Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Behavior

Stereotaxic mikroinjektion av virala vektorer som uttrycker Crerekombinas att studera betydelsen av mål gener i Cocaine miljöbetingad preferens

Published: July 30, 2013 doi: 10.3791/50600

Summary

I den här artikeln beskrivs hur du mikroinjicera virala vektorer i musen hjärnan och sedan testa i konditionerad platspreferens paradigm som innefattar ett förvärv, utplåning och återanställning fas.

Abstract

Microinjecting rekombinanta adenoassocierad virala (rAAV) vektorer som uttrycker Crerekombinas i distinkta regioner mushjärna att selektivt knockout intressanta gener möjliggör förbättrad tidsmässigt-och regionalt specifik kontroll av gendeletion, jämfört med befintliga metoder. Även villkorlig strykningen kan också uppnås genom parning möss som uttrycker Crerekombinas under kontroll av specifika genpromotorer med möss som bär en floxed gen, möjliggör stereotaxisk mikroinjektion för inriktning av diskreta hjärnområden hos försöksledaren fastställda tidpunkter av intresse. I samband med kokain miljöbetingad preferens, och andra kokain beteendemässiga paradigm såsom själv-administration eller psykomotorisk allergi som kan innebära indragning, utrotning och / eller faser återanställning, är denna teknik speciellt användbar i att utforska det unika bidraget av mål gener till dessa olika faser av beteendemönster hos kokain-inducerad plasticitet. Specifiktdenna teknik möjliggör selektiv ablation av målgener under diskreta faser av ett beteende för att testa deras bidrag till beteendet över tid. Ytterst kan denna förståelse för fler riktade terapi som bäst kan ta itu med de mest potenta riskfaktorer som presenterar sig under varje fas av beroendeframkallande beteende.

Introduction

Kokain är en starkt förstärkande psykostimulantia. Efter upprepad exponering, flera molekylära och cellulära anpassningar förekommer i belöning-relevant hjärnströmkrets som tros leda till tvångsmässigt drog-sökande uppförande, vilket fick höga återfall som utgör ett allvarligt kliniskt problem 1. Kokain utövar dessa långvariga effekter på beteendet genom att reglera genuttryck. För att studera de anpassningar som uppstår kronisk kokain har prekliniska djurmodeller använts i stor utsträckning. En sådan modell är den miljöbetingad preferens (CPP) paradigm. Denna modell innefattar utveckling av en lärd association mellan en tidigare neutral miljö och de belönande egenskaper kokain. Efter flera parningar av kokain med en särskild kammare, djuren tillåts att fritt utforska kokain-parade och icke-kokain-parade miljöer och om de föredrar drogen-parade fack, sägs de ha förvärvat en kokain-inducerad place företräde. Dessutom, efter en utdöende praktikperiod, kan detta paradigm kan användas för att studera kontextspecifik återanställning av kokain-sökande uppförande.

Jämfört med andra beteendemässiga modeller av beroendeframkallande-liknande beteende, såsom psykomotorisk sensibilisering, som används för att studera långsiktiga kokaininducerad beteende och molekylära plasticitet 2,3 och självstyret (SA), som är tänkt att mer exakt efterlikna beroendeframkallande -liknande beteende hos människor, är CPP paradigmet en enkel procedur att studera kokain kontextuellt lärande 4. CPP protokoll kan enkelt utökas till att omfatta utrotning och faser återanställning, på samma sätt som SA, som möjliggör undersökning av mekanismerna bakom narkotikabegär och återfall 5-7 och som tros rekapitulera aspekter av vad som sker i människans drog-sökande uppförande och narkotika - och cue-induced återfall 8-10.

