Stereotaxic Mikroinjeksjon av Viral vektorer som uttrykker Cre rekombinase å studere rollen til målgener i Kokain Kondisjonert Place Preference

Summary

Denne artikkelen beskriver hvordan du microinject virale vektorer i mus hjernen og deretter teste i en betinget sted preferanse paradigme som inkluderer et oppkjøp, utryddelse og gjeninnføringen fase.

Abstract

Microinjecting rekombinant adenoassociated viral (rAAV) vektorer som uttrykker Cre recombinase inn i forskjellige mus hjernen til selektivt knockout gener av interesse muliggjør forbedret timelig-og regionalt spesifikk kontroll av genet sletting, sammenlignet med eksisterende metoder. Mens betinget sletting kan også oppnås ved parring mus som uttrykker Cre recombinase under kontroll av spesifikke gen-arrangører med mus bærer en floxed genet, kan stereotaxic mikroinjeksjon for målretting av diskrete hjernen områder på experimenter-bestemmes tidspunkter av interesse. I sammenheng med kokain condition sted preferanser, og andre kokain atferdsmessige paradigmer som selvadministrering eller psykomotorisk allergi som kan innebære tilbaketrekking, utryddelse og / eller gjeninnsettelse faser, er denne teknikken spesielt nyttig i å utforske den unike bidrag målgener til disse distinkt faser av atferdsmessige modeller av kokain-indusert plastisitet. Konkretdenne teknikken gjør det mulig for selektiv ablasjon av målet gener under diskrete faser av en atferd for å teste deres bidrag til atferd på tvers av tid. Til syvende og sist gjør at denne forståelsen for mer målrettet terapi som er best i stand til å løse de mest potente risikofaktorer som byr seg i hver fase av vanedannende atferd.

Introduction

Kokain er et sterkt forsterkende psykostimulerende. Etter gjentatt eksponering, flere molekylære og cellulære tilpasninger oppstå i belønning-relevant hjernen krets som antas å resultere i compulsive narkotika-søkende atferd, spørre høy forekomst av tilbakefall som utgjør en alvorlig klinisk problem ^en. Kokain utøver disse langvarige atferdsmessige effekter ved regulering av genuttrykk. Å studere tilpasninger som oppstår fra kronisk kokainbruk, har prekliniske gnager modeller blitt brukt mye. En slik modell er den betingede sted preferanse (CPP) paradigme. Denne modellen involverer utvikling av et lært tilknytning mellom et tidligere nøytralt miljø og de givende egenskaper av kokain. Etter flere motstandere av kokain med en bestemt kammer, er dyr lov til å fritt utforske kokain sammenkoblet og ikke-kokain-paret miljøer og hvis de foretrekker narkotika-paret kupé, de er sagt å ha ervervet en kokain-indusert place preferanse. Videre følger en utryddelse treningsperiode, kan dette paradigmet brukes til å studere kontekstspesifikk gjeninnføringen av kokain-søkende atferd.

Sammenlignet med andre atferdsmessige modeller av vanedannende-lignende adferd, slik som psykomotorisk sensibilisering, som brukes til å studere langvarig kokain-indusert og atferdsmessige molekylær plastisitet ^2,3 og selvadministrering (SA), som er antatt å mer nøyaktig etterligne vanedannende -lignende oppførsel funnet hos mennesker, er det CPP paradigmet en enkel prosedyre for å studere kokain kontekstuell læring ^fire. CPP-protokoller kan enkelt utvides til å omfatte utryddelse og gjeninnsettelse faser, i likhet med SA, som gir mulighet for undersøkelse av mekanismene bak narkotika ute og tilbakefall ^5-7 og som antas å rekapitulere aspekter av hva som skjer i menneskets medikamentell-søkende atferd og narkotika - og cue-indusert tilbakefall ^8-10.

