Summary
मानव में फेफड़ों के रोगों की हालत mimics कि एक मॉडल का उपयोग किसी विशेष बीमारी के pathophysiology और / या एटियलजि के अध्ययन के लिए और चिकित्सकीय हस्तक्षेप के विकास के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ सीधे माउस फेफड़ों के लिए एक्सोजेनस सामग्री वितरित कर सकते हैं कि एक noninvasive intratracheal इंटुबैषेण विधि प्रस्तुत किया है.
Abstract
मानव में फेफड़ों के रोगों की हालत mimics कि एक मॉडल का उपयोग किसी विशेष बीमारी के pathophysiology और / या एटियलजि के अध्ययन के लिए और चिकित्सकीय हस्तक्षेप के विकास के लिए महत्वपूर्ण है. एक साथ आनुवंशिक जानकारी का एक विशाल राशि के साथ पीटा और ट्रांसजेनिक डेरिवेटिव की बढ़ती उपलब्धता के साथ, चूहों फेफड़ों के रोगों की विकृति और शरीर विज्ञान अंतर्निहित आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए सबसे अच्छा मॉडलों में से एक प्रदान करते हैं. साँस लेना, intranasal टपकाना, intratracheal टपकाना, और intratracheal इंटुबैषेण माउस फेफड़ों के लिए ब्याज की सामग्री प्रशासन के लिए जांचकर्ताओं की एक संख्या से सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल की तकनीक हैं. एक अध्ययन के लक्ष्यों के आधार पर प्रत्येक तकनीक के लिए भला और बुरा कर रहे हैं. यहाँ सीधे माउस फेफड़ों के लिए एक्सोजेनस सामग्री वितरित कर सकते हैं कि एक noninvasive intratracheal इंटुबैषेण विधि प्रस्तुत किया है. इस तकनीक को फेफड़े फाइब्रोसिस अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में माउस फेफड़ों के लिए bleomycin प्रशासन के लिए लागू किया गया था. </ P>
Introduction
फेफड़े कई विनाशकारी रोगों का निदान कर रहे हैं, जहां एक अंग है. उनमें से, फेफड़ों के कैंसर के पुरुषों और महिलाओं दोनों में दूसरा सबसे ज्यादा कैंसर का निदान, और कैंसर से मौत का सबसे आम कारण है. भी वातस्फीति और क्रोनिक ब्रोंकाइटिस के रूप में जाना जाता है क्रोनिक प्रतिरोधी फेफड़े के रोग, एक बहुत ही गंभीर बीमारी है और संयुक्त राज्य अमेरिका में मृत्यु का तीसरा प्रमुख कारण है. 2011 में, यह 25,900,000 अमेरिकियों 18 साल की उम्र के तहत 7.1 लाख बच्चों सहित, अस्थमा था कि अनुमान लगाया गया था. अस्थमा 15 (अमेरिकन लंग एसोसिएशन, से कम आयु के बच्चों के बीच अस्पताल में भर्ती का तीसरा प्रमुख कारण है http://www.lung.org ). इन विनाशकारी रोगों और उनके अंतर्निहित तंत्र के pathophysiology और / या एटियलजि का अध्ययन करने के लिए, सही मॉडल का उपयोग फेफड़ों के लिए ब्याज की विभिन्न सामग्रियों की सुविधाजनक और noninvasive प्रशासन के साथ संयोजन के रूप में महत्वपूर्ण है. चूहों के लिए सबसे अच्छा मॉडलों में से एक प्रदानक्योंकि पीटा और ट्रांसजेनिक चूहों और उपलब्ध आनुवंशिक जानकारी का एक विशाल राशि की बढ़ती उपलब्धता की विकृति और फेफड़ों के रोगों के शरीर क्रिया विज्ञान अंतर्निहित आणविक तंत्र का अध्ययन.
विभिन्न तरीकों साँस लेना, intranasal टपकाना, intratracheal टपकाना, और intratracheal इंटुबैषेण 1-4 सहित माउस फेफड़ों, के लिए ब्याज की सामग्री वितरित करने के लिए विभिन्न सेटिंग्स में जांचकर्ताओं की एक संख्या से इस्तेमाल किया गया है. यह प्रदर्शन करने के लिए नहीं बल्कि मुश्किल माना जाता है क्योंकि उत्तरार्द्ध प्रक्रिया नियमित रूप से इस्तेमाल नहीं किया गया है. यहाँ बताया intratracheal इंटुबैषेण जीन अभिव्यक्ति पैटर्न, विकृति और / या फेफड़ों 5 के शरीर क्रिया विज्ञान पर दिया सामग्री के प्रभाव का अध्ययन करने के क्रम में माउस फेफड़ों के लिए ब्याज की सामग्री वितरित करने के लिए एक noninvasive, सरल, और त्वरित तरीका है. इस तकनीक में एक पूरे फेफड़ों को एक्सोजेनस माल की डिलीवरी का आश्वासन दिया है और किसी भी जीवित रहने की सर्जरी शामिल नहीं करता है और इस प्रकार likel जाएगाY किसी भी संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित किया जाना.
