Summary
Användningen av en modell som efterliknar tillstånd av lungsjukdomar hos människa är kritisk för att studera patofysiologin och / eller etiologin av en särskild sjukdom och för att utveckla terapeutiskt ingripande. Här en icke-invasiv intratrakeal intubering metod som direkt kan leverera exogena material till mus lungorna presenteras.
Abstract
Användningen av en modell som efterliknar tillstånd av lungsjukdomar hos människa är kritisk för att studera patofysiologin och / eller etiologin av en särskild sjukdom och för att utveckla terapeutiskt ingripande. Med den ökande tillgången på knockout och transgena derivat, tillsammans med en stor mängd genetisk information, möss ger en av de bästa modellerna för att studera de molekylära mekanismer som ligger till grund för patologi och fysiologi av lungsjukdomar. Inandning, intranasal instillation, intratrakeal instillation, och intratrakeal intubering är de mest använda teknikerna med ett antal forskare att administrera material av intresse för mus lungorna. Det finns för-och nackdelar för varje teknik beroende på målen för en studie. Här en icke-invasiv intratrakeal intubering metod som direkt kan leverera exogena material till mus lungorna presenteras. Denna teknik har tillämpats för att administrera bleomycin till mus lungor som en modell för att studera lungfibros. </ P>
Introduction
Lung är ett organ där många förödande sjukdomar är vanligt diagnostiseras. Bland dem är lungcancer den näst mest diagnosen cancer hos både män och kvinnor, och den vanligaste dödsorsaken i cancer. Kroniskt obstruktiv lungsjukdom, även känd som emfysem och kronisk bronkit, är en mycket allvarlig sjukdom och den tredje vanligaste dödsorsaken i USA. År 2011 uppskattades att 25,9 miljoner amerikaner hade astma, däribland 7,1 miljoner barn under 18 år. Astma är den tredje vanligaste orsaken till sjukhusvård bland barn under 15 års ålder (American Lung Association, http://www.lung.org ). För att studera patofysiologin och / eller etiologin av dessa förödande sjukdomar och deras underliggande mekanismer, är kritisk i samband med praktiska och icke-invasiv administrering av olika material av intresse för lunga användningen av korrekta modeller. Möss ger en av de bästa modellerna förstudera de molekylära mekanismer som ligger till grund för patologi och fysiologi av lungsjukdomar på grund av den ökade tillgången på knockout och transgena möss och en stor mängd av tillgänglig genetisk information.
Olika metoder har använts av ett antal forskare i olika miljöer för att leverera material av intresse för mus lungor, däribland inhalation, intranasal instillation, intratrakeal instillation, och intratrakeal intubering 1-4. Det senare förfarandet har inte rutinmässigt används eftersom det anses vara ganska svår att utföra. Intratrakeal intubation beskriven häri är en icke-invasiv, enkel och snabb metod för att leverera material av intresse för mus lungorna i syfte att studera effekten av de levererade materialen på genexpressionsmönster, patologi och / eller fysiologi lunga 5. Denna teknik säkerställer leverans av exogena material till en hel lunga och innebär inte någon överlevnadskirurgi och därmed kommer likely godkännas av alla institutionella Animal Care och användning kommittéer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande protokoll beskriver en icke-invasiv, enkel och snabb metod för att leverera material av intresse för mus lungorna. Detta förfarande har godkänts av National Cancer Institute Djurvård och användning kommittén.
1. Anestesi
- Först söva musen med användning av en blandning av ketamin och xylazin (100 mg / kg kroppsvikt och 10 mg / kg kroppsvikt, respektive). Detta är den ACUC rekommenderade anestesi och dos. Med denna mängd, möss är medvetslösa åtminstone under ~ 20 min.
- Applicera veterinär salva för ögonen på musen för att förhindra torkning av ögonen under anestesi.
- Efter flera minuter, nypa en fot på musen för att kontrollera medvetandet. När bekräftade medvetslös, placera musen på en intubering monter vinklad vid ~ 60 ° och hålla den på plats genom att koppla dess övre framtänderna över en liten gummisnodd som ligger högst upp i montern.