En mekanisme som ligger til grunn forkokaininduserte atferdsmessige plastisitet som er karakteristisk for hver av de forskjellige faser av CPP, inkludert ervervet, utryddelse, og gjeninnføringen, er aktivering av unike signaturer av genekspresjon innenfor forskjellige områder av hjernen. Å direkte teste hvilke gener innen lønn-relevante områder av hjernen megle kokain-indusert atferdsendringer, er det nyttig å kunne manipulere dem selektivt i et regionalt-spesifikk måte. En måte å oppnå dette på er å microinject rekombinant adenoassociated viral (rAAV) vektorer som uttrykker Cre recombinase hjelp stereotaxic kirurgi, inn i forskjellige områder av hjernen til mus som har målgener flankert av LoxP nettsteder (floxed mus). Denne fremgangsmåte gir mulighet for svært presis tidsmessig og regional kontroll over når og hvor genene er ablateres, i både delende og ikke-delende neuroner, uten å indusere immunresponser ^11-13. Dette nivået av kontroll er en viktig fordel fremfor tradisjonelle Cre-LoxP teknologi for avl floxed mus wed mus som uttrykker Cre rekombinase under kontroll av en endogen genpromotoren, ved at tidspunktet for og fordelingen av genet sletting kan mer nøye regulert. I tillegg omgår viral vektor-mediert genet knockout potensielle utviklingsmessige kompenserende effekter som kan oppstå ved hjelp av tradisjonelle knockout strategier.

I tillegg til kokain CPP, som er beskrevet her, mikroinjeksjon av rAAV-Cre inn i hjernen av floxed mus for å vurdere rollen til spesifikke gener man kan bruke overalt til atferdsmessige paradigmer som involverer separate faser, herunder selvadministrering og psykomotorisk sensibilisering. For eksempel har vårt laboratorium utnyttet rAAV-Cre-teknologi for å studere rollen til Ca _v 1.2 L-type Ca ^{2 +} kanaler i kokain psykomotorisk sensibilisering ^14. Nærmere bestemt, ble rAAV-Cre microinjected inn i nucleus accumbens (NAC) av mus med genet som koder for Ca _v 1.2 floxed, for å demonstrere at Ca _v 14,15. Imidlertid kan rAAV-Cre strategien ikke brukes hvis mus med en floxed gen av interesse ikke eksisterer, som var vår erfaring ved vurdering av rollen Ca _v 1.3 L-type Ca ^{2 +} kanaler i psykomotorisk sensibilisering. Derfor presenterer en begrensning for å bruke rAAV-Cre selv om betingede mus ikke eksisterer for et bestemt gen av interesse. Men rAAVs som uttrykker siRNA kan brukes til knockdown mål gener, som vi har gjort for å undersøke hvilken rolle Ca _v 1.3 kanaler ^14,15.

Microinjecting rAAV-Cre i diskrete områder av hjernen floxed mus og så teste dem i CPP paradigmet åpner for gransking av spesifikke gener som formidler de ulike fasene av vanedannende-lignende oppførsel og hvor de opptrer. Bruk av dette paradigmet har hjulpet i vår forståelse av hvordan gjentatt kokain administrasjon i hovedsak kaprer den brains belønning kretser forårsaker mistilpasset endringer i molekylær signaltransduksjonsveiene og genuttrykk som fører til den avhengige tilstand ^1,16,17.

Protocol

Alle prosedyrer er gjennomført i samsvar med Weill Cornell Medical College Institutional Animal Care og bruk komité regler.

