Summary
L'utilisation d'un modèle qui reproduit l'état de maladies pulmonaires chez les humains est essentielle pour l'étude de la pathophysiologie et / ou de l'étiologie d'une maladie particulière et pour développer une intervention thérapeutique. Voici une méthode d'intubation trachéale non invasive qui peut directement livrer les matériaux exogènes aux poumons de souris est présentée.
Abstract
L'utilisation d'un modèle qui reproduit l'état de maladies pulmonaires chez les humains est essentielle pour l'étude de la pathophysiologie et / ou de l'étiologie d'une maladie particulière et pour développer une intervention thérapeutique. Avec la disponibilité croissante de knock-out et transgéniques dérivés, avec une grande quantité d'information génétique, les souris offrent l'un des meilleurs modèles pour étudier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la pathologie et la physiologie des maladies pulmonaires. Inhalation, l'instillation intranasale, instillation intratrachéale, et l'intubation trachéale sont les techniques les plus couramment utilisées par un certain nombre de chercheurs pour administrer des matériaux d'intérêt pour les poumons de souris. Il ya des avantages et des inconvénients de chaque technique en fonction des objectifs de l'étude. Voici une méthode d'intubation trachéale non invasive qui peut directement livrer les matériaux exogènes aux poumons de souris est présentée. Cette technique a été appliquée à administrer de la bléomycine poumons de souris en tant que modèle pour l'étude de la fibrose pulmonaire. </ P>
Introduction
Poumon est un organe où de nombreuses maladies dévastatrices sont généralement diagnostiqués. Parmi eux, le cancer du poumon est le deuxième cancer le plus diagnostiqué chez les hommes et les femmes, et la cause la plus fréquente de décès par cancer. Maladie pulmonaire obstructive chronique, également connu sous l'emphysème et la bronchite chronique, une maladie très grave et la troisième cause de décès aux Etats-Unis. En 2011, il a été estimé que 25,9 millions d'Américains avaient l'asthme, y compris 7,1 millions d'enfants de moins de 18 ans. L'asthme est la troisième cause d'hospitalisation chez les enfants de moins de 15 ans (American Lung Association, http://www.lung.org ). Afin d'étudier la physiopathologie et / ou l'étiologie de ces maladies dévastatrices et leurs mécanismes sous-jacents, l'utilisation de modèles précis est essentiel, en liaison avec l'administration pratique et non invasif de divers matériaux d'intérêt pour les poumons. Souris offrent l'un des meilleurs modèles deétudier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la pathologie et la physiologie des maladies pulmonaires en raison de la disponibilité croissante des huitièmes de finale et des souris transgéniques et une grande quantité d'informations génétiques disponibles.
Diverses méthodes ont été utilisées par un certain nombre de chercheurs dans différents contextes pour livrer le matériel d'intérêt pour les poumons de souris, y compris l'inhalation, l'instillation intranasale, instillation intratrachéale, et l'intubation trachéale 1-4. Cette dernière procédure n'a pas été utilisée en routine car il est considéré comme assez difficile à réaliser. Intubation intratrachéale décrite ici est une méthode non invasive, simple et rapide pour livrer les matériaux d'intérêt pour les poumons de souris afin d'étudier l'effet des matériaux livrés sur les profils d'expression génique, la pathologie et / ou la physiologie de poumon 5. Cette technique assure la livraison de matériaux exogènes à un ensemble de poumon et n'implique pas une intervention chirurgicale de survie et donc sera likely être approuvé par les comités de protection des animaux et l'utilisation institutionnels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Le protocole suivant décrit une méthode non invasive, simple et rapide pour livrer les matériaux d'intérêt pour les poumons de souris. Cette procédure a été approuvée par le Comité de protection et d'utilisation des animaux par l'Institut national du cancer.
Une. Anesthésie
- Tout d'abord, anesthésier la souris en utilisant un mélange de kétamine et de xylazine (100 mg / kg de poids corporel et 10 mg / kg de poids corporel, respectivement). C'est le ACUC recommandé l'anesthésie et de la dose. Avec ce montant, les souris sont inconscientes au moins pour ~ 20 min.
- Appliquer vétérinaire pommade pour les yeux de la souris afin d'éviter le dessèchement des yeux pendant l'anesthésie.
- Après plusieurs minutes, pincer un pied de la souris pour vérifier la conscience. Une fois confirmé inconscient, placez la souris sur un stand d'intubation angle à ~ 60 ° et le maintenir en place en accrochant ses incisives supérieures sur une petite bande de caoutchouc situé en haut de la cage.
