Summary
استخدام نموذج الذي يحاكي حالة من أمراض الرئة في البشر أمر بالغ الأهمية لدراسة الفيزيولوجيا المرضية و / أو مسببات مرض معين لتطوير والتدخل العلاجي. هنا يتم تقديم طريقة التنبيب داخل الرغامى موسع التي يمكن ان تنقل مباشرة إلى مواد خارجية الماوس الرئتين.
Abstract
استخدام نموذج الذي يحاكي حالة من أمراض الرئة في البشر أمر بالغ الأهمية لدراسة الفيزيولوجيا المرضية و / أو مسببات مرض معين لتطوير والتدخل العلاجي. مع تزايد توافر خروج المغلوب والمعدلة وراثيا ومشتقاتها، جنبا إلى جنب مع الكم الهائل من المعلومات الجينية، الفئران تقديم واحدة من أفضل النماذج لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء علم الأمراض وعلم وظائف الأعضاء من أمراض الرئة. استنشاق، الأنف تقطير، التقطير داخل القصبة الهوائية، وتنبيب داخل الرغامى هي أكثر التقنيات المستخدمة على نطاق واسع من قبل عدد من المحققين لإدارة المواد التي تهم الماوس الرئتين. هناك إيجابيات وسلبيات لكل تقنية تبعا لأهداف الدراسة. هنا يتم تقديم طريقة التنبيب داخل الرغامى موسع التي يمكن ان تنقل مباشرة إلى مواد خارجية الماوس الرئتين. تم تطبيق هذه التقنية لإدارة بليوميسين إلى الرئتين الماوس كنموذج لدراسة التليف الرئوي. </ ع>
Introduction
الرئة هو الجهاز حيث يتم تشخيص العديد من الأمراض المدمرة عادة. فيما بينها، وسرطان الرئة هو ثاني أكثر سرطان تشخيصها في كل من الرجال والنساء، والسبب الأكثر شيوعا للوفاة بالسرطان. مرض الانسداد الرئوي المزمن، والمعروف أيضا باسم انتفاخ الرئة والتهاب القصبات المزمن، هو مرض خطير جدا وثالث سبب رئيسي للوفاة في الولايات المتحدة. في عام 2011، أشارت التقديرات إلى أن 25900000 الأميركيين مصابون بالربو، بما في ذلك 7.1 مليون طفل دون سن 18 عاما. الربو هو السبب الرئيسي الثالث في المستشفى بين الأطفال الذين تقل أعمارهم عن 15 (جمعية الرئة الأمريكية، http://www.lung.org ). من أجل دراسة الفيزيولوجيا المرضية و / أو مسببات هذه الأمراض المدمرة وآلياتها الأساسية، واستخدام نماذج دقيقة أمر بالغ الأهمية بالتعاون مع إدارة مريحة وموسع من مواد مختلفة تهم الرئة. توفر الفئران واحدة من أفضل النماذج لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء علم الأمراض وعلم وظائف الأعضاء من أمراض الرئة بسبب توافر متزايد من خروج المغلوب والفئران المعدلة وراثيا وكمية هائلة من المعلومات الجينية المتاحة.
وقد استخدمت أساليب مختلفة من قبل عدد من المحققين في أماكن مختلفة لتقديم المواد التي تهم الرئتين الماوس، بما في ذلك الاستنشاق، الأنف تقطير، التقطير داخل القصبة الهوائية، وتنبيب داخل الرغامى 1-4. لم يستخدم الإجراء الأخير بشكل روتيني لأنه يعتبر من الصعب بدلا من أداء. التنبيب داخل الرغامى الموصوفة هنا هو أسلوب موسع وبسيطة، وسريعة لتقديم المواد التي تهم الماوس الرئتين من أجل دراسة تأثير المواد الموردة على أنماط التعبير الجيني، علم الأمراض و / أو علم وظائف الأعضاء من الرئة 5. هذا الأسلوب يؤكد تسليم المواد الخارجية إلى الرئة كلها، وليس فيها أي عملية جراحية، وبالتالي البقاء على قيد الحياة سوف likelذ تقره جميع لجان رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يصف بروتوكول التالية طريقة موسع وبسيطة، وسريعة لتقديم المواد التي تهم الماوس الرئتين. تمت الموافقة على هذا الإجراء من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام المعهد الوطني للسرطان.