En. Klargjøring og oppsett for stereotaxic Levering av virale vektorer

1. Hvis et instrument, steril vattpinne, eller hånd på seg sterile hansken er forurenset ved å komme i kontakt med en ikke-steril overflate, forkaste eller re-sterilisere instrumentet med en varm perle sterilisator, kast bomullspinne eller endre til nye sterile hansker.
2. Plasser en mus bur med sengetøy på en varme blokk å varme for postoperative.
3. Sett opp elektrisk barbermaskin for barbering hodet og etanol og jod å sterilisere hodebunnen.
4. Tørk øret barer og munn tak i stereotax med 70% etanol.
5. Ved hjelp av en 5 pl Hamilton sprøyte, utarbeide 5 pl av viral vektor (1 x 10 ⁶ viruspartikler / mikroliter) og satt opp i sprøyteholderen på stereotax.
6. Mikrobølgeovn oppvarming pad eller slå elektrisk pad på ennd sted på stereotax. Dekk med en ren absorberende pute for å redusere risikoen for brannskader. Overvåk mus kroppstemperatur (mellom 97 til 99,5 ° C) ofte hele prosedyren.
7. Injiser mus (vekt på mellom 22-35 g) med en blanding av ketamin (100 mg / kg) og xylazin (20 mg / kg). Når en mus er bedøvet, å klype haletipp sjekke musens reflekser og merke noen bevegelse eller respons for å sikre at musen er tilstrekkelig bedøvet.
8. Barbere hodet mellom ører og øyne.
9. Rengjør barbert hode med vekslende etanol og jod sterile bomull applikatorer.
10. Overføre musen til oppvarmet pad på stereotax.

2. Stereotaxic Mikroinjeksjon av virale vektorer

1. Bruk sterile hansker hele operasjonen. Hvis hanskene er forurenset når som helst ved å berøre ikke-sterile overflater, skift hansker.
2. Zero tann bar og øre bar skalaer.
3. Sett tennene i tann bar.
4. Skru på snuten. Hvis du vrir eller værhår flytteling er kjent til enhver tid, gi en ip boosterdose (~ 0,05 ml) av en blanding av ketamin (100 mg / kg) og xylazin (20 mg / kg).
5. Skru i øret barer.
6. Smør øynene med PuraLube.
7. Skåret opp hodebunnen til like bak ørene med en skalpell.
8. Plasser bulldog klipp på hjørnene av hodebunnen å skrelle huden vekk fra skallen. Bregma og lambda skal være lett synlig.
9. Sørg for sutur fra bregma til lambda er justert rett. Hvis suturen er kroket juster posisjonering av hodet.
10. Kontroller at alle innstillingene på stereotax er nullstilt.
11. Sette nålespissen på plass på bregma.
12. Måle alle koordinatene for både bregma og lambda. Dette inkluderer dorsal / ventral, medial / lateral og anterior / posterior koordinater.
13. Juster hodet til den ventrale koordinater for bregma og lambda er innenfor 0.02 mm fra hverandre.
14. Når de er rettet, går fra bregma medialt ut til mediale / laterale (M / L) koordinater. Sørgevenstre og høyre side er justert innenfor 0,02 mm fra hverandre.
15. Re-senter nålespissen på bregma og derfra bevege seg i fremre / bakre (A / P) retning til ønsket anterior / posterior koordinat.
16. Hvis det er nødvendig, vinkel nål i en retning og sørge for at stereotax er låst. Gå ut til venstre M / L koordinat (+ / - 1.52)
17. Mål den ventrale posisjonen til toppen av skallen til bruk som en referanse etter at borehullet er boret.
18. Bore et borehull ved hjelp av en steril borekronen ved ønsket koordinatsystem. Sjekk at nålen kan skrive uavbrutt gjennom skallen.
19. Senke nålen til den ønskede ventrale koordinat.
20. Når koordinat er nådd, dip 0,015 mm nedenfor for ~ 10 sek å lage en liten lomme for viral vektor.
21. Injisere ønsket volum av viral vektor med en hastighet på ~ 0,1 mL / min. Vent 3 min for viral vektor for å spre helt. Hev nålespissen 0.015 mm og vente ytterligere 2 min.
22. Dypp nålen (hvis gjør vinklede injeksjoner) i motsatt retning. Igjen, ta ventrale posisjon som en referanse for toppen av skallen.
23. Gjenta den samme fremgangsmåten som på første side for å injisere virusvektor på motsatt side (hvis du gjør bilaterale injeksjoner).
24. Påfør bein voks til begge hullene for å forsegle dem med tre enden av en steril bomull applikatorspissen.
25. Sy hodebunnen.
26. Påfør nerve blokk til den sårede området.
27. Fjern musen fra stereotax og plasser i varmet buret på varme blokk å gjenopprette for 45 min.
28. Overvåke for tegn på smerte, inkludert: redusert samlede virksomhet eller rastløshet, nedsatt mat og vann forbruk eller økt stemmebruk. Buprenorfin (0,05 til 0,2 mg / kg) kan administreres to ganger daglig i en uke om nødvendig for smerte. Akseptable alternativer inkluderer: meperidin (20-60 mg / kg), pentazocin (10 mg / kg), nalbufin (4-8 mg / kg).