2. Intubation intratrachéale
Remarque: Afin d'obtenir la bonne longueur du cathéter doit être inséré, mesurer un premier temps la longueur entre la bouche et le point de bifurcation bronchique en utilisant une souris d'exercice d'une taille similaire à l'avance (figure 1). La longueur dépend largement de la taille de la souris. L'insertion du cathéter doit s'arrêter au-dessus du point de bifurcation (~ 1,5 cm pour les souris avec ~ 25 g de poids corporel). Cela garantit que le matériau intubé ira à tous les lobes. Au moins 50 pratiques microe peut être nécessaire pour une personne qui effectue l'intubation pour devenir compétent dans la technique (Maîtrise signifie que le taux d'intubation de réussite est de plus de 95%).
- Une fois le cathéter est inséré, retirez rapidement le guide de lumière à fibres optiques de la sonde à permettre à l'animal de respirer normalement. Lorsque le système d'intubation d'illumination n'est pas utilisé, directement insérer un cathéter tel que décrit.
- Ajouter une solution contenant des matériaux d'intérêt pour un cathéter. Assurez-vous que la solution est aspiré dans les poumons immédiatement après l'addition. Cinquante microlitres de ~ 25 g de poids corporel de la souris est couramment utilisée.
3. Récupération animale
- Dès que la solution est aspirée dans les poumons, prendre vers le bas de la souris de son support, et de le remettre dans la cage d'origine.
- Observez la souris jusqu'à ce qu'il commence à se déplacer.
- Une fois confirmé que la souris est en bon état, retournez la cage sur une grille.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Initialement, solution vert-teinte a été utilisé pour intuber les souris pour la pratique. Le poumon a été réséquée immédiatement après l'intubation pour examiner le degré d'uniformité de la couleur a été distribué dans les poumons (Figure 2). Cette technique a été appliquée à l'étude de la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine en utilisant souris C57BL / 6. Lorsque les souris ont été intubés par voie intratrachéale avec 1,2 U / kg de bléomycine ou de solution saline en tant que témoin et autopsiés 3 semaines plus tard, les souris ont développé une fibrose induite par la bléomycine tout au long de leurs poumons, soutenue par l'histologie et la teneur en hydroxyproline accru (figure 3). La zone endommagée a été évaluée en utilisant l'objectif 20X créé des images pulmonaires et une grille en treillis 121 points. Le nombre d'intersections (points) tombant sur les zones fibreuses ont été comptés et exprimés comme le pourcentage du nombre total de points (121). Le pourcentage des zones endommagées ainsi comptées était proportionnelle à la quantité administrée de la bléomycine (figure 4).
"Jove_content" fo: keep-together.within page = "always"> 
Figure 1. Illustration de la trachée de la souris. Les barres rouges et des flèches indiquent la longueur où la mesure doit être prise avant l'intubation à l'aide d'une souris de pratique. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 2. Apparence du poumon droit après avoir été intubé avec un colorant vert. Si la couleur du colorant est visible dans la plupart des régions du poumon, l'intubation est considérée comme réussie.ad/50601/50601fig2highres.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 3. Des images représentatives des poumons fibrotiques induites par intubation trachéale de bléomycine. C57BL / 6 ont été intubés avec 1.2U/kg de la bléomycine (B, D) ou une solution saline comme contrôle (A, C) et leurs poumons ont été examinés histologiquement 21 jours d'administration post-bléomycine. Agrandissement: A, B: 40X, C, D: 100X. (E) Hydroxyproline contenu par poumon mesurée au jour 21 pour le contrôle et la bléomycine traité poumons. N = 6, ***:. P <0,001 Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 4. Relation entre la dose de bléomycine et zone endommagée de poumon. Augmentation de la dose de bléomycine (0,5, 1, 2 et U / kg) proportionnellement augmenté le pourcentage de zones endommagées. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intubation intratrachéale décrit ici est une méthode non invasive simple, mais excellente pour fournir uniformément des matériaux d'intérêt pour les poumons de souris. Cette méthode permet l'étude de l'effet et / ou le rôle de la substance administrée sur la physiologie et / ou pathologie de cancer du poumon. Les matériaux administrés peuvent être des molécules endogènes tels que les cytokines, ou des matériaux exogènes tels que les produits chimiques xénobiotiques / médicaments, les substances cancérigènes, allergènes, polluants, ou des virus qui se traduisent par diverses affections pulmonaires qui peuvent représenter un modèle pour l'étude de diverses maladies humaines 6-10. Cette technique peut également être utilisée conjointement avec un adénovirus recombinant ou d'un lentivirus à introduire une surexpression ou une deletion de gènes d'intérêt dans les cellules épithéliales des voies aériennes pour étudier le rôle de ces gènes dans l'homéostasie, la physiologie, de la pathologie et / ou de la carcinogenèse du poumon. La perturbation d'un gène peut être obtenu en exprimant de manière transitoire la recombinase Cre dans les cellules épithéliales de perturber un gène dans des floxéintérêt dans les cellules epitheliales 11.