En mekanism bakom detkokain-inducerad beteende plasticitet som är kännetecknande för varje distinkta faser av CPP, inklusive förvärv, utplåning, och återanställning, är aktivering av unika signaturer av genuttryck inom olika områden i hjärnan. För att direkt testa vilka gener inom belöning-relevanta områden i hjärnan förmedlar kokaininducerad beteendeförändringar, är det bra att kunna manipulera dem selektivt i ett regionalt-specifikt sätt. Ett sätt att uppnå detta är att mikroinjicera rekombinanta adenoassocierad virala (rAAV) vektorer som uttrycker Crerekombinas med stereotaktisk kirurgi, i distinkta områden i hjärnan på möss som har målgener flankeras av loxP-ställen (floxed möss). Denna metod möjliggör en mycket exakt temporal och regional kontroll över när och var gener ablation, både delande och icke delande nervceller, utan att inducera immunsvar 11-13. Denna nivå av kontroll är en viktig fördel jämfört med traditionella Cre-LoxP teknik för avel floxed möss wed möss som uttrycker Cre-rekombinas under kontroll av en endogen gen promotor, i att tidpunkten och distribution av gendeletion kan mer hårt reglerad. Dessutom kringgår viral vektor-medierad genknockout potentiella utvecklingsmässiga kompenserande effekter som kan uppstå med traditionella knockout strategier.

Förutom kokain CPP, som beskrivs här, mikroinjektion av rAAV-Cre i hjärnan hos floxed möss för att bedöma betydelsen av specifika gener kan appliceras ubiquitously till beteendemässiga paradigm som involverar separata faser, inklusive själv-administration och psykomotorisk sensibilisering. Till exempel har vårt laboratorium utnyttjat rAAV-Cre-teknik för att studera rollen av Ca v 1,2 L-typ Ca 2 +-kanaler i kokain psykomotorisk sensibilisering 14. Specifikt rAAV-Cre mikroinjiceras in i kärnan accumbens (NAc) av möss med den gen som kodar Ca v 1.2 floxade, för att visa att Ca v 14,15. Däremot kan den rAAV-Cre strategi inte användas om möss med en floxed gen av intresse inte finns, så var vår erfarenhet vid bedömningen roll Kalifornien V 1.3 L-typ Ca2 +-kanaler i psykomotorisk sensibilisering. Därför, presenterar en begränsning av användning av rAAV-Cre själv om villkorliga möss inte existerar för en speciell gen av intresse. Men rAAVs som uttrycker siRNA kan användas för att gener knockdown mål, som vi har gjort för att undersöka betydelsen av Kalifornien V 1.3 kanaler 14,15.

Microinjecting rAAV-Cre i diskreta hjärnan regioner floxed möss och sedan testa dem i CPP paradigm tillåter utredning av de specifika gener som förmedlar de olika faserna av beroendeframkallande-liknande beteende och där de agerar. Användning av detta paradigm har hjälpt i vår förståelse av hur upprepad kokain administration i huvudsak kapar brains belöning kretsar orsakar maladaptiv förändringar i molekylära signaltransduktionsvägar och genuttryck som leder till missbrukare tillståndet 1,16,17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla procedurer utförs i enlighet med Weill Cornell Medical College Institutional Animal Care och användning utskottet för arbetsordningen.

Ett. Förberedelser och inställningar för Stereotaxic Leverans av virala vektorer

  1. Om ett instrument, steril kompress eller handen bär steril handske är förorenad genom att komma i kontakt med en icke-steril yta, kasta eller omsterilisera instrumentet med hjälp av en varm pärla autoklav, kasta pinnen eller byta till nya sterila handskar.
  2. Placera en mus bur med strö på ett värmeblock att värma för postoperativ återhämtning.
  3. Konfigurera rakapparat för rakhuvud och etanol och jod för att sterilisera hårbotten.
  4. Torka örat barer och mun tag i stereotax med 70% etanol.
  5. Med hjälp av en 5 pl Hamilton sprutan, upprätta 5 pl viral vektor (1 x 10 6 viruspartiklar / mikroliter) och inrättades spruthållare på stereotax.
  6. Microwave värmedyna eller aktivera elektrisk dyna på ena plats på stereotax. Täck med en ren, absorberande dyna för att minska risken för brännskador. Övervaka musen kroppstemperatur (mellan 97-99,5 ° F) ofta under förfarandet.
  7. Injicera mus (vägande mellan 22 till 35 g) med en blandning av ketamin (100 mg / kg) och xylazin (20 mg / kg). När en mus är sövda, att nypa svans spets kontrollera musens reflexer och notera någon rörelse eller reaktion så att musen är tillräckligt sövd.
  8. Raka huvudet mellan öron och ögon.
  9. Rengör rakat huvud med omväxlande etanol och jod sterila bomull applikatorer.
  10. Överför musen till uppvärmd pad på stereotax.