3. Klimaanlegg Place Preference: OPPKjØPn, Extinction, og reaktivering

1. Plasser mus i det sentrale kammer i en tre-kammer sted preferanse apparat (Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA) for en 60 sek periode med tilvenning guillotine dørene lukkes.
2. Etter tilvenning, åpne giljotin dører og la mus fri utforskning av alle tre kamre for 1200 sek, med tidsbruk i hvert kammer blir registrert ved hjelp MedPC IV programvare (Med Associates, Inc.).
3. Tildele mus til condition kamre basert på deres prestasjoner under pre-test. Ved hjelp av en forspent konstruksjon, par legemiddeladministrering løpet av de påfølgende 3 dager med kammeret som var minst foretrukket under grunnlinjen før-test.
4. I løpet av de neste tre condition dager, injisere mus med kokain (10 mg / kg, ip) i morgen økten og begrense dem i sine tildelte kammer for 1200 sek umiddelbart etter injeksjonen. Returner mus til sine hjem bur etter økten. Etter 4 timer, injisere mus med saltvann (0,01 ml / gkroppsvekt) og begrense dem til det motsatte kammer for de 1.200 sek ettermiddag.
5. For å teste for oppkjøpet, lukket sted mus i det sentrale kammer med giljotin dører for en 60 sek tilvenning periode. Åpne giljotin dører og tillate fri utforskning for 1200 sek, med tidsbruk i alle kamrene innspilt av MedPC IV programvare (Med Associates, Inc.). Beregn preferanse ved å trekke beløpet av tid brukt i saltvann sammenkoblet kammer fra mengden av tid brukt i kokain-paret kammeret.
6. Å slukke stedet preferanser, utsetter mus til to 20 min økter med fri utforskning daglig i samme apparat, atskilt med minst to timers, som begynner 24 timer etter testen for oppkjøpet. Tid brukt i alle kamrene skal igjen bli registrert og størrelsen av den innledende CPP bør sammenlignes med den for hver sesjon utryddelse.
7. Avgjøre om mus har slukket narkotikaindusert preferanse ved å vurdere om preferanse for et particular kammer over to påfølgende utryddelse dager er betydelig lavere sammenlignet med oppkjøpet preferanse score.
8. Gjeninnsette mus med en grunning dose av kokain (5 eller 10 mg / kg, ip) og re-utsett til apparatet slik at fri utforskning og registrere tid brukt i hver kupé.
9. Administrer Euthasol eutanasi-løsning (150 mg / kg). Transcardially perfuse mus med 4% paraformaldehyde (PFA) og utføre en histologisk undersøkelse for å validere korrekt mikroinjeksjon plassering.

Representative Results

CPP

Etter å ha utført CPP på microinjected mus, bør man kontrollere at kohort av kontroll-injisert (rAAV-GFP) mus har vanligvis fått preferanse for narkotika-paret kammer (Figur 1A, 1B). Mus anses å ha ervervet preferanse for en bestemt kammer når kokain preferanse (tidsbruk i kokain-paret kammer minus tid i saltvann sammenkoblet kammer) er betydelig høyere sammenlignet med baseline preferanse score (Figur 1B, A vs B) . Hvis, som en kohort, trenger kontroll-injiserte mus ikke viser en preferanse for kokain-paret kammer, eller vise en aversjon, bør plassering verifiseres umiddelbart via histologi (se rAAV injeksjoner ledd) og mus med feil plassering skal kastes.