2. Intratrakeal Intubering
OBS: För att få rätt längd på kateter som skall införas, initialt mäta längden mellan munnen och bronkial gaffelpunkten med hjälp av en praxis mus av liknande storlek i förväg (Figur 1). Längden beror till stor del på storleken på musen. Infogning av katetern bör sluta ovanför bifurkationen punkten (~ 1,5 cm för mus med ~ 25 g kroppsvikt). Detta säkerställer att intuberas materialet kommer att gå till alla lober. Minst 50 praktiken mice kan krävas för en person som utför intubation att bli skickliga i tekniken (Proficient innebär att andelen framgångsrika intubation är mer än 95%).
- När katetern är insatt, snabbt ta bort den fiberoptiska ljusledaren från katetern för att tillåta djuret att andas normalt. När Intubation Illumination System inte används, direkt sätta in en kateter som beskrivs.
- Tillsätt en lösning innehållande material av intresse till en kateter. Säkerställ att lösningen sugs in i lungan omedelbart efter tillsatsen. Femtio mikroliter för ~ 25 g mus kroppsvikt används rutinmässigt.
3. Animal Recovery
- Så snart lösningen sugs in i lungorna, ta ner musen från stativet, och lägger tillbaka den i original buren.
- Observera musen tills den börjar röra sig.
- När bekräftade att musen är i gott skick, tillbaka buren till ett ställ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Inledningsvis var grön-färgat lösning som används för att intubate möss för praktiken. Lungan resekterades omedelbart efter intubering att undersöka hur jämnt färgfördelades i lungorna (figur 2). Denna teknik har tillämpats för att studera bleomycin-inducerad lungfibros med användning C57BL / 6 möss. När mössen intratrakealt intuberade med 1,2 E / kg av bleomycin eller saltlösning som kontroll och obduceras 3 veckor senare, mössen utvecklade bleomycininducerad fibros hela lungorna, med stöd av histologi och den ökade hydroxiprolinhalten (Figur 3). Det skadade området utvärderades med hjälp av 20X mål skapade lungbilder och en 121-poäng gitter rutnät. Antalet korsningar (punkter) som faller över de fibrösa områden räknades och uttrycktes som procentandel av den totala (121) pekar. Den procentuella andelen av de skadade områdena sålunda räknade var proportionell mot mängden av bleomycin administrerat (figur 4).
"Jove_content" fo: keep-together.within-page = "alltid"> 
Figur 1. Illustration av mus luftstrupen. De röda staplarna och pilar indikerar längden där mätningen ska tas före intubation med hjälp av en praxis mus. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Utseende av lunga rätt efter att intuberade med grön färg. Om färgen färgen kan ses i de flesta delar av lungan, är intubation anses lyckat.ad/50601/50601fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 3. Representant bilder av fibrotiska lungor inducerade av intratrakeal intubering av bleomycin. C57BL / 6 möss intuberade med 1.2U/kg av bleomycin (B, D) eller saltlösning som kontroll (A, C) och deras lungor histologiskt undersöktes på dag 21 efter bleomycin administration. Förstoring: A, B: 40X, C, D: 100X. (E) hydroxyprolinhalten per lunga mätt på dag 21 för kontroll och bleomycin behandlade lungor. N = 6, ***:. P <0,001 Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Förhållandet mellan bleomycin dos och skadade delen av lungan. Ökad dos bleomycin (0,5, 1, och 2 U / kg) proportionellt ökade andelen skadade områden. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intratrakeal intubation som beskrivs här är en enkel men utmärkt icke-invasiv metod för att jämnt leverera material av intresse för mus lunga. Denna metod tillåter studie av effekten och / eller rollen av materialet administreras på fysiologi och / eller patologin av lungan. De material som administreras kan vara endogena molekyler såsom cytokiner, eller exogena material såsom xenobiotiska kemikalier / läkemedel, cancerframkallande ämnen, föroreningar, allergener, eller virus som resulterar i olika lungsjukdomar som kan utgöra en modell för att studera olika mänskliga sjukdomar 6-10. Denna teknik kan också användas i kombination med rekombinant adenovirus eller lentivirus att introducera överexpression eller deletion av gener av intresse i epitelceller i luftvägarna för att studera rollen av dessa gener i homeostas, fysiologi, patologi, och / eller cancer i lungan. Störningen av en gen kan uppnås genom att transient uttrycka Cre-rekombinas i epitelceller att störa ett floxade genen itresse i epitelceller 11.