1. خدر
- الأولى، تخدير الماوس باستخدام مزيج من الكيتامين وزيلازين (100 ملغ / كغ من وزن الجسم و 10 ملغم / كغم من وزن الجسم، على التوالي). هذا هو أوصى ACUC التخدير والجرعة. مع هذا المبلغ، والفئران هي اللاوعي على الأقل ل~ 20 دقيقة.
- تطبيق مرهم البيطرية للعيون من الفأرة من أجل منع جفاف العينين أثناء التخدير.
- بعد عدة دقائق، قرصة القدم من الفأرة للتحقق من وعيه. وأكد مرة اللاوعي، ضع الماوس على موقف التنبيب الزاوية في ~ 60 درجة ويثبت في مكانه بواسطة ربط القواطع العلوية على الشريط المطاطي صغيرة تقع في الجزء العلوي من المنصة.
2. التنبيب داخل الرغامى
ملاحظة: من أجل الحصول على طول مناسب من القسطرة لإدراجها، وقياس طول في البداية بين الفم ونقطة التشعب القصبي باستخدام الماوس الممارسة ذات حجم مماثل في وقت مبكر (الشكل 1). طول يعتمد إلى حد كبير على حجم الماوس. إدخال القسطرة يجب أن يتوقف فوق نقطة التشعب (~ 1.5 سم للماوس مع ~ 25 غرام من وزن الجسم). وهذا يضمن أن المواد مدخل أنبوب سوف تذهب إلى كل الفصوص. لا يقل عن 50 ممارسة هيئة التصنيع العسكريه قد تكون مطلوبة لشخص يؤدون التنبيب لإتقان هذه التقنية (يبرع يعني أن نسبة نجاح التنبيب هو أكثر من 95٪).
- مرة واحدة يتم إدخال القسطرة، بسرعة إزالة دليل ضوء الألياف البصرية من القسطرة للسماح الحيوان على التنفس بشكل طبيعي. عندما لا يتم استخدام نظام الإضاءة التنبيب، تضاف مباشرة على القسطرة كما هو موضح.
- إضافة محلول يحتوي على مواد الفائدة إلى القسطرة. تأكد من أن الحل هو السقوط في الرئة مباشرة بعد الإضافة. خمسين ميكرولتر ل~ يستخدم 25 غ الماوس وزن الجسم بشكل روتيني.
3. استعادة الحيوان
- بمجرد امتص الحل في الرئة، وإنزال الماوس من الموقف، ووضعها مرة أخرى في قفص الأصلي.
- مراقبة الماوس حتى يبدأ التحرك.
- أكد مرة واحدة أن الفأر هو في حالة جيدة، والعودة إلى القفص الرف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في البداية، تم استخدام الحل الأخضر مصبوغ التنبيب الفئران للممارسة. تم مقطوعة الرئة مباشرة بعد التنبيب لدراسة كيفية بالتساوي وزعت اللون في الرئة (الشكل 2). تم تطبيق هذه التقنية لدراسة التليف الرئوي الناتج عن بليوميسين باستخدام C57BL / 6 الفئران. عندما تم مدخل أنبوب الفئران intratracheally مع 1.2 U / كجم من بليوميسين أو المالحة، والتحكم وnecropsied 3 أسابيع في وقت لاحق، وضعت الفئران التي يسببها تليف بليوميسين طوال رئاتهم، بدعم من الأنسجة وزيادة محتوى الهيدروكسي (الشكل 3). تم تقييم المنطقة التالفة باستخدام الهدف 20X خلق الصور الرئة و121 نقاط الشبكة شعرية. احصيت عدد من التقاطعات (نقطة) الذي يسقط على المناطق الليفية ومعبرا عنه كنسبة مئوية من مجموع (121) نقطة. بلغت نسبة المناطق المتضررة وبالتالي تحسب متناسبة مع كمية تدار بليوميسين (الشكل 4).
"jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 1. توضيحات من الماوس القصبة الهوائية. أشرطة حمراء وتبين الأسهم طول حيث ينبغي أن تؤخذ في قياس قبل التنبيب باستخدام الماوس الممارسة. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 2. ظهور الرئة اليمنى بعد أن مدخل أنبوب مع الصبغة الخضراء. إذا يمكن أن ينظر إلى لون الصبغة في معظم أجزاء من الرئة، ويعتبر التنبيب ناجحة. ad/50601/50601fig2highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرقم 3. صور الممثل من الرئتين متليفة الناجمة عن التنبيب داخل الرغامى من بليوميسين. ومدخل أنبوب C57BL / 6 الفئران مع 1.2U/kg من بليوميسين (B، D) أو المالحة عن السيطرة (A، C) ورئاتهم تم فحص تشريحيا في يوم 21 إدارة ما بعد بليوميسين. التكبير: A، B: 40X؛ C، D: 100X. (E) هيدروكسي برولين المحتويات في الرئة تقاس في يوم 21 من أجل السيطرة وبليوميسين المعالجة الرئتين. N = 6، ***: P <0.001 اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
معشوقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 4. العلاقة بين الجرعة وبليوميسين المنطقة المتضررة من الرئة. زيادة جرعة من بليوميسين (0.5، 1، و 2 U / كجم) زيادة نسبيا نسبة المناطق المتضررة. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التنبيب داخل الرغامى الموصوفة هنا هو طريقة بسيطة، لكنها ممتازة موسع لتقديم بالتساوي المواد التي تهم الماوس الرئة. يسمح هذا الأسلوب دراسة تأثير و / أو دور المواد تدار على علم وظائف الأعضاء و / أو أمراض الرئة. المواد تدار يمكن أن تكون الجزيئات الذاتية مثل السيتوكينات، أو مواد خارجية مثل المواد الكيميائية أجنبي بيولوجيا / المخدرات، والمواد المسرطنة، والملوثات، المواد المثيرة للحساسية، أو الفيروسات التي تؤدي إلى مختلف الظروف الرئة التي قد تمثل نموذجا لدراسة مختلف الأمراض التي تصيب الإنسان 6-10. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية بالتعاون مع اتش المؤتلف أو الفيروسة البطيئة لإدخال أو حذف من overexpression من الجينات ذات الأهمية في الخلايا الظهارية الهوائية لدراسة دور هذه الجينات في التوازن، علم وظائف الأعضاء، علم الأمراض، و / أو التسرطن من الرئة. لا يمكن أن يتحقق تعطيل الجين بالإعراب عن عابر لجنة المساواة العرقية recombinase في الخلايا الظهارية لتعطيل الجين floxed من فيterest في الخلايا الظهارية 11.
يمكن بسهولة القسطرة إدراجها عن طريق الخطأ إلى المريء، الذي جنبا إلى جنب إلى القصبة الهوائية. في الطريقة الموصوفة هنا، ونظام الإضاءة التنبيب يقدم إرشادات إلى الموضع الصحيح حيث يجب أن يتم إدراج القسطرة 5. ويتكون النظام من الألياف الألياف البصرية متصل ثابت إلى مصدر الضوء، ونظام مصغر العدسات البصرية المصممة خصيصا التي تسمح للضوء أن تركز على الألياف الألياف البصرية. نهاية تسليم الألياف البصرية يلائم القسطرة الوريدية التي يتم التخلص منها تستخدم أنابيب داخل القصبة الهوائية. ويوفر هذا النظام إضاءة مباشرة من البلعوم، وتمكين التصور الواضح الحنجرة أثناء التنبيب. مرة واحدة يصبح بارعا في تنفيذ هذه التقنية باستخدام نظام الإضاءة، واستخدام النظام لم يعد ضروريا. الإجراء لا يمكن أن يؤديها بكفاءة مع القسطرة فقط، وكله عيتطلب rocedure سوى بضع دقائق. طريقة بالضبط نفس يمكن استخدامها للفئران مع نظام الإضاءة بحجم أكبر أو القسطرة.
