokoll.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Conditioned place preference activity chambers Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA MED-CPP-MS
Stereotaxic alignment system for mouse David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA model 900
Hamilton syringes Hamilton Company, Reno, Nevada, USA 7634-01
rAAV2-Cre-GFP Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA 7016
rAAV2-GFP Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA 7004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Stereotaktische Mikroinjektion von viralen Vektoren ausdrücken Cre-Rekombinase, um die Rolle der Zielgene in Cocaine konditionierte Platzpräferenz Studieren
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Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A.More

Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference. J. Vis. Exp. (77), e50600, doi:10.3791/50600 (2013).

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