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Protocol
निम्नलिखित प्रोटोकॉल माउस फेफड़ों के लिए ब्याज की सामग्री वितरित करने के लिए एक noninvasive, सरल, और त्वरित विधि का वर्णन करता है. यह प्रक्रिया राष्ट्रीय कैंसर संस्थान पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था.
1. संज्ञाहरण
- सबसे पहले, ketamine और xylazine (क्रमशः 100 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन और 10 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन,) के एक मिश्रण का उपयोग माउस anesthetize. इस ACUC संज्ञाहरण और खुराक की सिफारिश की है. इस राशि के साथ, चूहों में कम से कम ~ 20 मिनट के लिए बेहोश हो रहे हैं.
- संज्ञाहरण के दौरान आंखों के सूखने से बचाने के लिए माउस की आँखों में पशु चिकित्सक मरहम लागू करें.
- कई मिनट के बाद, चेतना के लिए जाँच करने के लिए माउस के एक पैर की चुटकी. एक बार बेहोश पुष्टि की, ~ 60 डिग्री पर angled एक इंटुबैषेण स्टैंड पर माउस जगह और स्टैंड के शीर्ष पर स्थित एक छोटे से रबर बैंड पर अपनी ऊपरी incisors hooking द्वारा जगह में पकड़.
2. Intratracheal इंटुबैषेण
नोट: डाला जा कैथेटर की उचित लंबाई प्राप्त करने के लिए, शुरू में अग्रिम में एक समान आकार के एक अभ्यास माउस (चित्रा 1) के उपयोग से मुंह और ब्रोन्कियल द्विभाजन बिंदु के बीच लंबाई मापने. लंबाई काफी हद तक माउस के आकार पर निर्भर करता है. कैथेटर की प्रविष्टि विभाजन बिंदु से ऊपर बंद कर देना चाहिए (~ शरीर के वजन के 25 ग्राम ~ साथ माउस के लिए 1.5 सेमी). इस intubated सामग्री सभी पालियों के लिए जाना जाएगा कि यह सुनिश्चित करता है. कम से कम 50 अभ्यास micई तकनीक में कुशल बनने के लिए इंटुबैषेण प्रदर्शन कर एक व्यक्ति के लिए आवश्यक हो सकता है (प्रवीण इंटुबैषेण की सफलता की दर 95% से अधिक है कि इसका मतलब है).
- कैथेटर डाला जाता है एक बार, जल्दी से पशु सामान्य रूप से साँस लेने के लिए अनुमति देने के लिए कैथेटर से फाइबर ऑप्टिक प्रकाश गाइड हटा दें. इंटुबैषेण प्रदीप्ति प्रणाली का उपयोग नहीं किया जाता है, तो सीधे वर्णित के रूप में एक कैथेटर डालने.
- एक कैथेटर के लिए ब्याज की सामग्री युक्त समाधान जोड़ें. समाधान तुरंत बाद इसके अलावा फेफड़ों में चूसा जाता है कि सुनिश्चित करें. ~ के लिए पचास microliters 25 ग्राम माउस शरीर के वजन को नियमित तौर पर प्रयोग किया जाता है.
3. जानवरों की वसूली
- जैसे ही समाधान फेफड़ों में ले लिया है, स्टैंड से माउस को नीचे ले, और मूल पिंजरे में वापस डाल दिया.
- यह आगे बढ़ शुरू होता है जब तक माउस का निरीक्षण करें.
- एक बार माउस अच्छी हालत में पुष्टि की है कि, एक रैक के लिए पिंजरे वापसी.
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Representative Results
प्रारंभ में, हरे रंगे समाधान अभ्यास के लिए चूहों नली लगाना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. फेफड़ों के रंग फेफड़ों (चित्रा 2) में वितरित किया गया है कि कैसे समान रूप से जांच करने के लिए इंटुबैषेण के बाद तुरंत resected किया गया था. इस तकनीक C57BL 6 / चूहों का उपयोग bleomycin प्रेरित फेफड़े फाइब्रोसिस अध्ययन करने के लिए लागू किया गया था. चूहों intratracheally नियंत्रण और बाद में necropsied 3 सप्ताह के रूप में bleomycin या खारा की 1.2 यू / किलो के साथ intubated थे, चूहों ऊतक विज्ञान और बढ़ हाइड्रॉक्सीप्रोलाइन सामग्री (चित्रा 3) द्वारा समर्थित, उनके फेफड़ों भर bleomycin प्रेरित फाइब्रोसिस का विकास किया. क्षतिग्रस्त क्षेत्र 20X उद्देश्य बनाया फेफड़ों छवियों और एक 121 अंक जाली ग्रिड का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था. रेशेदार क्षेत्रों पर गिरने चौराहों (अंक) की संख्या कुल (121) अंक के प्रतिशत के रूप में गिना और व्यक्त किया गया. इस प्रकार गिना क्षतिग्रस्त क्षेत्रों का प्रतिशत प्रशासित bleomycin की राशि (चित्रा 4) के लिए आनुपातिक था.