2. Stereotaxic mikroinjektion av virala vektorer

  1. Bär sterila handskar under hela operationen. Om handskarna är kontaminerade vid varje punkt genom att peka icke-sterila ytor, byta handskar.
  2. Noll tand bar och örat skalor bar.
  3. Ställ tänder tand bar.
  4. Skruva i nospartiet. Om vickar eller morrhår flyttaning noteras när som helst, administrera en IP boosterdos (~ 0,05 cc) av en blandning av ketamin (100 mg / kg) och xylazin (20 mg / kg).
  5. Skruva i örat barer.
  6. Smörj ögon med PuraLube.
  7. Skär öppna hårbotten till strax bakom öronen med en skalpell.
  8. Placera bulldog klipp på hörnen av hårbotten till skal huden från skallen. Bregma och lambda ska vara väl synliga.
  9. Kontrollera sutur från bregma till lambda riktas rakt. Om suturen är krokig justera om positionering av huvudet.
  10. Kontrollera att alla inställningar på stereotax nollställs.
  11. Sätt nålspets på plats vid bregma.
  12. Mät alla koordinaterna för både bregma och lambda. Detta inkluderar rygg / ventral, mediala / laterala och främre / bakre koordinater.
  13. Justera huvudet tills de ventrala koordinaterna för bregma och lambda ligger inom 0,02 mm från varandra.
  14. När linje, går från bregma medialt ut till de mediala / laterala (M / L) koordinater. Se tillde vänstra och högra sidorna är uppriktade inom 0,02 mm från varandra.
  15. Re-center nålspets på bregma och därifrån rör sig i den främre / bakre (A / P) riktning till önskad främre / bakre koordinat.
  16. Om det behövs, vinkel nål i en riktning och se till stereotax är låst. Gå ut till vänster M / L koordinat (+ / - 1,52)
  17. Mät den ventrala positionen för toppen av skallen för att använda som en referens efter att borrhålen borras.
  18. Borra ett borrhål med en steril borr vid önskad koordinat. Kontrollera att nålen kan komma in utan avbrott genom skallen.
  19. Sänk ner nålen till önskad ventrala koordinat.
  20. När koordinat uppnås, dip 0.015 mm nedan för ~ 10 sekunder för att skapa en liten ficka för viral vektor.
  21. Injicera önskad volym av virusvektor med en hastighet av ~ 0,1 | il / min. Vänta 3 min för virusvektor att diffundera helt. Höj nålspetsen 0,015 mm och vänta ytterligare 2 min.
  22. Doppa nålen (om gör vinklade injektioner) i motsatt riktning. Återigen, registrera den ventrala position som en referens för den övre delen av skallen.
  23. Upprepa samma steg som på första sidan att injicera viral vektor på motsatt sida (om att göra bilaterala injektioner).
  24. Applicera benvax till båda hålen för att täta dem med hjälp av trä slutet av en steril bomull applikatorspets.
  25. Sutur hårbotten.
  26. Ansök nervblockad till skadade området.
  27. Ta bort musen från stereotax och plats i värmde bur på värme blocket att återhämta sig under 45 minuter.
  28. Övervaka med avseende på tecken på smärta, inklusive: minskad total aktivitet eller rastlöshet, minskad mat och vattenförbrukning eller ökad läte. Buprenorfin (0,05-0,2 mg / kg) administreras två gånger dagligen under en vecka om det är nödvändigt för smärta. Godtagbara alternativ inkluderar: meperidine (20-60 mg / kg), pentazocin (10 mg / kg), nalbufin (4-8 mg / kg).

