Summary
Insanlarda akciğer hastalıklarının durumunu taklit eden bir modelinin kullanılması, belirli bir hastalığın patofizyolojisi ve / veya etyolojisinin araştırılması için ve terapötik müdahale geliştirmek için çok önemlidir. Burada doğrudan fare akciğerlere eksojen malzemeleri teslim noninvazif bir entübasyon yöntemi sunulmuştur.
Abstract
Insanlarda akciğer hastalıklarının durumunu taklit eden bir modelinin kullanılması, belirli bir hastalığın patofizyolojisi ve / veya etyolojisinin araştırılması için ve terapötik müdahale geliştirmek için çok önemlidir. Birlikte genetik bilginin büyük bir miktarı ile nakavt ve transgenik türevlerinin artan durumu ile, fareler akciğer hastalıklarının patoloji ve fizyoloji altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için en iyi modellerinden biri sağlar. Soluma, burun instillasyonu, trakea içi damlatma ve entübasyon fare akciğerlerinde ilgi malzemeleri yönetmek için bir çok araştırmacı tarafından en yaygın olarak kullanılan teknikler vardır. Bir çalışmanın hedeflerine bağlı olarak her teknik için artıları ve eksileri vardır. Burada doğrudan fare akciğerlere eksojen malzemeleri teslim noninvazif bir entübasyon yöntemi sunulmuştur. Bu teknik, pulmoner fibrozis incelemek için bir model olarak fare akciğerlerde bleomisinden yönetmek uygulanmıştır. </ P>
Introduction
Akciğer birçok yıkıcı hastalıkları sık teşhis edilir bir organdır. Bunlar arasında, akciğer kanseri erkeklerde ve kadınlarda hem de ikinci en teşhis kanser ve kanser ölümlerinin en sık nedenidir. Ayrıca, amfizem ve kronik bronşit gibi bilinen bir kronik obstrüktif akciğer hastalığı, çok ciddi bir hastalıktır ve Amerika Birleşik Devletleri'ndeki ölümlerin üçüncü önde gelen nedenidir. 2011 yılında, bu 25,9 milyon Amerikalı 18 yaşın altındaki 7.1 milyon çocuk olmak üzere, astım olduğu tahmin edilmiştir. Astım 15 (Amerikan Akciğer Derneği, yaşın altındaki çocuklar arasında hastaneye yatış üçüncü önde gelen nedenidir http://www.lung.org ). Bu yıkıcı hastalıklar ve bunların altında yatan mekanizmaları patofizyolojisi ve / veya etiyolojiyi incelemek amacıyla, doğru modellerin kullanımı akciğer ilgi çeşitli malzemelerin uygun ve noninvaziv verilmesiyle birlikte önemlidir. Fareler için en iyi modellerinden biri sağlamakçünkü eleme ve transgenik fareler ve mevcut genetik bilginin geniş bir miktarda artan kullanılabilirliği patoloji ve akciğer hastalıklarının fizyolojisi altında yatan moleküler mekanizmaları çalışma.
Çeşitli yöntemler solunması, burun damlatılması, intratreşal damlatma ve entübasyon dahil 1-4 fare akciğerler, ilgi materyalleri sunmak için farklı ayarlar müfettişler bir takım tarafından kullanılmaktadır. Bunu gerçekleştirmek oldukça zor kabul edilir çünkü son prosedür rutin olarak kullanılan olmamıştır. Burada tarif entübasyon gen ekspresyonu, patoloji ve / veya akciğer 5 fizyolojisi üzerinde teslim edilen malzeme etkisini incelemek amacıyla fare akciğerlere ilgilendiren malzemeleri sunmak için, invaziv olmayan, basit ve hızlı bir yöntemdir. Bu teknik, bir bütün akciğere eksojen malzemelerin verilmesini sağlar ve herhangi bir hayatta kalma cerrahi müdahale etmez ve bu nedenle likel doyurmayay herhangi bir kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komiteleri tarafından onaylanmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki protokol fare akciğerlerinde ilgi malzemeleri teslim etmek için bir, invaziv olmayan, basit ve hızlı bir yöntem açıklanır. Bu prosedür, Ulusal Kanser Enstitüsü Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.