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माउस श्वासनली की चित्रा 1. चित्रण. लाल सलाखों और तीर माप एक अभ्यास माउस का उपयोग इंटुबैषेण पहले लिया जाना चाहिए जहां लंबाई से संकेत मिलता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. सही हरे रंग के साथ intubated होने के बाद फेफड़ों का प्रस्तुतिकरण. डाई रंग फेफड़ों के अधिकांश भागों में देखा जा सकता है, तो इंटुबैषेण सफल माना जाता है.ad/50601/50601fig2highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3. Bleomycin की intratracheal इंटुबैषेण से प्रेरित fibrotic फेफड़ों के प्रतिनिधि छवियाँ. C57BL 6 / चूहों bleomycin की 1.2U/kg (बी, डी) या नियंत्रण के रूप में (ए, सी) और उनके फेफड़ों histologically 21 दिन बाद bleomycin प्रशासन पर जांच की गई खारा साथ intubated थे. बढ़ाई: ए, बी: 40X, सी, डी: 100X. नियंत्रण और bleomycin इलाज फेफड़ों के लिए 21 दिन पर मापा फेफड़ों के प्रति (ई) Hydroxyproline सामग्री. = 6 एन, ***:. पी <0.001 बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
Bleomycin खुराक और फेफड़ों के क्षतिग्रस्त क्षेत्र के बीच चित्रा 4. रिश्ता. Bleomycin (0.5, 1, और 2 यू / किग्रा) की वृद्धि खुराक आनुपातिक क्षतिग्रस्त क्षेत्रों का प्रतिशत बढ़ा. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
यहाँ वर्णित intratracheal इंटुबैषेण समान रूप से माउस फेफड़ों के लिए ब्याज की सामग्री वितरित करने के लिए एक सरल, अभी तक उत्कृष्ट noninvasive विधि है. इस विधि फेफड़ों के फिजियोलॉजी और / या विकृति पर प्रशासित सामग्री का प्रभाव और / या भूमिका का अध्ययन की अनुमति देता है. प्रशासित सामग्री ऐसी साइटोकिन्स, या ऐसे जीनोबायोटिक रसायन / दवाओं, कार्सिनोजन, प्रदूषण, एलर्जी, या विभिन्न मानव रोगों 6-10 के अध्ययन के लिए एक मॉडल का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं कि विभिन्न फेफड़ों की स्थिति में परिणाम है कि वायरस के रूप में एक्सोजेनस सामग्री के रूप में अंतर्जात अणुओं हो सकता है. इस तकनीक को भी homeostasis, फिजियोलॉजी, पैथोलॉजी, और / या फेफड़ों की carcinogenesis में इन जीनों की भूमिका का अध्ययन करने के लिए airway उपकला कोशिकाओं में ब्याज की जीन की overexpression या हटाना शुरू करने की पुनः संयोजक adenovirus या lentivirus के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. एक जीन का विघटन transiently में से एक floxed जीन को बाधित करने के लिए उपकला कोशिकाओं में Cre recombinase व्यक्त करके प्राप्त किया जा सकता हैउपकला कोशिकाओं 11 में ब्याज.
