Summary
Anvendelse av en modell som etterligner tilstanden av lungesykdommer hos mennesker er kritisk for å studere den patofysiologi og / eller etiologi til en bestemt sykdom, og for utvikling av terapeutiske inngrep. Her en ikke-invasiv intratrakeal intubasjon metode som kan direkte levere eksogene materialer til muse lungene blir presentert.
Abstract
Anvendelse av en modell som etterligner tilstanden av lungesykdommer hos mennesker er kritisk for å studere den patofysiologi og / eller etiologi til en bestemt sykdom, og for utvikling av terapeutiske inngrep. Med den økende tilgjengeligheten av knockout og transgene derivater, sammen med en enorm mengde av genetisk informasjon, mus gir en av de beste modellene for å studere de molekylære mekanismene bak sykdomslære og fysiologi av lungesykdommer. Inhalering, intranasal innføring, intratrakeal instillasjon, og intratrakeal intubasjon er de mest brukte teknikker med et antall forskere til å administrere materialer av interesse til muselunger. Det er fordeler og ulemper for hver teknikk avhengig av målene i en studie. Her en ikke-invasiv intratrakeal intubasjon metode som kan direkte levere eksogene materialer til muse lungene blir presentert. Denne teknikken ble anvendt for å administrere bleomycin til muselunger som en modell for å studere pulmonal fibrose. </ P>
Introduction
Lung er et organ hvor mange ødeleggende sykdommer blir ofte diagnostisert. Blant dem, er lungekreft den nest mest diagnostisert kreft i både menn og kvinner, og den vanligste årsaken til kreftdød. Kronisk obstruktiv lungesykdom, også kjent som emfysem og kronisk bronkitt, er en meget alvorlig sykdom, og det tredje ledende dødsårsak i USA. I 2011 ble det anslått at 25,9 millioner amerikanere hadde astma, inkludert 7,1 millioner barn under 18 år. Astma er den tredje største årsaken til sykehusinnleggelse blant barn under 15 år (American Lung Association, http://www.lung.org ). For å studere den patofysiologi og / eller etiologi av disse ødeleggende sykdommer og deres underliggende mekanismer, er bruken av nøyaktige modeller kritisk i forbindelse med praktisk og ikke-invasiv administrering av ulike materialer av interesse å lunge. Mus gir en av de beste modeller for åstudere de molekylære mekanismene bak sykdomslære og fysiologi av lungesykdommer på grunn av den økende tilgjengeligheten av knockout og transgene mus og en enorm mengde tilgjengelig genetisk informasjon.
Ulike metoder har blitt brukt av en rekke etterforskere i ulike innstillinger for å levere materialer av interesse for mus lungene, inkludert innånding, intranasal drypping, intratrakeal drypping, og intratrakeal intubasjon 1-4. Den sistnevnte fremgangsmåte er ikke blitt rutinemessig brukt fordi det anses ganske vanskelig å utføre. Intratrakeal intubasjon beskrevet heri er en ikke-invasiv, enkel og rask metode for å levere materiale av interesse til muselunger for å studere effekten av de leverte materialer på genutrykksmønster, patologi og / eller fysiologi lunge 5. Denne teknikken sørger for levering av eksogene materiale til et helt tette og ikke innebærer noen overlevelse kirurgi og dermed vil likely skal godkjennes av noen institusjonelle dyr omsorg og bruke komiteer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den følgende protokoll beskriver en ikke-invasiv, enkel og rask metode for å levere materiale av interesse for muselunger. Denne prosedyren ble godkjent av National Cancer Institute Animal Care og bruk komité.
En. Anestesi
- Først anesthetize mus ved hjelp av en blanding av ketamin og xylazin (100 mg / kg kroppsvekt og 10 mg / kg kroppsvekt, henholdsvis). Dette er den anbefalte ACUC anestesi og dose. Med dette beløpet, mus er bevisstløs minst for ~ 20 min.
- Påfør dyrlege salve til øynene av musen for å hindre uttørking av øynene under anestesi.
- Etter flere minutter, klemme en fot av musen til å sjekke for bevissthet. Når bekreftet bevisstløs, plassere musen på en intubasjon stativ vinklet på ~ 60 ° og holde den på plass ved å hekte sine øvre fortenner over en liten gummistrikk plassert på toppen av stativet.