1.. Anestezi
- İlk olarak, ketamin ve ksilazin (sırasıyla 100 mg / kg vücut ağırlığı ve 10 mg / kg vücut ağırlığı) oluşan bir karışım kullanılarak fare anestezi. Bu ACUC anestezi ve doz önerilir. Bu miktar ile, farelerin en az ~ 20 dakika için bilinçsiz.
- Anestezi sırasında gözlerin kurumasını önlemek için fare gözlerine veteriner merhem sürün.
- Birkaç dakika sonra, bilinç kontrol etmek için fare ayak tutam. Bir kere bilinçsiz doğruladı, ~ 60 ° açılı bir entübasyon stand fare koyun ve standın üstünde bulunan küçük bir lastik bant üzerindeki üst kesici dişler çengel ile yerinde tutun.
2. Entübasyon
Not: sokulacak kateterin doğru uzunluğu elde etmek için, ilk olarak önceden benzer büyüklükte bir uygulama fare (Şekil 1) kullanılarak, ağız ve bronşiyal çatallanma noktası arasındaki uzunluğunu ölçer. Uzunluğu büyük ölçüde fare büyüklüğüne bağlıdır. Kateterin yerleştirilmesi çatallanma noktası üzerinde durmak gerekir (~ vücut ağırlığı 25 g ~ ile fare için 1.5 cm). Bu entübe malzeme tüm lobu gidecek olmasını sağlar. En az 50 uygulama mikrofone tekniğinde yetkin olmak entübasyon yapan bir kişi için gerekli olabilir (Yeterli entübasyon başarı oranı% 95 daha fazla olduğu anlamına gelir).
- Kateter takıldığında, hızlı bir hayvan normal nefes izin vermek için kateterden, fiber optik ışık kılavuzu kaldırmak. Entübasyon Aydınlatma Sistemi kullanılmadığı zaman, doğrudan anlatıldığı gibi bir kateter yerleştirin.
- Bir kateter ilgi malzemeleri ihtiva eden bir çözelti ekleme. Çözelti hemen eklenmesinden sonra akciğer içine emilmektedir emin olun. ~ Için Elli mikrolitre 25 g fare vücut ağırlığı rutin olarak kullanılmaktadır.
3. Hayvan Kurtarma
- En kısa sürede çözüm akciğer içine çekilir gibi, standından fareyi aşağı çekmek ve özgün kafes içine geri koymak.
- Bu hareket başlayana kadar fareyi gözlemleyin.
- Bir kez fare iyi durumda olduğunu doğruladı, bir rafa kafesi dönmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İlk olarak, yeşil boyalı solüsyon uygulama için fareler entübe için kullanılmıştır. Akciğer rengi akciğer (Şekil 2) dağıtılan nasıl eşit incelemek için entübasyon hemen sonra rezeke edildi. Bu teknik, C57BL / 6 fareleri kullanılarak bleomisin-kaynaklı pulmoner fibroza çalışma uygulanmıştır. Fareler, intratekal kontrol ve daha sonra nekropsi 3 hafta gibi bleomisin ya da tuzlu su, 1.2 U / kg ile entübe edildi, fareler, histoloji ve artan hidroksiprolin içeriği (Şekil 3) tarafından desteklenen, kendi akciğerde Bleomisin kaynaklı fibrozun geliştirdi. Hasarlı alan 20X objektif oluşturulan akciğer görüntüleri ve bir 121-puan kafes ızgarası kullanılarak değerlendirildi. Fibröz alanlar üzerinde düşen kavşaklar (puan) sayısı toplam (121) puan yüzdesi olarak sayılır ve ifade edildi. Böylece sayılır hasarlı alanların yüzdesi tatbik bleomisin miktarına (Şekil 4) ile orantılı olmuştur.
"Jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> 
Fare trakea Şekil 1.. İllüstrasyon. Kırmızı çubuklar ve oklar ölçüm bir uygulama fareyi kullanarak entübasyon önce alınmalıdır uzunluğunu gösterir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Doğru yeşil boya ile entübe edildikten sonra akciğer görünmesi. Boya renk akciğer birçok yerinde görülebilir ise, entübasyon başarılı kabul edilir.ad/50601/50601fig2highres.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Şekil 3. Bleomisinin intratrakeal entübasyon tarafından uyarılan fibrotik akciğer Temsilcisi görüntüler. C57BL / 6 fareleri, bleomisinin 1.2U/kg (B, D) ya da kontrol olarak (A, C) ve akciğerler histolojik olarak günde 21 post-bleomisin uygulama ile ilgili olarak incelendi tuzlu su ile entübe edildi. Büyütme: A, B: 40X, C, D: 100X. Kontrol ve bleomisin tedavi akciğerler için 21. günde ölçülen akciğer başına (E) Hidroksiprolin içeriği. = 6 N, ***:. P <0.001 büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın .
Bleomisin dozu ve akciğer hasarlı alanı arasında Şekil 4.. İlişki. Bleomisin (0.5, 1 ve 2 U / kg) artan doz orantılı hasarlı alanların yüzdesi arttı. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada anlatılan entübasyon eşit fare akciğer ilgilendiren malzemeleri sunmak için basit, ama mükemmel noninvaziv bir yöntemdir. Bu yöntem, akciğer fizyolojisi ve / veya patoloji ile ilgili tatbik malzemenin etkisi ve / veya rol çalışma sağlar. Tatbik malzemeler, sitokinler ya da bu tür ksenobiyotik maddeler / ilaçlar, kanserojen, kirleticiler, alerjenler, ya da çeşitli insan hastalıkları 6-10 çalışmak için bir model temsil edebilir çeşitli akciğer koşulları neden virüsler gibi dışsal malzemeler gibi endojen moleküller olabilir. Bu teknik aynı zamanda homeostazisi, fizyoloji, patoloji ve / veya akciğer kanser, bu genlerin rolünü incelemek için hava yolu epitelial hücrelerine ilgi genlerinin üst ifadesinin veya silme katılması için rekombinant adenovirüs ya da lentivirüs ile bağlantılı olarak kullanılabilir. Bir genin geçici bozulma içinde floxed uğramış geni çatlatmak için epitel hücrelerinde Cre rekombinaz ifade ile elde edilebilirepitel hücrelerinde 11 zasyonu.
Bir kateter kolayca yanlışlıkla trakea için yan yana olan yemek borusu içine sokulabilir. Burada açıklanan yöntemde, Entübasyon Aydınlatma sistemi kateter 5 eklenmesi gereken doğru konuma yol sağlar. Sistem kararlı bir şekilde bir ışık kaynağına bağlı olan bir fiber optik fiber ve ışık, fiber optik lif üzerine odaklanmasını sağlar, özel olarak tasarlanmış minyatür bir optik mercek sistemi oluşur. Fiber optik elyafın, soluk borusuna dağıtımı uç borular olarak kullanılan tek kullanımlık damar içi kateter içine uyar. Bu sistem entübasyon sırasında gırtlak açıkça görüntülenmesini sağlayan, orofarinksin direkt aydınlatma sağlar. Bir Aydınlatma Sistemi kullanılarak, bu teknik gerçekleştirilmesi yeterli hale geldiğinde, sisteminin kullanılması artık gerekli değildir. Prosedür etkili bir bütün p sadece bir kateter ile gerçekleştirildi edilebilir verocedure sadece birkaç dakika gerektirir. Aynı yöntem büyük boyutlu Aydınlatma Sistemi veya kateter ile fareler için kullanılabilir.