एक कैथेटर आसानी गलती श्वासनली को juxtaposed है जो घुटकी, में डाला जा सकता है. यहाँ वर्णित विधि में, इंटुबैषेण प्रदीप्ति सिस्टम कैथेटर 5 डाला जाना चाहिए जहां सही स्थिति के लिए मार्गदर्शन प्रदान करता है. प्रणाली stably एक प्रकाश स्रोत से जुड़ा है कि एक फाइबर ऑप्टिक फाइबर, और प्रकाश फाइबर ऑप्टिक फाइबर पर ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देता है कि एक विशेष रूप से इंजीनियर लघु ऑप्टिकल लेंस प्रणाली के होते हैं. फाइबर ऑप्टिक फाइबर का वितरण अंत intratracheal ट्यूब के रूप में उपयोग किया जाता है कि डिस्पोजेबल नसों में कैथेटर में फिट बैठता है. इस प्रणाली इंटुबैषेण के दौरान गला का स्पष्ट दृश्य को सक्षम करने, oropharynx के प्रत्यक्ष रोशनी प्रदान करता है. एक प्रदीप्ति प्रणाली का उपयोग कर इस तकनीक को बाहर ले जाने में कुशल हो जाता है, सिस्टम का प्रयोग करें जो आवश्यक नहीं रह गया है. प्रक्रिया कुशलता से पूरे P केवल एक कैथेटर के साथ प्रदर्शन किया, और किया जा सकता हैrocedure केवल कुछ मिनट की आवश्यकता है. ठीक उसी विधि एक बड़े आकार के प्रदीप्ति सिस्टम या कैथेटर के साथ चूहों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
तीन अंक समान रूप से फेफड़ों के दौरान सामग्री के वितरण के लिए महत्वपूर्ण हैं. सबसे पहले, हमेशा कैथेटर एक अभ्यास माउस (चित्रा 1) का उपयोग कर डाला जाना चाहिए कितना गहरा की एक विचार है क्रम में मुंह और इंटुबैषेण पहले ब्रोन्कियल द्विभाजन बिंदु के बीच लंबाई मापने. यह काफी हद तक माउस के आकार पर निर्भर करता है कि यह एक विशेष आकार के चूहों के लिए निर्धारित किया जाता है, एक बार में एक ही प्रविष्टि लंबाई इस्तेमाल किया जा सकता है. दूसरा, समाधान इंटुबैषेण ट्यूब सही इसके अतिरिक्त के बाद चूसा है करने के लिए जोड़ा है सुनिश्चित करें. इंटुबैषेण ट्यूब गलती से घेघा में डाला जाता है, तो तुरंत समाधान में चूसा और इस तरह ट्यूब में रहने के लिए नहीं. यदि ऐसा होता है, इंटुबैषेण की पूरी प्रक्रिया को दोहराएँ. इस पुष्टिकरण प्रक्रिया समाधान नहीं है लेकिन में, श्वासनली में है भरोसा दिलाते हैं किघेघा. ऑपरेटर समाधान फेफड़ों में चूसा नहीं है अगर पूरे इंटुबैषेण प्रक्रिया को दोहराने के लिए अधिकतम पर 3x कोशिश कर सकते हैं. यह अक्सर होता है, हालांकि, यह अधिक सफल दर प्राप्त करने के लिए वापस अभ्यास के लिए जाने की सिफारिश की है. अन्त में, चूहों माउस intubated गया था क्या खंखारना नहीं होता कि जो भरोसा दिलाते हैं, इंटुबैषेण के दौरान बेहोश होना चाहिए. इस अर्थ में, यह भी शारीरिक रूप से इंटुबैषेण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं जो एक नाक शंकु, साथ isoflurane के उपयोग की सिफारिश नहीं है.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
यह काम राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, कैंसर रिसर्च के लिए केंद्र के अंदर का रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KetaVed | Vedco | Ketamine | |
| AnaSed Injection 20 mg | LLOYD | Xylazine | |
| BioLite Stand | Braintree Scientific | RIS100 | For mice |
| BioLite Intubation Illumination System | Braintree Scientific | BIO MI-KIT | For mice |
| 22 G, 1 inch i.v. catheter | Terumo | SR-OX2225CA | For mice below 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used. |
| 20 G, 1 inch i.v. catheter | Terumo | SR-OX2025CA | For mice over 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used. |
References
- Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J. Vis. Exp. (73), e50318 (2013).
- Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS One. 7, e31359 (2012).
- Rayamajhi, M., Redente, E. F., Condon, T. V., Gonzalez-Juarrero, M., Riches, D. W., Lenz, L. L. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. (51), e2702 (2011).
- Riesenfeld, E. P., et al. Inhaled salmeterol and/or fluticasone alters structure/function in a murine model of allergic airways disease. Respir. Res. 11, 22 (2010).
- Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies. Contemp. Top. Lab Anim. Sci. 44, 52-55 (2005).
- Bonniaud, P., et al. Progressive transforming growth factor beta1-induced lung fibrosis is blocked by an orally active ALK5 kinase inhibitor. Am. J. Res. Crit. Care Med. 171, 889-898 (2005).
- Bivas-Benita, M., Zwier, R., Junginger, H. E., Borchard, G. Non-invasive pulmonary aerosol delivery in mice by the endotracheal route. Eur. J. Pharm. Biopharm. 61, 214-218 (2005).
- Haegens, A., et al. Myeloperoxidase deficiency attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung inflammation and subsequent cytokine and chemokine production. J. Immunol. 182, 7990-7996 (2009).
- Jackson, P., et al. Exposure of pregnant mice to carbon black by intratracheal instillation: toxicogenomic effects in dams and offspring. Mutat. Res. 745, 73-83 (2012).
- Bodewes, R., et al. Pathogenesis of Influenza A/H5N1 virus infection in ferrets differs between intranasal and intratracheal routes of inoculation. Am. J. Pathol. 179, 30-36 (2011).
- Winslow, M. M., et al. Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1. Nature. 473, 101-104 (2011).