Tre. Miljöbetingad preferens: FÖRVÄRVN, Utrotning, och Återinför

  1. Placera möss i den centrala avdelningen av en tre-kammare platspreferens apparater (Med Associates Inc., St Albans, VT, USA) för en 60 sek tillvänjning period med giljotindörrar stängda.
  2. Efter tillvänjning, öppna giljotindörrar och låta mössen fri utforskning av alla 3 kammare för 1.200 sek, med tid i varje kammare är inspelade med MedPC IV programvara (Med Associates, Inc.).
  3. Tilldela möss konditionering kammare baserat på deras prestationer under pre-testet. Använda en vinklad design, administration par drogen under de efterföljande tre dagarna med facket som var minst föredragna under baslinjen förtest.
  4. Under de kommande 3 konditionering dagarna, injicera möss med kokain (10 mg / kg, ip) under förmiddagen och begränsar dem i deras tilldelade kammare för 1.200 sekunder omedelbart efter injektionen. Återgå möss till sina hem burar efter sessionen. Efter 4 h, injicera möss med saltlösning (0,01 ml / gkroppsvikt) och begränsa dem till motsatt kammaren för 1.200 sek eftermiddagen.
  5. För att testa för förvärv, slutet utrymme möss i den centrala kammaren med giljotindörrar för en 60 sek tillvänjning period. Öppna giljotindörrar och tillåter fri prospektering för 1.200 sek, med tiden i alla kamrar registrerats av MedPC IV programvara (Med Associates, Inc.). Beräkna företräde genom att subtrahera mängden tid som tillbringas i saltlösning-parade kammaren från den tid som tillbringas i kokain-parade kammare.
  6. För att släcka platspreferens, utsätta möss till två 20 min sessioner fri utforskning dagligen i samma apparat, separerade med minst 2 tim, med början 24 timmar efter testet för förvärvet. Tid i alla kamrar bör återigen noteras och storleken på den initiala CPP bör jämföras med den för varje utsläckningssession.
  7. Bestäm om möss har släckt läkemedelsinducerad önskemål genom att bedöma huruvida preferens för ett parskilt kammare över två på varandra följande utrotning dagar är betydligt lägre jämfört med förvärvet preferenspoäng.
  8. Reinstate möss med en primär dos av kokain (5 eller 10 mg / kg, ip) och återexponera till apparaten tillåter fri utforskning och registrera tiden i varje fack.
  9. Administrera Euthasol eutanasilösning (150 mg / kg). Transcardially BEGJUTA möss med 4% paraformaldehyd (PFA) och utför en histologisk undersökning för att validera korrekt mikroinjektion placering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CPP

Efter att ha utfört CPP om mikroinjicerade möss, bör man kontrollera att den kohort av kontroll-injicerade (rAAV-GFP) möss normalt har förvärvat preferens för drog-parade kammare (Figur 1A, 1B). Möss anses ha förvärvat preferens för en viss avdelning när kokain preferenser (tid i kokain-parade kammare minus tid i saltlösning-parade kammare) är betydligt högre jämfört med baseline preferenspoäng (Figur 1B, A vs B) . Om, som en kohort, gör kontroll-injicerade möss inte visa en preferens för kokain-parade kammare, eller visa en aversion, bör placeringen verifieras omedelbart via histologi (se rAAV Injektioner mom) och möss med felaktig placering skall kasseras.

Om företräde har normalt förvärvats av kontroll-injicerade kohorten, kan man förlänga därefter paradigm med början utdöende (Figur 1A (Figur 1B, E3, E4, E5 vs A). Vid denna tid, kan man återinsätta med ett läkemedel prim (Figur 1A, 1B). Om preferenspoäng efter administrering av läkemedlet Prime är statistiskt omöjlig att skilja från den vid förvärvet, då kohort sägs ha återinförde droginducerade preferens för drog-parade kammare (Figur 1B, R vs A).

rAAV mikroinjektioner

Före fullfölja rAAV-Cre experimentell strategi inom någon beteendevetenskaplig paradigm man bör kontrollera att rAAV-Cre har faktiskt slagit ut genen av intresse i mikroinjicerade möss genom qPCR (Figur 1C) och / eller western blot eller immunhistokemisk analys 18 </ Sup>. Till exempel, efter mikroinjektion av rAAV-Cre-GFP in i NAc av möss som hade den av L-typ kalciumkanal isoform Ca v 1,2 floxade, rAAV-Cre injicerade stansar visar en signifikant minskning i genuttryck (Figur 1C). Dessutom har vi visat genom immunohistokemisk analys att rAAV-Cre kan knockout Ca v 1.2 protein i mushjärna 18. Efter alla beteendemässiga analyser bör möss transkardiellt perfusion med 4% paraformaldehyd och fluorescerande immunohistokemi bör utföras för grönt fluorescerande protein (GFP). Om bilaterala strukturer riktade, bör lämplig bilateral placering kontrolleras av fluorescerande immunhistokemisk färgning (figur 1D, representativ inriktning av NAC). Om rätt område har verkligen varit riktade, bör färgning visualiseras uteslutande i det avsedda området och inte utanför den. Om en eller båda av injektionerna är off-target, bör möss vara retroaktivly undantas från CPP datamängden. En annan strategi för visualisering av noggrann inriktning av virala vektor-infekterade hjärnregioner och efterföljande dissektion av det smittade området för biokemiska analyser, kan uppnås med användning av en GFP-lysande ficklampa såsom beskrivs i Li och Wolf (2011) 19.