ثلاث نقاط حاسمة للتوزيع بالتساوي المواد في جميع أنحاء الرئة. الأولى، وقياس طول دائما بين الفم ونقطة التشعب القصبي قبل التنبيب من أجل الحصول على فكرة عن مدى عمق وينبغي إدراج القسطرة باستخدام الماوس الممارسة (الشكل 1). لأن هذا يعتمد إلى حد كبير على حجم الماوس، يمكن استخدام نفس طول الإدراج مرة واحدة يتم تحديد ذلك بالنسبة للفئران من حجم معين. الثانية، تأكد من أن المحلول المضاف إلى وامتص أنبوب التنبيب الحق بعد إضافة لها. إذا تم إدخال أنبوب التنبيب عن طريق الخطأ إلى المريء، لن يكون امتص الحل على الفور وبالتالي البقاء في الأنبوب. وإذا حدث ذلك، كرر العملية برمتها من التنبيب. هذه العملية تأكيدا يؤكد أن الحل هو في القصبة الهوائية، ولكن ليس فيالمريء. يمكن للمشغل محاولة 3X كحد أقصى لتكرار الإجراء التنبيب كله إذا لم يتم امتص الحل في الرئة. ومع ذلك، إذا كان هذا يحدث في كثير من الأحيان، فمن المستحسن أن نعود إلى الممارسة للحصول على أعلى معدل نجاح. وأخيرا، ينبغي أن يكون فاقدا للوعي أثناء التنبيب الفئران، والتي يؤكد أن الماوس لن تنخم ما كان مدخل أنبوب. في هذا المعنى، فمن غير المستحسن استخدام isoflurane ومع مخروط الأنف، والتي قد تتداخل أيضا مع التنبيب جسديا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل برنامج بحوث جماعية للمعهد الوطني للسرطان، ومركز أبحاث السرطان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KetaVed | Vedco | Ketamine | |
| AnaSed Injection 20 mg | LLOYD | Xylazine | |
| BioLite Stand | Braintree Scientific | RIS100 | For mice |
| BioLite Intubation Illumination System | Braintree Scientific | BIO MI-KIT | For mice |
| 22 G, 1 inch i.v. catheter | Terumo | SR-OX2225CA | For mice below 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used. |
| 20 G, 1 inch i.v. catheter | Terumo | SR-OX2025CA | For mice over 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used. |
References
- Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J. Vis. Exp. (73), e50318 (2013).
- Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS One. 7, e31359 (2012).
- Rayamajhi, M., Redente, E. F., Condon, T. V., Gonzalez-Juarrero, M., Riches, D. W., Lenz, L. L. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. (51), e2702 (2011).
- Riesenfeld, E. P., et al. Inhaled salmeterol and/or fluticasone alters structure/function in a murine model of allergic airways disease. Respir. Res. 11, 22 (2010).
- Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies. Contemp. Top. Lab Anim. Sci. 44, 52-55 (2005).
- Bonniaud, P., et al. Progressive transforming growth factor beta1-induced lung fibrosis is blocked by an orally active ALK5 kinase inhibitor. Am. J. Res. Crit. Care Med. 171, 889-898 (2005).
- Bivas-Benita, M., Zwier, R., Junginger, H. E., Borchard, G. Non-invasive pulmonary aerosol delivery in mice by the endotracheal route. Eur. J. Pharm. Biopharm. 61, 214-218 (2005).
- Haegens, A., et al. Myeloperoxidase deficiency attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung inflammation and subsequent cytokine and chemokine production. J. Immunol. 182, 7990-7996 (2009).
- Jackson, P., et al. Exposure of pregnant mice to carbon black by intratracheal instillation: toxicogenomic effects in dams and offspring. Mutat. Res. 745, 73-83 (2012).
- Bodewes, R., et al. Pathogenesis of Influenza A/H5N1 virus infection in ferrets differs between intranasal and intratracheal routes of inoculation. Am. J. Pathol. 179, 30-36 (2011).
- Winslow, M. M., et al. Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1. Nature. 473, 101-104 (2011).