Hvis innstillingen har blitt normalt kjøpt av kontroll-injisert årsklasse, kan man senere forlenge paradigmet ved begynnelsen utryddelse (figur 1A (Figur 1B, E3, E4, E5 vs A). På dette tidspunkt kan man gjeninnsette med et medikament prime (figur 1A, 1B). Hvis preferanse poengsum etter administrasjon av legemidlet prime er statistisk umulig å skille fra det ved overtakelse, så det kohort sies å ha gjeninnført narkotikaindusert preferanse for narkotika-paret kammer (Figur 1B, R vs A).

rAAV microinjections

Før forfølge rAAV-Cre eksperimentell strategi innen noen atferdsmessige paradigme man bør kontrollere at rAAV-Cre har faktisk slått ut genet av interesse i microinjected mus ved qPCR (figur 1C) og / eller western blot eller immunhistokjemisk analyse ^{18 <}/ Sup>. For eksempel etter mikroinjeksjon av rAAV-Cre-GFP i NAc av mus som hadde L-type kalsium kanal isoform Ca _v 1.2 floxed, rAAV-Cre injisert slag viser en betydelig nedgang i genuttrykk (figur 1C). I tillegg har vi vist ved immunhistokjemisk analyse som rAAV-Cre kan knockout Ca _v 1.2 protein i musen hjernen ^18. Etter alle atferdsmessige analyser, bør mus bli transcardially perfused med 4% paraformaldehyde og fluorescerende immunhistokjemi bør utføres for grønt fluorescerende protein (GFP). Hvis bilaterale strukturer ble rettet, bør riktig bilateral plassering verifiseres av fluorescerende immunhistokjemisk farging (figur 1D, representant målretting av NAC). Hvis den riktige området har faktisk vært målrettet, bør farging bli visualisert utelukkende i den hensikt regionen og ikke utenfor den. Hvis en eller begge av injeksjoner er off-målet, bør være mus tilbakevirkendely ekskludert fra CPP datasettet. En annen strategi for visualisering av nøyaktig målretting av viral vektor-infiserte områder av hjernen og påfølgende disseksjon av det infiserte området for biokjemiske analyser, kan oppnås ved hjelp av en GFP-opplysende lommelykt som beskrevet i Li og Wolf (2011) ^19.