Figur 1
Figur 1A. Experimentell tidslinje av rAAV-Cre mikroinjektion och miljöbetingad preferens förvärv, upphörande och återinträde faser. RAAV-Cre mikroinjiceras i regionen av intresse 2-3 veckor före påbörjandet av beteendemässiga tester. Miljöbetingad preferens börjar med en pre-test för att fastställa eventuella initiala fördomar, följt av 3 dagars konditionering med kokain (10 mg / kg, ip). Fyra timmar efter varje kokain konditionering session, mössbehandlas med koksaltlösning och begränsas till det motsatta kammaren. Följande dag testas möss förvärv av CPP. Extinction träning börjar 24 timmar senare och omfattar 2 dagliga sessioner, som är separerade med minst 2 tim, som tillåter fri tillgång till hela apparaten. När möss har nått utrotning kriteriet, administreras de en priming injektion av kokain (10 mg / kg, ip) och deras tid i alla kamrarna i anordningen bedöms testet för återanställning av kokain-sökande uppförande. Figur 1B. Representativa resultat av baslinjen, var förvärv, utdöende utbildning, och återanställning. WT C57BL/6J-möss behandlades med kokain under dag 2, 3 och 4 av konditionering. Möss uppvisade förvärv, utplåning och kokaininducerad återinsättande (10 mg / kg ip kokain prime). *** P <0,001 jämfört med baseline (B), # p <0,05 jämfört med förvärv (A). Baseline, B, Förvärv, A, Extinction, E, återinförs, R. Figur 1C. Stereotaxic leverans av rAAV-Cre-GFP i NAC i Kalifornien V 1.2 floxed möss minskade betydligt Ca v 1.2 mRNA. Homozygota Kalifornien V 1.2 floxed möss injiceras med kontroll (rAAV-GFP) eller experimentell (rAAV-Cre-GFP) virala vektorer . Efter maximal Cre aktivering, avlivades mössen och mRNA isolerades och relativa expressionsnivåer undersöktes via kvantitativ polymeraskedjereaktion med användning av Ca v 1,2 specifika primrar. Stereotaxic leverans av rAAV-Cre-GFP i NAC i Kalifornien V 1.2 floxed möss minskade betydligt Kalifornien V 1.2 mRNA-nivåer, jämfört med möss som injicerats med AAV-GFP. † † p <0,001 jämfört med rAAV-GFP. Figur 1D. Nervceller mikroinjiceras med rAAV-GFP i mus NAc. Homozygota Kalifornien V 1.2 floxed möss injiceras med rAAV-GFP att kontrollera rätt bilateral placering i NAC. Möss perfuserades med 4% PFA och immunohistokemi utfördes. GFP färgning demonstrationsTES korrekt bilateral inriktning av NAC. Klicka här för att visa en större bild .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Regionalt och tidsmässigt-specifik gen ablation via stereotaktisk mikroinjektion av virala vektorer i kombination med CPP som inbegriper utrotning och faser återanställning möjliggör undersökning av de specifika bidrag gener till tre distinkta faser av beroendeframkallande-liknande beteende. Även villkorlig knockout som uppnås med användning av traditionella Cre-LoxP systemet ger rumsliga tidsmässigt begränsad gen ablation, stereotaxiskt microinjecting Cre-rekombinas i diskreta områden i hjärnan på floxed möss möjliggör ännu bättre kontroll över när och var en gen slås ut. Dessutom kringgår detta möjligheten av kompensatoriska förändringar under utvecklingen, som ibland står för begränsad fenotypisk variation observerades i knockout-möss. Dessutom kan användning av kohorter av möss som mikroinjicerades vid olika tidpunkter under uppförande möjliggöra orsakssamband som skall göras mellan en förändring i genuttryck och en förändring i beteendet. Importantly, kan denna teknik appliceras på flera olika kokain beteendemässiga paradigm däribland egna administrationen och psykomotorisk sensibilisering.