2. Intratrakeal Intubering
NB: For å oppnå den riktige lengde av kateteret som skal settes inn, først måle lengden mellom munnen og bronkial bifurkasjon punktet ved hjelp av en praksis mus med en lignende størrelse på forhånd (figur 1). Lengden i stor grad avhenger av størrelsen av musen. Innsetting av kateteret skal stoppe over bifurkasjonen punktet (~ 1,5 cm for mus med ~ 25 g kroppsvekt). Dette sikrer at intubert materialet vil gå til alle fliker. Minst 50 praksis mice kan være nødvendig for en person å utføre intubasjon dyktige i teknikken (Dyktigere betyr at suksessrate på intubasjon er mer enn 95%).
- Når kateteret er satt inn, raskt fjerne den fiberoptiske lyslederen fra kateteret for å tillate at dyret til å puste normalt. Når Intubation Illumination System ikke brukes, direkte sette inn et kateter som beskrevet.
- Legg til en løsning som inneholder materiale av interesse for et kateter. Sørg for at løsningen blir sugd inn i lungene umiddelbart etter tilsetting. Femti mikroliter av ~ 25 g musekroppsvekt blir rutinemessig brukt.
Tre. Animal Recovery
- Så snart løsningen suges inn i lungene, ta ned muse fra stativet, og sette den tilbake i den opprinnelige buret.
- Observer musen til det begynner å bevege seg.
- Når bekreftet at musen er i god stand, tilbake i buret til en rack.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I utgangspunktet var grønn-farget løsning som brukes til å intubere mus for praksis. Lungene ble foretatt reseksjon like etter intubering for å undersøke hvordan jevnt fargen ble fordelt i lungen (figur 2). Denne teknikken ble brukt til å studere bleomycin-indusert lungefibrose ved hjelp C57BL / 6 mus. Når musene ble intratrakealt intubert med 1,2 U / kg bleomycin eller saltvann som kontroll og obdusert tre uker senere utviklet musene bleomycin-indusert fibrose gjennom lungene, støttet av histologi og den økte hydroksyprolin-innhold (figur 3). Den skadede området ble evaluert med 20X objektiv opprettet lungebilder og en 121-poeng gitter rutenett. Antallet kryss (poeng) faller over fiber områdene ble talt opp og uttrykt som prosentandelen av totalt (121) poeng. Prosentandelen av de skadede områder som således telles, var proporsjonal med mengden av bleomycin administrert (fig. 4).
"Jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> 
Figur 1. Illustrasjon av museluftrøret. De røde søylene og pilene indikerer lengden der målingen bør tas før intubasjon ved hjelp av en praksis mus. Klikk her for å se større bilde .
Figur 2. Utseende av lunge rett etter å ha blitt intubert med grønt fargestoff. Hvis fargestoffet farge kan sees i de fleste deler av lungen, er ansett som vellykket intubasjon.ad/50601/50601fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.
Figur 3. Representative bilder av fibrotiske lungene forårsaket av intratrakeal intubasjon av bleomycin. C57BL / 6 mus ble intubert med 1.2U/kg av bleomycin (B, D) eller saltvann som kontroll (A, C) og deres lunger ble undersøkt histologisk på dag 21 post-bleomycin administrering. Forstørrelse: A, B: 40X, C, D: 100X. (E)-hydroksyprolin-innhold per lunge målt på dag 21 for kontroll og bleomycin behandlede lunger. N = 6, ***:. P <0,001 Klikk her for å se større bilde .
Figur 4. Forholdet mellom bleomycin dose og skadet område av lungen. Økt dose av bleomycin (0,5, 1, og 2 U / kg) proporsjonalt økt andelen av skadede områder. Klikk her for å se større bilde .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intratrakeal intubasjon beskrevet her er en enkel, men likevel utmerket invasiv metode for å jevnt levere materialer av interesse for mus lunge. Denne metoden tillater studiet av effekten og / eller rolle av materialet administrert i fysiologi og / eller patologi i lungen. De administreres materialene kan være endogene molekyler slik som cytokiner, eller eksogene materialer som xenobiotiske kjemikalier / narkotika, kreftfremkallende, forurensninger, allergener, eller virus som resulterer i forskjellige lungelidelser som kan representere en modell for å studere forskjellige humane sykdommer 6-10. Denne teknikken kan også bli brukt i forbindelse med rekombinant adenovirus eller lentivirus å innføre overekspresjon eller sletting av gener som er av interesse i luftveis epitelceller for å studere rollen til disse genene i homeostase, fysiologi, patologi og / eller kreftutvikling av lunge. Avbrytelsen av et gen kan oppnås ved forbigående uttrykker Cre rekombinase i epitel-celler til å forstyrre en floxed gen av ininteresse i epitelceller 11.