Üç nokta eşit akciğerlerde malzemeyi dağıtmak için kritik öneme sahiptir. İlk olarak, her zaman kateter bir uygulama fare (Şekil 1) kullanılarak girilmelidir nasıl derin bir fikir elde etmek için ağız ve entübasyon öncesi bronş çatallanma noktası arasındaki uzunluğunu ölçmek. Bu büyük ölçüde fare büyüklüğüne bağlı olduğundan belirli bir boyutta fareler için tespit edildiği zaman, aynı ekleme uzunluğu kullanılabilir. İkincisi, çözüm entübasyon tüpü sağ onun eklendikten sonra emilir eklenen emin olun. Entübasyon boru yanlışlıkla yemek borusu içine takılırsa, çözelti, hemen emilir ve bu şekilde boru içinde kalmak olmayacaktır. Bu durumda, entübasyon tüm süreci tekrarlamak. Bu onay bir işlem olup çözelti değil de, trakea olduğunu garantiözofagus. Operatör çözelti akciğere emilmediği takdirde, bütün entübasyonu tekrar en fazla 3 kez deneyebilir. Bu sık sık olur Ancak, bu yüksek başarılı oranını elde etmek için geri uygulamaya gitmek için tavsiye edilir. Son olarak, fareler fare entübe ne balgam değil olacağını garanti eder ki, entübasyon sırasında bilinçsiz olmalıdır. Bu anlamda, fiziksel olarak da entübasyon engel olabilecek bir burun konisi ile izofluran kullanımı tavsiye edilmez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü, Kanser Araştırma Merkezi İntramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KetaVed | Vedco | Ketamine | |
| AnaSed Injection 20 mg | LLOYD | Xylazine | |
| BioLite Stand | Braintree Scientific | RIS100 | For mice |
| BioLite Intubation Illumination System | Braintree Scientific | BIO MI-KIT | For mice |
| 22 G, 1 inch i.v. catheter | Terumo | SR-OX2225CA | For mice below 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used. |
| 20 G, 1 inch i.v. catheter | Terumo | SR-OX2025CA | For mice over 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used. |
References
- Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J. Vis. Exp. (73), e50318 (2013).
- Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS One. 7, e31359 (2012).
- Rayamajhi, M., Redente, E. F., Condon, T. V., Gonzalez-Juarrero, M., Riches, D. W., Lenz, L. L. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. (51), e2702 (2011).
- Riesenfeld, E. P., et al. Inhaled salmeterol and/or fluticasone alters structure/function in a murine model of allergic airways disease. Respir. Res. 11, 22 (2010).
- Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies. Contemp. Top. Lab Anim. Sci. 44, 52-55 (2005).
- Bonniaud, P., et al. Progressive transforming growth factor beta1-induced lung fibrosis is blocked by an orally active ALK5 kinase inhibitor. Am. J. Res. Crit. Care Med. 171, 889-898 (2005).
- Bivas-Benita, M., Zwier, R., Junginger, H. E., Borchard, G. Non-invasive pulmonary aerosol delivery in mice by the endotracheal route. Eur. J. Pharm. Biopharm. 61, 214-218 (2005).
- Haegens, A., et al. Myeloperoxidase deficiency attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung inflammation and subsequent cytokine and chemokine production. J. Immunol. 182, 7990-7996 (2009).
- Jackson, P., et al. Exposure of pregnant mice to carbon black by intratracheal instillation: toxicogenomic effects in dams and offspring. Mutat. Res. 745, 73-83 (2012).
- Bodewes, R., et al. Pathogenesis of Influenza A/H5N1 virus infection in ferrets differs between intranasal and intratracheal routes of inoculation. Am. J. Pathol. 179, 30-36 (2011).
- Winslow, M. M., et al. Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1. Nature. 473, 101-104 (2011).