Det är viktigt att vänta minst 10-14 dagar efter operationer för att säkerställa att maximal aktivering av Crerekombinas har skett 20. Början beteendetestning före denna kan resultera i användningen av möss med en okänd mängd av sub-maximal Cre uttryck, vilket gör beteendemässiga fynd svåra att tolka. Maximal aktivering av Cre resulterar i fullständig knockout av en gen, men sker detta endast i celler som är i infekterade faktum. Beroende på volymen och titern av den virala vektorn, är cirka 50-70% av cellerna infekterades i en viss region resulterar i motsvarande mängd mRNA och protein knockout vilket kan leda till vissa kvarvarande genuttryck (Figur 1C). Vi har emellertid visat att en 50 till 60%-mRNA denna typ av knockout är tillräcklig för att förändra uttryckav psykomotorisk sensibilisering 14. Dessutom är denna metod idealisk för längre beteendemässiga paradigm som en gång Cre aktivering sker in vivo, varar dess uttryck och motsvarande genknockout i minst 6 månader 21.

Om man är intresserad av att undersöka rollen av en gen över en mer diskret tid dock, det är inte möjligt med just denna metod. För kortare sikt uttryck, herpes simplex virus (HSV) vektorer kan användas, som företrädesvis infekterar neuroner 22. Jämfört med rAAV uttryck av Cre rekombinas, som kvarstår under längre perioder eftersom promotorn inte tystas efter dagar eller veckor in vivo 23, är HSV vektorer föredras för övergående uttryck som de uttrycker in vivo i flera dagar. HSV vektorer är också fördelaktiga genom att de visa brett transduktion effektivitet och att hjälpar virusfria lagren är stora 22. Vidare kan HSV vektorer också uttrycka Cre recombinase och förmedlar excision av floxed sekvenser både i kultur och in vivo 24. Emellertid har enstaka cytotoxicitet påträffats.

Nästan varje region i hjärnan kan riktas med hjälp av denna mikroinjektionsteknik. När du försöker att rikta mindre delområden inom en större region, kan man behöva optimera mängden virus som används vektor. Till exempel mikroinjiceras vi 0,5 il rAAV-Cre-GFP att rikta NAC och ventrala tegmentumområdet (VTA) 14, medan när de riktar större strukturer såsom hippocampus och hjärnbarken, använde Ahmed och kollegor 20 0,8 pl rAAV-Cre. Alternativt, utforska olika serotyp alternativ som var och en har differentiell spridning och egenskaper smittsamhet (se Choi et al. (2005) 25 för granskning) kan hjälpa till att rikta en mindre, mer avgränsat område. Omvänt, om du försöker att rikta en större region, kan man öka volymen av viral vektor injiceras. Detta har jags mer effektiv än att använda högre vektor titrar som de sannolikt ge ytterligare infektioner per cell i motsats till ett högre antal totala celler infekterade 22. Dessutom kan man utföra flera injektioner inom en region, eller över flera regioner, för att mer effektivt infektera ett större område 26.

Användning av rAAV vektorer är också fördelaktigt i jämförelse med andra virala vektorer som används för att undersöka hjärnans funktion och sjukdom. Specifikt visade traditionella adenovirusvektorer problematiskt att de framkallade svåra inflammatoriska reaktioner, medan andra vektorer såsom retrovirus och lentivirus kan innebära problem med insertionsmutationer. rAAV är en godartad parvovirus och det finns ingen känd sjukdom associerad med rAAV-infektion. Dessutom, till skillnad från andra virala vektorer, inträffar transduktion med rAAV utan uttryck av nativa AAV virusproteiner 27, vilket gör sekundära effekter på målceller mycket mindre problematiska.rAAV vektorer kan produceras i höga titrar och kan transducera postmitotiska neuroner i hjärnan på ett mycket rumsligt lokaliserad sätt 21,28. Dessutom är rAAV vektorer nu genereras som kan rikta särskilda undertyper av nervceller i musen hjärnan 29 och Cre-beroende rAAV expressionssystem blir också mer allmänt används (se Zhang et al. (2010) 30 för granskning).