En kateter kan lätt av misstag sätts in i matstrupen, vilken är placerad intill luftstrupen. I den här beskrivna metoden tillhandahåller Intubering Belysningssystem vägledning till korrekt läge, där katetern skall införas 5. Systemet består av en fiberoptisk fiber som stabilt är ansluten till en ljuskälla, och en speciellt konstruerad miniatyr optiskt linssystem som gör att ljuset att fokusera på den fiberoptiska fibrer. Den levererande änden av den fiberoptiska fibern passar in i engångs intravenösa katetrar som används som intratrakeala rör. Detta system ger direkt belysning av orofarynx och att möjliggöra tydlig visualisering av struphuvudet under intubation. När en blir skicklig i att utföra denna teknik med hjälp av belysningssystemet är användningen av systemet inte längre nödvändig. Förfarandet kan effektivt utföras med endast en kateter, och hela pÖRFARANDE kräver endast ett par minuter. Exakt samma metod kan användas för råttor med en större storlek Belysningssystem eller kateter.
Tre punkter är avgörande för jämn fördelning av materialet i hela lungan. Först, alltid mäta längden mellan munnen och bronkial gaffelpunkten före intubation för att få en uppfattning om hur djupt katetern ska föras in med hjälp av en praxis mus (Figur 1). Eftersom detta beror till stor del på storleken på musen, kan samma instickslängd användas en gång det bestäms för möss av en viss storlek. För det andra, se till att lösningen läggs till intubering röret sugs direkt efter dess tillägg. Om intubation röret av misstag sätts in i matstrupen kommer lösningen inte sugas in direkt och således stanna kvar i röret. Om detta händer, upprepa hela processen med intubation. Denna bekräftelseprocess säkerställer att lösningen är i luftstrupen, men inte imatstrupen. Operatören kan prova 3x maximalt för att upprepa hela intubation förfarandet om lösningen inte sugs in i lungorna. Men om det ofta inträffar, rekommenderas att gå tillbaka till praktiken för att få en mer lyckad kurs. Slutligen bör möss vara medvetslös under intubation, som försäkrar att musen inte skulle HOSTA det som intuberas. I denna mening, rekommenderas inte användning av isofluran med en noskon, vilket kan också fysiskt störa intubation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Interna forskningsprogram av National Cancer Institute, Center for Cancer Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KetaVed | Vedco | Ketamine | |
| AnaSed Injection 20 mg | LLOYD | Xylazine | |
| BioLite Stand | Braintree Scientific | RIS100 | For mice |
| BioLite Intubation Illumination System | Braintree Scientific | BIO MI-KIT | For mice |
| 22 G, 1 inch i.v. catheter | Terumo | SR-OX2225CA | For mice below 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used. |
| 20 G, 1 inch i.v. catheter | Terumo | SR-OX2025CA | For mice over 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used. |
References
- Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J. Vis. Exp. (73), e50318 (2013).
- Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS One. 7, e31359 (2012).
- Rayamajhi, M., Redente, E. F., Condon, T. V., Gonzalez-Juarrero, M., Riches, D. W., Lenz, L. L. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. (51), e2702 (2011).
- Riesenfeld, E. P., et al. Inhaled salmeterol and/or fluticasone alters structure/function in a murine model of allergic airways disease. Respir. Res. 11, 22 (2010).
- Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies. Contemp. Top. Lab Anim. Sci. 44, 52-55 (2005).
- Bonniaud, P., et al. Progressive transforming growth factor beta1-induced lung fibrosis is blocked by an orally active ALK5 kinase inhibitor. Am. J. Res. Crit. Care Med. 171, 889-898 (2005).
- Bivas-Benita, M., Zwier, R., Junginger, H. E., Borchard, G. Non-invasive pulmonary aerosol delivery in mice by the endotracheal route. Eur. J. Pharm. Biopharm. 61, 214-218 (2005).
- Haegens, A., et al. Myeloperoxidase deficiency attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung inflammation and subsequent cytokine and chemokine production. J. Immunol. 182, 7990-7996 (2009).
- Jackson, P., et al. Exposure of pregnant mice to carbon black by intratracheal instillation: toxicogenomic effects in dams and offspring. Mutat. Res. 745, 73-83 (2012).
- Bodewes, R., et al. Pathogenesis of Influenza A/H5N1 virus infection in ferrets differs between intranasal and intratracheal routes of inoculation. Am. J. Pathol. 179, 30-36 (2011).
- Winslow, M. M., et al. Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1. Nature. 473, 101-104 (2011).