Et kateter kan lett bli feilaktig innført i spiserøret, som er anordnet ved siden av luftrøret. I fremgangsmåten som er beskrevet her, gir Intubation Illumination System veiledning til riktig posisjon hvor kateteret skal settes inn 5. Systemet består av en fiber-optisk fiber som er stabilt forbundet med en lyskilde, og en spesielt konstruert miniatyr optiske linsesystem som gjør det mulig for lys å fokusere på den fiberoptiske fiber. Leveringen enden av den fiberoptiske fiber passer inn i den kasserbare intravenøse katetere som er brukt som intratrakeal rør. Dette systemet gir direkte belysning av orofarynx, slik klar visualisering av strupehodet ved intubering. Så snart man blir dyktig i utførelse av denne teknikk ved hjelp av belysningssystemet, er bruken av systemet ikke lenger er nødvendig. Fremgangsmåten kan effektivt utføres med bare et kateter, og hele procedure krever bare noen få minutter. Den samme fremgangsmåte kan anvendes for rotter med en større størrelse Belysningssystem eller kateter.
Tre punkter er kritisk for jevnt å fordele materialet over hele lungen. Først alltid måle lengden mellom munnen og bronkial bifurkasjon punkt før intubering for å få et inntrykk av hvor dypt kateteret skal settes inn ved hjelp av en praksis mus (figur 1). Siden dette i stor grad er avhengig av størrelsen på mus, kan det samme innføringslengde brukes en gang det er bestemt for mus av en bestemt størrelse. For det andre, sørg for at løsningen lagt til intubasjon røret suges rett etter sitt tillegg. Hvis intubasjon røret er feilaktig innført i spiserøret, vil oppløsningen ikke suges inn umiddelbart og således bli i slangen. Hvis dette skjer, gjenta hele prosessen med intubering. Denne bekreftelsesprosess sikrer at løsningen er i luftrøret, men ikke ispiserøret. Operatøren kan forsøke 3x med maksimal for å gjenta hele prosedyren intubasjon hvis oppløsningen ikke blir sugd inn i lungen. Men hvis dette skjer ofte, er det anbefalt å gå tilbake til praksis for å tilegne seg høyere suksessrate. Endelig bør mus være bevisstløs ved intubering, som sikrer at musen ikke ville hoste opp det som ble intubert. På denne måten, er bruken av isofluran med et nesepartiet, som også kan fysisk forstyrre intubasjon ikke anbefalt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av egenutført Research Program of National Cancer Institute, Center for Cancer Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KetaVed | Vedco | Ketamine | |
| AnaSed Injection 20 mg | LLOYD | Xylazine | |
| BioLite Stand | Braintree Scientific | RIS100 | For mice |
| BioLite Intubation Illumination System | Braintree Scientific | BIO MI-KIT | For mice |
| 22 G, 1 inch i.v. catheter | Terumo | SR-OX2225CA | For mice below 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used. |
| 20 G, 1 inch i.v. catheter | Terumo | SR-OX2025CA | For mice over 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used. |
References
- Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J. Vis. Exp. (73), e50318 (2013).
- Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS One. 7, e31359 (2012).
- Rayamajhi, M., Redente, E. F., Condon, T. V., Gonzalez-Juarrero, M., Riches, D. W., Lenz, L. L. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. (51), e2702 (2011).
- Riesenfeld, E. P., et al. Inhaled salmeterol and/or fluticasone alters structure/function in a murine model of allergic airways disease. Respir. Res. 11, 22 (2010).
- Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies. Contemp. Top. Lab Anim. Sci. 44, 52-55 (2005).
- Bonniaud, P., et al. Progressive transforming growth factor beta1-induced lung fibrosis is blocked by an orally active ALK5 kinase inhibitor. Am. J. Res. Crit. Care Med. 171, 889-898 (2005).
- Bivas-Benita, M., Zwier, R., Junginger, H. E., Borchard, G. Non-invasive pulmonary aerosol delivery in mice by the endotracheal route. Eur. J. Pharm. Biopharm. 61, 214-218 (2005).
- Haegens, A., et al. Myeloperoxidase deficiency attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung inflammation and subsequent cytokine and chemokine production. J. Immunol. 182, 7990-7996 (2009).
- Jackson, P., et al. Exposure of pregnant mice to carbon black by intratracheal instillation: toxicogenomic effects in dams and offspring. Mutat. Res. 745, 73-83 (2012).
- Bodewes, R., et al. Pathogenesis of Influenza A/H5N1 virus infection in ferrets differs between intranasal and intratracheal routes of inoculation. Am. J. Pathol. 179, 30-36 (2011).
- Winslow, M. M., et al. Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1. Nature. 473, 101-104 (2011).