Figur 1A. Eksperimentell tidslinje av rAAV-Cre mikroinjeksjon og klimaanlegg sted preferanse oppkjøpet, utryddelse og gjeninnføringen faser. RAAV-Cre er microinjected inn i regionen av interesse 2-3 uker før oppstart av atferdsmessige testing. Kondisjonert sted preferanse begynner med en før-test for å fastslå noen innledende vinklinger, etterfulgt av 3 dager etter kondisjonering med kokain (10 mg / kg, ip). Fire timer etter hver kokain condition sesjon, muser behandlet med saltvann og begrenset til det motsatte kammer. Følgende dag testes mus for kjøp av en CPP. Utryddelse treningen begynner 24 timer senere og innebærer to daglige økter, som er atskilt med minst to timer, som tillater fri tilgang til hele apparatet. Når mus har nådd utryddelse kriteriet, blir de administrert en grunning injeksjon av kokain (10 mg / kg, ip) og deres tid i alle kamrene i apparatet er vurdert til å teste for oppfriskning av kokain-søkende oppførsel. Figur 1B. Representative resultatene av baseline, ble oppkjøpet, utryddelse trening, og gjeninnsettelse. WT C57BL/6J mus behandlet med kokain i løpet av dag 2, 3 og 4 av klimaanlegg. Mus utstilt oppkjøpet, utryddelse og kokain-indusert oppreisning (10 mg / kg ip kokain prime). *** P <0,001 sammenlignet med grunnlinjen (B), # p <0,05 versus anskaffelse (A). Baseline, B; Acquisition, A; Extinction, E; reaktivering, R. figur 1C. Stereotaxic levering av rAAV-Cre-GFP i NAc av Ca _v 1.2 floxed mus betydelig redusert Ca _v 1.2 mRNA. Homozygote Ca _v 1.2 floxed mus ble microinjected med kontroll (rAAV-GFP) eller eksperimentell (rAAV-Cre-GFP) virale vektorer . Etter maksimal Cre aktivering, ble musene ofret, og mRNA ble isolert og relative ekspresjonsnivåer ble undersøkt via kvantitativ polymerasekjedereaksjon ved hjelp av Ca _V 1.2 spesifikke primere. Stereotaxic levering av rAAV-Cre-GFP i NAc av Ca _v 1.2 floxed mus betydelig redusert Ca _v 1.2 mRNA nivåer, sammenlignet med mus injisert med AAV-GFP. † † p <0,001 versus rAAV-GFP. Figur 1D. Nevroner microinjected med rAAV-GFP i musen NAc. Homozygote Ca _v 1.2 floxed mus ble microinjected med rAAV-GFP å sjekke for riktig bilateral plassering i NAc. Mus ble perfundert med 4% PFA og immunhistokjemi ble utført. GFP flekker demontes skikkelig bilateral målretting av NAc. Klikk her for å se større figur .

Discussion

Regionalt og timelig-spesifikt gen ablasjon via stereotaxic mikroinjeksjon av virale vektorer kombinert med CPP som inkluderer utryddelse og gjeninnsettelse faser åpner for gransking av de spesifikke bidrag fra gener til tre distinkte faser av vanedannende-lignende oppførsel. Mens betinget knockout som er oppnådd utnytte den tradisjonelle Cre-LoxP gir for spatio-timelig begrenset genet ablasjon, stereotaxically microinjecting Cre-recombinase i diskrete hjernen områder av floxed mus åpner for enda strammere kontroll over når og hvor et gen er slått ut. I tillegg omgår denne muligheten for kompensatoriske endringer som oppstår under utvikling, som noen ganger står for begrenset fenotypisk variasjon observert i knockout mus. Videre kan bruke årskull av mus som ble microinjected på ulike tidspunkter i løpet av atferd tillate årsakssammenhenger skal gjøres mellom en endring i genuttrykk og en endring i atferd. Importantly, kan denne teknikken brukes på flere forskjellige kokain atferdsmessige paradigmer inkludert selvstendig administrasjon og psykomotorisk allergi.

Det er viktig å vente i minst 10-14 dager etter operasjoner for å sikre at maksimal aktivering av Cre recombinase har oppstått ^20. Begynnelsen atferdsmessige testing før dette kan resultere i bruk av mus med en ukjent mengde av sub-maksimal Cre ekspresjon, noe som gjør atferdsmessige funn vanskelige å tolke. Maksimal aktivering av Cre resulterte i en fullstendig utstansing av et gen, men dette skjer bare i celler som er faktisk infisert. Avhengig av volumet og titer av den virale vektor, blir ca 50-70% av celler infisert for et område som resulterer i den tilsvarende mengden av mRNA og protein svekning som kan føre til en viss rest-genekspresjon (figur 1C). Vi har imidlertid vist at en 50-60% mRNA denne type knockout er tilstrekkelig til å endre ekspresjonav psykomotorisk sensibilisering ^14. Dessuten er denne metoden ideell for lengre atferdsmessige paradigmer som en gang Cre aktivering skjer in vivo, varer dens uttrykk og tilsvarende genet knockout i minst 6 måneder ^21.

