Summary
Het gebruik van een model dat de toestand van longziekten bij mensen nabootst is kritiek voor het bestuderen van de pathofysiologie en / of etiologie van een bepaalde ziekte en ontwikkelen van therapeutische interventie. Hier een niet-invasieve intratracheaal intubatie methode die direct exogene materialen kunnen leveren aan muizenlongen wordt gepresenteerd.
Abstract
Het gebruik van een model dat de toestand van longziekten bij mensen nabootst is kritiek voor het bestuderen van de pathofysiologie en / of etiologie van een bepaalde ziekte en ontwikkelen van therapeutische interventie. Met de toenemende beschikbaarheid van knockout en transgene derivaten, samen met een grote hoeveelheid genetische informatie, muizen verschaffen een van de beste modellen om de moleculaire mechanismen van de pathologie en fysiologie van longziekten te bestuderen. Inademing, intranasale instillatie, intratracheale instillatie, en intratracheale intubatie zijn de meest gebruikte technieken door een aantal onderzoekers om materialen van belang te dienen aan muizenlongen. Er zijn voor-en nadelen voor elke techniek, afhankelijk van de doelen van een studie. Hier een niet-invasieve intratracheaal intubatie methode die direct exogene materialen kunnen leveren aan muizenlongen wordt gepresenteerd. Deze techniek werd toegepast op bleomycine toedienen aan muizenlongen als model pulmonale fibrose te bestuderen. </ P>
Introduction
Lung is een orgaan waar veel verwoestende ziekten vaak worden gediagnosticeerd. Onder hen, longkanker is de tweede meest gediagnosticeerde kanker bij zowel mannen als vrouwen, en de meest voorkomende oorzaak van overlijden door kanker. Chronische obstructieve longziekte, ook bekend als emfyseem en chronische bronchitis, is een zeer ernstige ziekte en de derde doodsoorzaak in de Verenigde Staten. In 2011 werd geschat dat 25,9 miljoen Amerikanen had astma, waaronder 7,1 miljoen kinderen onder de leeftijd van 18. Astma is de derde belangrijke oorzaak van ziekenhuisopname bij kinderen onder de leeftijd van 15 (American Lung Association, http://www.lung.org ). Om de pathofysiologie en / of etiologie van deze verwoestende ziekte en de onderliggende mechanismen te bestuderen, het gebruik van nauwkeurige modellen is kritiek in combinatie met geschikte en niet-invasieve toediening van verschillende materialen plaats long. Muizen bieden een van de beste modellen tebestuderen van de moleculaire mechanismen van de pathologie en fysiologie van longziekten vanwege de toenemende beschikbaarheid van knockout en transgene muizen en een grote aanbod van genetische informatie.
Verschillende werkwijzen zijn gebruikt door een aantal onderzoekers in verschillende instellingen materialen plaats leveren aan muizenlongen, waaronder inhalatie, intranasale instillatie, intratracheale instillatie en intratracheale intubatie 1-4. De laatste procedure is niet routinematig gebruikt omdat het nogal moeilijk uitvoerbaar wordt beschouwd. Intratracheale intubatie hierin beschreven is een niet-invasieve, eenvoudige en snelle methode om materiaal van belang muizenlongen leveren om het effect van het geleverde materiaal op genexpressiepatronen, pathologie en / of fysiologie van de long 5 bestuderen. Deze techniek zorgt voor de levering van exogene materialen om een hele long en geen overleving chirurgie omvatten en zal dus likely toegelaten door een institutionele Animal Care en gebruik commissies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het volgende protocol beschrijft een niet-invasieve, eenvoudige en snelle methode om materiaal plaats leveren muizenlongen. Deze procedure werd goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite National Cancer Institute.
1. Anesthesie
- Eerst verdoven de muis met een mengsel van ketamine en xylazine (100 mg / kg lichaamsgewicht en 10 mg / kg lichaamsgewicht, respectievelijk). Dit is de aanbevolen ACUC anesthesie en dosering. Met dit bedrag, muizen onbewust tenminste voor ~ 20 minuten.
- Breng dierenarts zalf voor de ogen van de muis om het drogen van de ogen tijdens anesthesie voorkomen.
- Na enkele minuten, knijp een voet van de muis om te controleren op het bewustzijn. Eenmaal bevestigd onbewuste, plaatst u de muis op een intubatie stand een hoek van 60 ° en zijn plaats te houden door het inhaken van de bovenste snijtanden over een kleine rubberen band aan de bovenkant van de voet.
2. Intratracheale intubatie
Opmerking: Om de juiste lengte van de katheter worden ingebracht verkrijgen aanvankelijk de lengte tussen de mond en de bronchiale vertakkingspunt meten met een praktijk muis van een vergelijkbare grootte voren (figuur 1). De lengte hangt grotendeels af van de grootte van de muis. Insertie van de katheter boven het vertakkingspunt stop (-1,5 cm voor muizen met ~ 25 g lichaamsgewicht). Dit verzekert dat de geïntubeerde materiaal naar alle lobben. Minstens 50 praktijk mice kan nodig zijn voor een persoon die de intubatie te bekwamen in de techniek geworden (Vaardig betekent dat het slagingspercentage van intubatie is meer dan 95%).