Un cathéter peut être facilement insérée à tort dans l'oesophage, qui est juxtaposée à la trachée. Dans la méthode décrite ici, le système d'éclairage intubation fournit des indications sur la position correcte où le cathéter doit être inséré 5. Le système est constitué d'une fibre de fibre optique qui est stable reliée à une source de lumière, et un système de lentille optique miniature spécialement conçu qui permet à la lumière de se concentrer sur la fibre de la fibre optique. L'extrémité de sortie de la fibre à fibre optique s'intègre dans les cathéters intraveineux jetables qui sont utilisés comme tubes intratrachéale. Ce système fournit un éclairage direct de l'oropharynx, permettant une visualisation claire du larynx lors de l'intubation. Une fois que l'on devient compétent dans la mise en oeuvre de cette technique à l'aide du système d'éclairage, l'utilisation du système n'est plus nécessaire. La procédure peut être effectuée de manière efficace avec seulement un cathéter, et l'ensemble pROCEDURE ne nécessite que quelques minutes. La même méthode exacte peut être utilisé pour les rats avec un système d'éclairage de plus grande taille ou d'un cathéter.
Trois points sont essentiels pour répartir uniformément la matière à travers le poumon. Tout d'abord, toujours mesurer la longueur entre la bouche et le point de bifurcation des bronches avant l'intubation afin d'avoir une idée de la profondeur de la sonde doit être insérée à l'aide d'une souris de la pratique (figure 1). Etant donné que cela dépend largement de la taille de la souris, de la même longueur d'insertion peut être utilisé qu'une seule fois, il est déterminé pour les souris d'une taille particulière. Deuxièmement, assurez-vous que la solution a été ajoutée à la sonde d'intubation est aspiré juste après son ajout. Si le tube d'intubation est insérée par erreur dans l'œsophage, la solution ne soit pas aspiré dans immédiatement et de rester ainsi dans le tube. Si cela se produit, répéter tout le processus de l'intubation. Ce processus de confirmation assure que la solution est dans la trachée, mais pas dans l'œsophage. L'opérateur peut essayer de 3x à un maximum de répéter toute la procédure d'intubation si la solution n'est pas aspiré dans les poumons. Toutefois, si cela se produit fréquemment, il est recommandé de revenir à la pratique d'acquérir taux de réussite plus élevé. Enfin, les souris doivent être inconscient pendant l'intubation, qui assure que la souris ne serait pas expectorer ce qui a été intubé. En ce sens, l'utilisation de l'isoflurane avec un cône de nez, ce qui peut également interférer physiquement avec intubation n'est pas recommandée.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Programme de recherche intra-muros de l'Institut national du cancer, Centre de recherche sur le cancer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KetaVed | Vedco | Ketamine | |
| AnaSed Injection 20 mg | LLOYD | Xylazine | |
| BioLite Stand | Braintree Scientific | RIS100 | For mice |
| BioLite Intubation Illumination System | Braintree Scientific | BIO MI-KIT | For mice |
| 22 G, 1 inch i.v. catheter | Terumo | SR-OX2225CA | For mice below 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used. |
| 20 G, 1 inch i.v. catheter | Terumo | SR-OX2025CA | For mice over 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used. |
References
- Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J. Vis. Exp. (73), e50318 (2013).
- Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS One. 7, e31359 (2012).
- Rayamajhi, M., Redente, E. F., Condon, T. V., Gonzalez-Juarrero, M., Riches, D. W., Lenz, L. L. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. (51), e2702 (2011).
- Riesenfeld, E. P., et al. Inhaled salmeterol and/or fluticasone alters structure/function in a murine model of allergic airways disease. Respir. Res. 11, 22 (2010).
- Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies. Contemp. Top. Lab Anim. Sci. 44, 52-55 (2005).
- Bonniaud, P., et al. Progressive transforming growth factor beta1-induced lung fibrosis is blocked by an orally active ALK5 kinase inhibitor. Am. J. Res. Crit. Care Med. 171, 889-898 (2005).
- Bivas-Benita, M., Zwier, R., Junginger, H. E., Borchard, G. Non-invasive pulmonary aerosol delivery in mice by the endotracheal route. Eur. J. Pharm. Biopharm. 61, 214-218 (2005).
- Haegens, A., et al. Myeloperoxidase deficiency attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung inflammation and subsequent cytokine and chemokine production. J. Immunol. 182, 7990-7996 (2009).
- Jackson, P., et al. Exposure of pregnant mice to carbon black by intratracheal instillation: toxicogenomic effects in dams and offspring. Mutat. Res. 745, 73-83 (2012).
- Bodewes, R., et al. Pathogenesis of Influenza A/H5N1 virus infection in ferrets differs between intranasal and intratracheal routes of inoculation. Am. J. Pathol. 179, 30-36 (2011).
- Winslow, M. M., et al. Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1. Nature. 473, 101-104 (2011).