Sammanfattningsvis fungerar kokain CPP som en enkel men informativ beteendemässiga verktyg för att studera kokain kontextuella lärandet relevant för förvärvet, utplåning, och återanställning av kokain-sökande uppförande. En kombination av att utnyttja rAAV uttrycka Crerekombinas i möss som bär en floxed allel med CPP erbjuder en kraftfull strategi för att utforska rollen av mål gener i specifika delar av hjärnan som förmedlar kokain söker beteende.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Anni Lee och Maureen Byrne för deras hjälp med att etablera det förlängda betingad protokollet platspreferens.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Conditioned place preference activity chambers Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA MED-CPP-MS
Stereotaxic alignment system for mouse David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA model 900
Hamilton syringes Hamilton Company, Reno, Nevada, USA 7634-01
rAAV2-Cre-GFP Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA 7016
rAAV2-GFP Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA 7004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nestler, E. J. Molecular neurobiology of addiction. American Journal on Addictions. 10 (3), (2001).
  2. Thomas, M. J., Kalivas, P. W., Shaham, Y. Neuroplasticity in the mesolimbic dopamine system and cocaine addiction. British Journal of Pharmacology. 154 (2), (2008).
  3. Robinson, T. E., Browman, K. E., Crombag, H. S., Badiani, A. Modulation of the induction or expression of psychostimulant sensitization by the circumstances surrounding drug administration. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (2), (1998).
  4. Tzschentke, T. M. Measuring reward with the conditioned place preference (CPP) paradigm: update of the last decade. Addiction Biology. 12 (3-4), (2007).
  5. Mueller, D., Stewart, J. Cocaine-induced conditioned place preference: reinstatement by priming injections of cocaine after extinction. Behavioural Brain Research. 115 (1), (2000).
  6. Itzhak, Y., Martin, J. L. Cocaine-induced conditioned place preference in mice: Induction, extinction and reinstatement by related psychostimulants. Neuropsychopharmacology. 26 (1), (2002).
  7. Kreibich, A. S., Blendy, J. A. cAMP response element-binding protein is required for stress but not cocaine-induced reinstatement. Journal of Neuroscience. 24 (30), (2004).
  8. Obrien, C. P., Childress, A. R., McLellan, T., Ehrman, R. Integrating systematic cue exposure with standard treatment in recovering drug dependent patients. Addictive Behaviors. 15 (4), (1990).
  9. O'Brien, C. P., Childress, A. R., McLellan, A. T., Ehrman, R. A learning model of addiction. Research publications - Association for Research in Nervous and Mental Disease. 70, (1992).
  10. Stewart, J. Psychological and neural mechanisms of relapse. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 363 (1507), (2008).
  11. Bueler, H. Adeno associated viral vectors for gene transfer and gene therapy. Biological Chemistry. 380, (1999).
  12. Xiao, X., Li, J., McCown, T. J., Samulski, R. J. Gene transfer by adeno-associated virus vectors into the central nervous system. Experimental Neurology. 144 (1), (1997).
  13. Alexander, I. E., Russell, D. W., Spence, A. M., Miller, A. D. Effects of gamma irradiation on the transduction of dividing and nondividing cells in brain and muscle of rats by adeno-associated virus vectors. Human Gene Therapy. 7 (7), (1996).
  14. Schierberl, K., Hao, J., Tropea, T. F., Ra, S., Giordano, T. P., Xu, Q., Garraway, S. M., Hofmann, F., Moosmang, S., Striessnig, J., Inturrisi, C. E., Rajadhyaksha, A. M. Ca(v)1.2 L-Type Ca2+ Channels Mediate Cocaine-Induced GluA1 Trafficking in the Nucleus Accumbens, a Long-Term Adaptation Dependent on Ventral Tegmental Area Ca(v)1.3 Channels. Journal of Neuroscience. 31 (38), (2011).
  15. Schierberl, K., Giordano, T., Satpute, S., Hao, J., Kaur, G., Hofmann, F., Moosmang, S., Striessnig, J., Rajadhyaksha, A. Ca(v)1.3 L-type Ca2+ channels mediate long-term adaptation in dopamine D2L-mediated GluA1 trafficking in the dorsal striatum following cocaine exposure. Channels. 6 (1), 11-17 (2012).