- Zodra de katheter wordt ingebracht, snel de glasvezel-lichtgeleider verwijderen van de katheter, zodat het dier om normaal te ademen. Wanneer de intubatie Verlichtingssysteem niet wordt gebruikt, direct plaatst een katheter beschreven.
- Voeg een oplossing bevattende materiaal plaats op een katheter. Zorg ervoor dat de oplossing wordt meegezogen in de longen direct na toevoeging. Vijftig microliter voor ~ 25 g lichaamsgewicht van de muis wordt routinematig gebruikt.
3. Animal Recovery
- Zodra de oplossing wordt meegezogen in de long, take down de muis uit de stand, en zet het terug in de oorspronkelijke kooi.
- Let op de muis totdat het begint te bewegen.
- Eenmaal bevestigd dat de muis is in goede staat, terug de kooi aan een rek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aanvankelijk werd groen geverfd oplossing gebruikt om muizen te intuberen voor de praktijk. De long werd onmiddellijk gereseceerd na intubatie te onderzoeken hoe gelijkmatig de kleur in de long (figuur 2) werd verdeeld. Deze techniek werd toegepast op bleomycine-geïnduceerde longfibrose bestuderen met C57BL / 6 muizen. Toen de muizen intratracheaal werden geïntubeerd met 1,2 U / kg bleomycine of zoutoplossing als controle en necropsie 3 weken later, de muizen ontwikkelde bleomycine geïnduceerde fibrose gedurende hun longen, ondersteund door histologie en de verhoogde hydroxyprolinegehalte (figuur 3). Het beschadigde gebied werd geëvalueerd met behulp 20X doelstelling gecreëerd long beelden en een 121-punten rooster net. Het aantal kruispunten (punten) omvallen van de vezelachtige gebieden werden geteld en uitgedrukt als percentage van het totaal (121) punten. Het percentage aldus geteld de beschadigde gebieden was evenredig met de hoeveelheid bleomycine toegediend (figuur 4).
"Jove_content" fo: keep-together.within-page = "altijd"> 
Figuur 1. Illustratie van de muis luchtpijp. De rode balken en pijlen geven de lengte waar de meting moet worden genomen voordat intubatie met behulp van een praktijk muis. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 2. Uiterlijk van long recht na te zijn geïntubeerd met groene kleurstof. Als de kleurstof kleur zichtbaar in de meeste delen van de long, intubatie wordt als succesvol beschouwd.ad/50601/50601fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 3. Vertegenwoordiger beelden van fibrotische longen veroorzaakt door intratracheale intubatie van bleomycine. C57BL / 6 muizen werden geïntubeerd met 1.2U/kg bleomycine (B, D) of zoutoplossing als controle (A, C) en de longen histologisch op dag 21 na bleomycine toediening onderzocht. Vergroting: A, B: 40X, C, D: 100X. (E) hydroxyprolinegehalte per long gemeten op dag 21 voor controle en bleomycine behandelde longen. N = 6, ***:. P <0,001 Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 4. Relatie tussen bleomycine dosis en beschadigde gebied van de long. Verhoogde dosis van bleomycine (0,5, 1 en 2 U / kg) evenredig toe het percentage van beschadigde gebieden. Klik hier voor grotere afbeelding .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KetaVed | Vedco | Ketamine | |
| AnaSed Injection 20 mg | LLOYD | Xylazine | |
| BioLite Stand | Braintree Scientific | RIS100 | For mice |
| BioLite Intubation Illumination System | Braintree Scientific | BIO MI-KIT | For mice |
| 22 G, 1 inch i.v. catheter | Terumo | SR-OX2225CA | For mice below 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used. |
| 20 G, 1 inch i.v. catheter | Terumo | SR-OX2025CA | For mice over 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used. |
References
- Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J. Vis. Exp. (73), e50318 (2013).
- Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS One. 7, e31359 (2012).
- Rayamajhi, M., Redente, E. F., Condon, T. V., Gonzalez-Juarrero, M., Riches, D. W., Lenz, L. L. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. (51), e2702 (2011).
- Riesenfeld, E. P., et al. Inhaled salmeterol and/or fluticasone alters structure/function in a murine model of allergic airways disease. Respir. Res. 11, 22 (2010).
- Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies. Contemp. Top. Lab Anim. Sci. 44, 52-55 (2005).
- Bonniaud, P., et al. Progressive transforming growth factor beta1-induced lung fibrosis is blocked by an orally active ALK5 kinase inhibitor. Am. J. Res. Crit. Care Med. 171, 889-898 (2005).
- Bivas-Benita, M., Zwier, R., Junginger, H. E., Borchard, G. Non-invasive pulmonary aerosol delivery in mice by the endotracheal route. Eur. J. Pharm. Biopharm. 61, 214-218 (2005).
- Haegens, A., et al. Myeloperoxidase deficiency attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung inflammation and subsequent cytokine and chemokine production. J. Immunol. 182, 7990-7996 (2009).
- Jackson, P., et al. Exposure of pregnant mice to carbon black by intratracheal instillation: toxicogenomic effects in dams and offspring. Mutat. Res. 745, 73-83 (2012).
- Bodewes, R., et al. Pathogenesis of Influenza A/H5N1 virus infection in ferrets differs between intranasal and intratracheal routes of inoculation. Am. J. Pathol. 179, 30-36 (2011).
- Winslow, M. M., et al. Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1. Nature. 473, 101-104 (2011).