Hvis man er interessert i å undersøke rollen av et gen over en mer diskret tidsperiode er imidlertid at ikke mulig med denne metode. For kortere tids uttrykk, herpes simplex virus (HSV) vektorer kan brukes, som preferensielt infisere nevroner ^22.. Sammenlignet med rAAV uttrykk for Cre recombinase, som vedvarer i lengre perioder som arrangøren ikke er forstummet etter dager eller uker i vivo ^23, er HSV vektorer foretrukket for forbigående uttrykk som de uttrykker in vivo for dager. HSV vektorer er også fordelaktige ved at de viser bred transduksjon effektivitet og at helper virus-frie bestander eksistere ^22.. Videre kan HSV vektorer også uttrykker Cre recombinase og videreformidle eksisjon av floxed sekvenser både i kultur og in vivo ^24. Imidlertid har cytotoksisitet leilighetsvis blitt funnet.

Nesten enhver region i hjernen kan være målrettet ved hjelp av denne mikroinjeksjon teknikken. Ved forsøk på å målrette mindre underområder innenfor et større område, kan man trenger for å optimalisere mengden av viral vektor anvendes. For eksempel microinjected vi 0,5 mL av rAAV-Cre-GFP å målrette NAc og ventral tegmentale området (VTA) ^14, mens når målretting større strukturer som for eksempel hippocampus og cortex, Ahmed og kolleger ²⁰ brukte 0,8 mL av rAAV-Cre. Alternativt utforske ulike serotype alternativer som hver har differensial spredning og smittsomhet egenskaper (se Choi et al. (2005) ²⁵ for anmeldelse) kan hjelpe til å målrette en mindre, mer definert område. Omvendt, hvis forsøker å målrette et større område, kan man øke volumet av virusvektor microinjected. Dette har jegs mer effektiv enn å benytte høyere vektor titer som de trolig gi ytterligere infeksjoner per celle i motsetning til et høyere antall totale celler infisert ^22. I tillegg kan man utføre flere injeksjoner i en region, eller på tvers av flere områder, for mer effektivt å infisere et større område ^26..

Bruk av rAAV vektorer er også fordelaktig sammenlignet med andre virale vektorer som brukes til å undersøke hjernefunksjon og sykdom. Spesielt viste tradisjonelle adenovirus vektorer problematisk i at indusert de alvorlige inflammatoriske responser, mens andre vektorer som retrovirus og lentiviruses kan innebære problemer med innsettingen mutagenese. rAAV er en godartet parvovirus, og det er ingen kjent sykdom assosiert med rAAV infeksjon. Dessuten, i motsetning andre virale vektorer, oppstår transduksjon med rAAV uten uttrykk for innfødte AAV viral proteiner ^27, noe som gjør sekundære effekter på målceller mye mindre av en bekymring.rAAV vektorer kan bli produsert i høye titere og kan transduce post-mitotiske neuroner i hjernen i en svært lokalisert måte romlig ^21,28. Videre er rAAV vektorer nå blir generert som kan målrette bestemte undergrupper av nevroner i musen hjernen ²⁹ og Cre-avhengige rAAV ekspresjonssystemer blir også stadig mer utbredt (se Zhang et al. (2010) ³⁰ for gjennomgang).

I sammendraget, serverer kokain CPP som en enkel, men informativ atferdsmessige verktøy for å studere kokain kontekstuell læring relevant til oppkjøpet, utryddelse, og gjeninnføringen av kokain-søkende atferd. En kombinasjon av å benytte rAAV uttrykke Cre recombinase i mus bærer en floxed allel med CPP gir en kraftig strategi for å utforske rollen som mål gener i bestemte områder av hjernen som megle kokain søkende atferd.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Conditioned place preference activity chambers	Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA	MED-CPP-MS
Stereotaxic alignment system for mouse	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	model 900
Hamilton syringes	Hamilton Company, Reno, Nevada, USA	7634-01
rAAV2-Cre-GFP	Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA	7016
rAAV2-GFP	Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA	7004