  16. Nestler, E. J., Bergson, C. M., Gultart, X., Hope, B. T. Regulation of neural gene expression in opiate and cocaine addiction. NIDA Research Monograph. 125, (1993).
  17. Hyman, S. E., Malenka, R. C. Addiction and the brain: The neurobiology of compulsion and its persistence. Nature Reviews Neuroscience. 2 (10), (2001).
  18. Lee, A. S., Ra, S., Rajadhyaksha, A. M., Britt, J. K., De Jesus-Cortes, H., Gonzales, K. L., Lee, A., Moosmang, S., Hofmann, F., Pieper, A. A., Rajadhyaksha, A. M. Forebrain elimination of cacna1c mediates anxiety-like behavior in mice. Molecular Psychiatry. 17 (11), (2012).
  19. Li, X., Wolf, M. E. Visualization of virus-infected brain regions using a GFP-illuminating flashlight enables accurate and rapid dissection for biochemical analysis. Journal of Neuroscience Methods. 201 (1), 177-179 (2011).
  20. Ahmed, B. Y., Chakravarthy, S., Eggers, R., Hermens, W., Zhang, J. Y., Niclou, S. P., Levelt, C., Sablitzky, F., Anderson, P. N., Lieberman, A. R., Verhaagen, J. Efficient delivery of Cre-recombinase to neurons in vivo and stable transduction of neurons using adeno-associated and lentiviral vectors - art. no. 5. BMC Neuroscience. 5, (2004).
  21. Kaspar, B. K., Vissel, B., Bengoechea, T., Crone, S., Randolph-Moore, L., Muller, R., Brandon, E. P., Schaffer, D., Verma, I. M., Lee, K. F., Heinemann, S. F., Gage, F. H. Adeno-associated virus effectively mediates conditional gene modification in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2320-2325 (2002).
  22. Neve, R. L., Neve, K. A., Nestler, E. J., Carlezon, W. A. Use of herpes virus amplicon vectors to study brain disorders. Biotechniques. 39 (3), 9 (2005).
  23. Pohl, M., Braz, J. Gene therapy of pain: emerging strategies and future directions. European Journal of Pharmacology. 429 (1-3), (2001).
  24. Rinaldi, A., Marshall, K. R., Preston, C. M. A non-cytotoxic herpes simplex virus vector which expresses Cre recombinase directs efficient site specific recombination. Virus Research. 65 (1), (1999).
  25. Choi, V. W., McCarty, D. M., Samulski, R. J. AAV hybrid serotypes: Improved vectors for gene delivery. Current Gene Therapy. 5 (3), (2005).
  26. Passini, M. A., Dodge, J. C., Bu, J., Yang, W., Zhao, Q., Sondhi, D., Hackett, N. R., Kaminsky, S. M., Mao, Q. W., Shihabuddin, L. S., Cheng, S. H., Sleat, D. E., Stewart, G. R., Davidson, B. L., Lobel, P., Crystal, R. G. Intracranial delivery of CLN2 reduces brain pathology in a mouse model of classical late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis. Journal of Neuroscience. 26 (5), (2006).
  27. Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses - normal integration does not require viral gene-expression. Journal of Virology. 63 (9), (1989).
  28. Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., Omalley, K. L., During, M. J. Long-term gene-expression and phenotypic correction using adenoassociated virus vectors in the mammalian brain. Nature Genetics. 8 (2), (1994).
  29. Johansen, J. P., Hamanaka, H., Monfils, M. H., Behnia, R., Deisseroth, K., Blair, H. T., LeDoux, J. E. Optical activation of lateral amygdala pyramidal cells instructs associative fear learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (28), (2010).
  30. Zhang, F., Gradinaru, V., Adamantidis, A. R., Durand, R., Airan, R. D., de Lecea, L., Deisseroth, K. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nature Protocols. 5 (3), (2010).

Tags

Beteende neurovetenskap neurobiologi anatomi fysiologi medicinsk teknik medicin farmakologi djur genetiskt modifierade beteende djurs drog-sökande uppförande Psychophysiology Beteende och Beteende virala vektorer stereotaktisk kirurgi mikroinjektion betingad platspreferens mus uppförande neurovetenskap utplåning kokain-inducerad återanställning djurmodell
Stereotaxic mikroinjektion av virala vektorer som uttrycker Crerekombinas att studera betydelsen av mål gener i Cocaine miljöbetingad preferens
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A.More

Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference. J. Vis. Exp. (77), e50600, doi:10.3791/50600 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter