Summary
Ein Weg, um neue Einblicke in die Komplexität des Gehirns Entzündungsreaktion gewinnen wird vorgestellt. Wir beschreiben Immunfluoreszenz-basierte Protokolle gefolgt von dreidimensionalen konfokalen Analyse, um die Muster der Co-Expression von Mikroglia / Makrophagen-Phänotyp-Marker in einem Mausmodell der fokalen Ischämie zu untersuchen.
Abstract
Nach Schlaganfall Mikroglia / Makrophagen (M / M) zu unterziehen schnelle Aktivierung mit dramatischen morphologischen und phänotypischen Veränderungen, die die Expression von neuen Oberflächenantigene und Produktion von Mediatoren, die aufbauen und pflegen die entzündliche Reaktion umfassen. Anzeichen dafür zeigt, dass M / M sind hochKunstStoffZellen, die klassischen pro-inflammatorische (M1) oder alternative anti-inflammatorische (M2)-Aktivierung nach akuter Hirnverletzung annehmen kann. Jedoch eine vollständige Charakterisierung von M / M Phänotyp Markerexpression, ihre Co-Lokalisation und zeitlichen Entwicklung im verletzten Gehirn fehlt noch.
Immunfluoreszenz-Protokolle spezifische Färbung relevanten Marker der M / M-Aktivierung kann in der ischämischen Gehirn durchgeführt werden. Hier präsentieren wir Immunfluoreszenz-basierte Protokolle, gefolgt von dreidimensionalen konfokalen Analyse als ein leistungsfähiges Konzept, um das Muster der Lokalisierung und der Co-Expression von M / M-Phänotyp-Marker wie untersuchenCD11b, CD68, YM1, im Mausmodell der fokalen Ischämie durch permanente Okklusion der mittleren Hirnarterie (pMCAO) induziert. Zweidimensionalen Analyse des verschmutzten Bereich zeigt, dass jede Markierung zu einem definierten M / M Morphologie zugeordnet wird und eine bestimmte Lokalisierung in der ischämischen Läsion. Muster der M / M-Phänotyp-Marker co-Expression kann durch dreidimensionale konfokale Bildgebung in den ischämischen Bereich zu beurteilen. Bilder können über einen definierten Volumen erfasst werden (10 um z-Achse und einer Schrittweite von 0,23 &mgr; m, was einer 180 x 135 x 10 um das Volumen) mit einer sequentiellen Abtastmodus um Durchbluten Effekte zu minimieren und überlappenden Wellenlängen zu vermeiden. Bilder werden dann verarbeitet, um dreidimensionale Darstellungen mittels Imaris Software zu erhalten. Festansicht des dreidimensionalen Renderings erlaubt die Definition von Markerexpression in Zellhaufen. Wir zeigen, daß M / M haben die Fähigkeit, auf eine Vielzahl von Phänotypen differenzieren, abhängig von der Position in der Läsion und timich nach der Verletzung.
Introduction
Nach einer akuten Hirnverletzung, sind Mikrogliazellen aktiviert und schnell unterziehen dramatische morphologische und phänotypische Veränderungen 3.1. Diese Eigen Antwort wird an die Einstellung von Blut geboren Makrophagen, die in das verletzte Gehirnparenchym 4,5 migrieren verbunden. Die Rolle der Mikroglia und Makrophagen, die antigen unterscheidbar sind nicht in Hirn-Trauma wird noch diskutiert (im Folgenden als M / M bezeichnet). Eine wachsende Zahl von Studien zeigen, dass, ähnlich wie bei peripheren Makrophagen beschrieben, Mikroglia und Gehirn rekrutiert Makrophagen können verschiedene Phänotypen, deren Extrema entsprechen klassischen proinflammatorischen toxisch (M1) oder entzündungshemmende Schutz (M2) Phänotyp annehmen. Die verschiedenen Aktivierungszustände, einschließlich Sekretion von pro-oder anti-entzündliche Faktoren werden Freisetzung von neurotrophen Moleküle und lysosomale Aktivität von einem bestimmten Muster der phänotypischen Marker, deren Expression ist abhängig von der zeitlichen gekennzeichnetEntwicklung der umliegenden Umgebung. Die Charakterisierung dieser M / M Phänotypen im verletzten Gehirn ist immer noch spärlich. Wir haben ein gut etabliertes Mausmodell der pMCAo bis M / M-Expression und Evolution nach Schlaganfall analysieren. Immunfluoreszenz-basierte Protokolle hier vorge zielen auf immer Einblick in den Auftritt von spezifischen M / M-Phänotyp-Marker, deren Lokalisierung und zellulären Co-Expression in den ischämischen Bereich. Wir untersuchten, ein paar Moleküle zu unterschiedlichen Aktivierungszustand oder Phänotyp assoziiert, nämlich CD11b, ein Oberflächenmarker von Leukozyten und einer weit verbreiteten Markierung von M / M Aktivierung / Recruitment 8.6 ausgedrückt, CD68 ein Marker für Lysosomen 6,7 und YM1 eine sekretorische Protein durch alternativ aktiviert (M2) Makrophagen exprimiert und zur Erholung und Wiederherstellung 9-10 Funktion verbunden.
Wenn zwei Markierungen werden durch die gleiche Zelle, aber in unterschiedlichen subzellulären Kompartimenten exprimiert wird, kann Kolokalisation allein nicht viel informative. In diesem Fall kann die Analyse durch Coexpression mit einzelnen Draufsicht und von dreidimensionalen Renderings durchgeführt werden. Wir beschreiben ein Protokoll, um eine gründliche dreidimensionale Analyse von Marker-Co-Expression zu erhalten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Immunfluoreszenz
Das folgende Protokoll wird koronalen Hirngefrierschnitten von Mäusen transkardial perfundiert (20 ml PBS, 0,1 mol / Liter, pH 7,4, gefolgt von 50 ml gekühltem Paraformaldehyd 4% in PBS) erhalten wurden. Nach Perfusion werden Gehirne vorsichtig abgenommen und in 30% Saccharose in PBS bei 4 ° C über Nacht zur Kryokonservierung übertragen. 45 ° C für 3 Minuten, bevor sie in Ampullen versiegelt und bei -70 ° C bis zur Verwendung gelagert - Die Gehirne werden dann schnell durch Eintauchen in Isopentan bei froren. Koronare Gehirn Gefrierschnitte (20 um) seriell zu schneiden und Immunfluoreszenz-Protokoll 11, 6 unterzogen.
Alle Reagenzien und Proben auf Raumtemperatur gebracht. Bitte beachten Sie, dass die vorgestellten Arbeits Verdünnungen von Antikörpern und Serum ergaben sich aus Studien, um die beste Leistung zu erhalten, gemacht. Wenn verschiedene Antikörper und Serum verwendet werden, muss das Protokoll validiert werden.
Die optimale Verdünnung für die Anti-CD11b-und Anti-CD68-Antikörper können je nach der Art des Gewebes zu variieren und muss vor der Co-Markierungsprotokoll beginnen definiert werden.
- Zweimal waschen Gehirn Gefrierschnitte mit PBS.
- Incubate Kryoschnitte für 5 min in PBS mit 1% H 2 O 2 (Schritt erforderlich, da die Fluoreszenzverstärkung benötigt Inkubation mit Meerrettich-Peroxidase-Streptavidin-HRP, siehe Schritt 1.12).
- Wash Kryoabschnitte 2x mit PBS.
- Gefrierschnitte Inkubation für 60 min in PBS mit 10% NGS und 0,3% Triton.
- Gefrierschnitte Inkubation bei 4 ° C über Nacht in PBS mit primären Ab Ratte anti-CD11b [1:30.000], 10% NGS und 0,3% Triton.
- Wash 2x Gefrierschnitte (5 min) mit PBS.
- Gefrierschnitte Inkubation für 60 min in PBS mit biotinylierten sekundären anti-Ratte Ab [1:200] und 1% NGS.
- Wash Kryoabschnitte 2x mit PBS.
- Mit TNT (0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20 Tris-HCl, NaCl, Tween) gewaschen Gefrierschnitten.
- Gefrierschnitte Inkubation für 1,5 h in TNB (Tris-HCl-NaCl-Blocking-Puffer: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,5% Blocking-Reagenz aus entsprechenden Kit (siehe Tabelle der Reagenzien)).
- Wash KryoAbschnitte 3x mal mit TNT.
- Inkubieren Gefrierschnitten in TNB enthält Streptavidin-HRP [1:100].
- Wash Kryoabschnitte 3x mit TNT.
- Gefrierschnitte Inkubation für 8 min in Amplification Diluent enthält Cyanine 5 Tyramid [1:300].
- Wash Kryoabschnitte 3x mit PBS.
- Gefrierschnitte Inkubation für 60 min in PBS mit 10% NGS und 0,1% Triton.
- Gefrierschnitte Inkubation bei 4 ° C über Nacht in PBS mit primären Ab Ratte anti-CD68 [1:200], 3% NGS und 0,3% Triton.
- Wash Kryoabschnitte 3x mit PBS.
- Gefrierschnitte Inkubation für 60 min in PBS mit fluorconjugated Sekundär Ab Alexa 546 anti-Rat [1:500] und 1% NGS.
- Wash Kryoabschnitte 3x mit PBS.
- Gefrierschnitte inkubieren für 10 min in PBS mit Hoechst 1 ug / ml.
- Wash Kryoabschnitte 3x mit PBS.
- Montieren Gefrierschnitten in Prolong Gold.
2. Erwerb der dreidimensionale Bilder durch konfokale Mikroskopie
- Aus den Anregungslaser in Abhängigkeit von den Wellenlängen der Fluoreszenzfarbstoffe angeregt werden (He-Ne rot für Cy5, CD11b, He-Ne-Grün für Alexa546, CD68 und UV-Diode für Hoechst, Kerne).
- Wählen Sie die beste Kombination für dichroitischen Spiegel Lichtsignal-Sammlung.
- Richten Sie die Bildauflösung auf mindestens 800 x 600 Pixel.
- Identifizieren Sie einen Bereich von Interesse, indem Auflicht-Fluoreszenz und die schrittweise Erhöhung der Vergrößerung auf dem 40X-Objektiv.
- Wechseln Sie in der Laser Scanning Mikroskopie (LSM) Modalität.
- Führen repetitiven Scans, um die Photomultiplier (PMT) und die Verstärkung für jeden Kanal eingestellt werden. Laser können einzeln eingeschaltet, um die Einrichtung zu erleichtern. Halten Verstärkung so gering wie möglich, um unerwünschte nicht-spezifische Signale zu vermeiden.
- Mit repebewerbs Scan läuft, bewegen Sie den Fokussteuerung, um untere und obere Extrem der z-Achse (z-Achse Gesamtlänge = 10 um) zu definieren.
- Stoppen wiederholende Scan.
- Definieren Sie die Schrittweite. Es sollte so nah wie möglich an die Pixelgröße (0,225 um), einen Standard 1:1 Größe-Verhältnis über die z-Achse zu erhalten.
- Aktivieren Kalman-Filter mindestens 2 mal.
- Aktivieren sequentiellen Scan-Modus zu bluten Durcheffekte zu vermeiden.
- Gehen Sie auf halbem Weg entlang der z-Achse und führen Sie einen xy sequentiellen Scan. Überprüfen Sie die Einrichtung von PMT und Verstärkung (gutes Signal / Rausch-Verhältnis). Wenn nicht zufriedenstellend ist, wiederholen Sie Schritt 2.6.
- Führen xyz Akquisition.
- Exportieren von Daten als MultiTIFF Datei. Jeder MultiTIFF Datei enthält typischerweise 3 Farbkanäle (blau, grün und rot) und 44 Fokusebenen.
3. Dreidimensionale Ansicht der konfokale Akquisitionen und dreidimensionale Wiedergabe
Galerie MultiTIFF Dateien Imaris Software und verarbeiten sie wie folgt:
- Offene Software.
- Wählen Sie die Ansicht übertreffen.
- Laden Sie die Datei MultiTIFF.
- Wählen Sie die gewünschte Farbe für jeden Kanal.
- Rauschen entfernen aus dem Hintergrund durch die Erhöhung der Mindestwert auf dem Display-Panel Einstellung. Stellen Sie jeden Kanal einzeln.
- Gehen Sie auf die Schnittansicht. Bewegen sich entlang der z-Achse nach Co-Lokalisation (gelbe Pixel).
- Klicken Sie auf eine gelbe Fläche, um zu sehen, ob die Co-Lokalisation entlang der z-Achse (dh gehört zu einem festen Objekt) vorhanden ist. Z-Achsen-Projektionen sind in der rechten und unteren Teil der Figur sichtbar ist.
- Machen Sie einen Schnappschuss.
- Gehen Sie auf Ansicht zu übertreffen.
- Crop 3D, um eine Zelle oder eine Gruppe von Zellen zu isolieren.
- Wählen Sie einen Kanal auf der Displayanpassung Panel.
- Wählen Sie die zu übertreffen / Oberflächen Algorithmus Builder. Algorithmusschritte:
- Wählen Sie Kanal.
- Schwelle definieren (mit dem gleichen Mindestwert in ter angezeigt Anpassung Platte).
- Definieren Sie Größenänderung.
- Definieren Glättung (beste = 0,200).
- Farbe definieren Aussehen.
- End-Algorithmus.
- Wiederholen Sie Schritt 3.12 für jeden Kanal.
- Deaktivieren Fluoreszenzkanäle auf dem Display-Panel Einstellung und wählen Sie alle drei Flächen.
- Bewegen Sie die Lautstärke auf den besten Blick zu finden.
- Machen Sie einen Schnappschuss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ein Beispiel der erhalten wird, wenn die Kennzeichnung Protokolle und konfokalen Nahmen sind in den ischämischen Bereich durch Ergebnisse ist in den 1A und 1B dargestellt. Eine zweidimensionale Ansicht der aufgenommenen Bilder zeigt, dass 24 Stunden nach der Ischämie (A), der lysosomalen Marker CD68 (grün) in hypertrophen amöboider CD11b-Zellen (rot) in der ischämischen Kern vorhanden ausgedrückt. In der Grenzzone (B) CD11b-positiven Zellen anzuzeigen Rundzellkörper und verzweigten Prozesse positiv CD68. Z-Achsen-Projektionen (rechts und unten Teil A und B) zu ermöglichen, ob die Visualisierung der Marker-Verteilung in der einzigen Ebene Sicht dokumentiert ist auch entlang der z-Achse vorhanden ist. Wo Kolokalisation auftritt, werden gelbe Pixel erzeugt. CD11b ist der Rezeptor für C3-Fragmente und weist eine Membran Verteilung. CD68-Etiketten Lysosomen und ist damit gegenwärtig vor allem im Cytosol. CD11b/CD68 Doppel positiven Zellen haben in der Regel einen kleinen Prozentsatz der colokalisiert Voxel und in den meisten Fällen CD11b umgibt CD68 (Abbildung 1A). Nur wenn Phagosomen sind Zellmembran während der phagozytischen Prozess gebunden ist Kolokalisation von CD11b und CD68 realisiert (Fig. 1B).
In Fig. 2 ist die Bildverarbeitung, die zur Definition von Marker Koexpression führt berichtet. Ein in der dreidimensionalen Ansicht der konfokalen erfassten Bilder zeigt die Anwesenheit von CD68 positiven Zellen (grün) und YM1 (rot) positive Zellen, aber es kann nicht für die Definition von Co-Lokalisation eingesetzt werden. Tatsächlich können fluoreszierende Voxel Parallelverlegung auf den Blick des Betrachters ein colokalisiert Signal (gelb), die nicht mit der tatsächlichen Entfernung zwischen den Markierungen (sie sind nicht feste Objekte, und es kann sein, Transparenz-Effekte) verwandt sind zu erhalten. Um Kolokalisation definieren, sollte ein Einzeldraufsicht mit Vorsprüngen von der z-Achse(B) bevorzugt. Bewegung entlang der Z-Achse nach Kolokalisation (gelbe Pixel), wird der Z-Achsen-Projektion erhalten (sichtbar auf der rechten und unteren Teil B). Fluoreszierende Voxel kann durch dreidimensionale Darstellung (Abbildung 2C) in feste Objekte zu drehen. Die Drehung der Lautstärke ermöglicht den besten Blick (von C 'bis C''''') für den Blick auf die Objekte und richtig zuordnen Markerexpression auf eine spezifische zelluläre Körper. Hohe Vergrößerung und feste Ansicht von dreidimensionalen Darstellungen ermöglichen, Markerexpression in Zellhaufen (DD'') zu definieren. Nach hoher Vergrößerung und 3D-Rendering, die beiden Marker (CD68 und YM1) scheinen zu verschiedenen Zellen, obwohl in unmittelbarer Nähe gehören.
Ein Beispiel für die Auswertung der von M / M marker-Phänotyp Koexpression im ischämischen Bereich wird in Fig. 3 gezeigt. Koexpression von CD11b (rot), eine marker von M / M Aktivierung / Einstellung, CD68 (grün) ein Marker mit Lysosomen sowie YM1 verbunden sind, durch alternative aktiviert M / M ausgedrückt werden, in den ischämischen Bereich untersucht. Um Details über die funktionellen Status von M / M zu schaffen, untersuchten wir die Beziehung zu Neuronen (NeuN, in blau). Bilder der abgetasteten Fläche (Fig. 3A-3D) als dreidimensionale Objekte (Fig. 3a'-3d ') bewertet. CD11b/CD68 doppelt positiven Zellen werden durch dreidimensionale Darstellung (Fig. 3A 'und 3B') untersucht. Die Analyse zeigt, dass Nervenzellen (blau) werden oft von CD11b positiven Zellen sowohl in ischämischen Kern-und Randzone bei 24 Stunden nach Ischämie umhüllt. In den meisten Fällen CD11b Zellen umgebenden Nervenzellen sind positiv für CD68 auf beiden Gebieten, was darauf hindeutet, dass diese Zellen im aktiven Phagozytose engagiert. Keine der CD11b/Ym1 doppelt positiven Zellen (3C und 3C ') erscheinen, um eine phagocy engagierentic Interaktion mit Neuronen, wobei CD11b/Ym1 doppelt positiven Zellen nie in Kontakt mit NeuN positiven Zellen.
| Anti-CD11b | TSA-Amplifikation (Cy5) λ = 646 nm | Alexa 546 anti-Ratte λ = 532 nm |
| 1:800 | + | + |
| 1:1.500 | + | + |
| 1:3000 | + | + |
| 1:5.000 | + | + |
| 1:10.000 | + | + |
| 1:30.000 | + | - |
| 1:40.000 | - | - |
Tabelle 1. Feinabstimmung der Arbeitsverdünnung für Ratten anti-CD11b-Antikörper.
Fig. 1 ist. Koexpression von CD11b (rot) und CD68 (grün), 24 Stunden nach pMCAO. Konfokale Mikroskopie für CD11b und CD68 zeigt, dass in der ischämischen Kern CD11b-Zellen sind vorwiegend kugelige und einige von ihnen sind positiv CD68 (A). In der Grenzzone (B) sowohl gerundet und verzweigten CD11b-Zellen sind CD68 positiv. Die Zellkerne sind blau. Bars: 20 um.
2. Koexpression von CD68 (grün) und YM1 (rot) bei 24 Stunden nach pMCAO. Dreidimensionale Ansicht eines konfokalen Bild in den ischämischen Bereich, CD68 (grün), YM1 (rot) und Zellkerne (blau) (A) erworben. Einzel-Draufsicht mit z-Achse Projektionen schließt das Vorhandensein von colokalisiert Voxel (keine gelben signal, B). Dreidimensionale Darstellung dreht Fluoreszenz Voxel in feste Objekte (C). Das Volumen wird gedreht, um den besten Blick (C'-C'''') zu finden. Näher an einer Gruppe von Zellen (D) zu suchen. Dreidimensionale Darstellung hilft zu definieren, ob die Markierungen werden durch die gleiche Zelle im Falle einer Gruppe von Zellen (D ') ausgedrückt. CD68 und YM1, obwohl in engem Kontakt, werden durch die gleichen Zellen koexprimiert werden, die eindeutig mit verschiedenen Kernen (D'') zugeordnet ist. Bars:. 5 um Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
3. Koexpression von CD11b (rot) und NeuN (blau) mit CD68 (grün) oder mit YM1 bei 24 Stunden nach pM. CAO konfokale Mikroskopie in der ischämischen Kern (A; 3D-Rendering in A ') und in Grenzzone (BB') zeigt, dass CD11b/CD68 doppelt positiven Zellen umhüllen NeuN positiven Zellen, was möglicherweise auf die Phagozytose von Neuronen. YM1 positiven Zellen werden ausschließlich in den ischämischen Kern (CD) befindet. Die konfokale Analyse der CD11b/Ym1 doppelt positiven Zellen zeigt, dass sie offenbar nicht in einer phagocytic Interaktion mit beteiligten Neuronen (NeuN positiven Zellen, C; 3D-Rendering in C '). CD11b einzigen positiven Zellen sowohl in ischämischen Kern (CC ') und Grenzzone (DD') umgeben Neuronen. Bar:. Um 20 Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wir präsentieren hier Immunfluoreszenz-basierte Protokolle, gefolgt von dreidimensionalen konfokalen Analyse als ein leistungsfähiges Konzept für Lokalisierung und Co-Expression von M / M-Phänotyp-Marker in den ischämischen Bereich (für eine detaillierte Analyse vgl. Rz 6) zu untersuchen. Dieses Verfahren vereint eine spezifische Färbung der entsprechenden Markierung der M / M-Aktivierung mit dreidimensionaler konfokaler Bildgebung. Die Feinabstimmung von Antikörpern, Serum und fluorconjugated Arbeitsverdünnungen ermöglicht eine optimale Signal-Rausch-Verhältnis der untersuchten Marker. Bildverarbeitung, um dreidimensionale Darstellungen zu erhalten, ermöglicht die Definition von Markerexpression in Zellhaufen, so erfassten Bilder, welche die funktionellen Status M / M. Eine zunehmende Anzahl von Studien sind sich darüber einig, dass M / M sind hochKunstStoffZellen, die unterschiedlichen Phänotypen erwerben und je nach Umgebung Signale engagieren verschiedenen Funktionsprogramme können. Die entzündliche Milieu entwickelt sich im Laufe der Zeit und kann die orchestrierenPolarisation der M / M, die in vivo-Studien weitaus lehr als in-vitro-Modellen, in dem das komplette Netz rekrutiert / aktivierten Zellen können nicht reproduziert werden macht.
Änderungen und Fehlersuche
Die hier vorgestellten Protokolle wurden speziell auf Maushirn Gefrierschnitte (20 um) entwickelt. Arbeitsverdünnungen und Antikörper verwendet werden, können je nach der Tierart oder der Natur des Gewebes als modifiziert werden. Darüber hinaus kann die Immunfluoreszenz-Protokoll modifiziert werden, um Neuronen colabeling umfassen. In diesem Fall tritt 1.17 und 1.19 des Protokolls kann wie folgt modifiziert werden:
- Inkubation bei 4 ° C über Nacht in PBS mit primären Ab Ratte anti-CD68 [1:200], Grund Ab Maus-Anti-NeuN [1:100], 3% NGS und 0,3% Triton.
- Inkubation für 60 min in PBS mit fluorconjugated Sekundär Ab Alexa 546 anti-Rat [1:500], Ab Alexa 488 anti-Maus [1:500]und 1% NGS.
Sie können auch andere als anti-NeuN-Antikörpern zum Nachweis von Antigenen anderen hinzuzufügen. In diesem Fall betrachten Antikörper in verschiedenen Arten von der Ratte auf Kreuzreaktivität mit Sekundärantikörper zu vermeiden erhalten. Überlegen Sie auch, sekundären Alexa-Antikörper mit einer Anregungs-Emissions-Spektren nicht-überlappenden mit den anderen verwendeten Farbstoffe.
Das Protokoll zur dreidimensionalen konfokalen Erwerb kann geändert werden (dh die Erhöhung der z-Achsenlänge), um so dicker Bildvolumina (Schritt 2,7) zu erhalten. Halten Sie eine 1:1-Pixel-Verhältnis auf der z-Achse (Schritt 2.9).
Kritische Schritte innerhalb des Protokolls
Immunfluoreszenz-Protokolle müssen, indem Sie die entsprechenden Negativkontrollen validiert werden. Eine negative Kontrolle ist durch Weglassen der primären Antikörper oder durch Verwendung eines primären Antikörpers, der nicht mit der Art der analysierten Probe reagiert und das die gleiche ausgeführt werdenOTYPE und der konstanten Region (dh in der gleichen immunisierten Spezies erhalten) des Antikörpers von Interesse.
Im Doppelfluoreszenzfärbung, wo zwei Antikörper, die aus den gleichen immunisiert Arten verwendet werden, muss die entsprechende Negativkontrolle durch Weglassen nur den zweiten primären Antikörper verwendet, durchgeführt werden. Wenn Sie auf das Gewebe zu verschiedenen Zeitpunkten erhalten arbeiten, führen Sie die Negativkontrolle zu jedem Zeitpunkt, als M / M Marker Ausdruck können über die Zeit variieren.
Grenzen der Technik
Dreidimensionale konfokale Bildgebung kann nicht ein repräsentatives Bild der gesamten verletzten Bereich. Auch wenn dreidimensionale Analyse ergibt eine zuverlässige Darstellung der M / M Markerexpression in spezifischen Zellen, kann dies nicht die ganze M / M vorhanden Bevölkerung in der Region von Interesse erweitert werden. Um diese Grenze zu überwinden, sollten Sie eine ausreichende Probennahme des Gehirns Interessengebiet, Möglichkeit bietenBly mit einem motorisierten Mikroskoptisch, um unvoreingenommene Gewebeentnahme durchzuführen. Offensichtlich steigt die Zahl der erfassten Bilder pro Bereich würde in zeitaufwendiger Vorgang führen.
Bedeutung in Bezug auf bestehenden Methoden
Die Expression von Marker M / M Polarisation wurde zuvor von unterschiedlichen technischen Ansätzen, einschließlich in-vitro-Modelle (Zellkulturen polarisierenden Mitteln ausgesetzt), FACS-Analyse, MRT und Spektroskopie, die alle mit bestimmten Einschränkungen verbunden analysiert. Während die Bereitstellung von Informationen über die Faktoren Lage, M / M Polarisation zu induzieren, können in vitro-Modellen nicht vollständig spiegeln die komplexe M / M in vivo Antwort. Es wurde tatsächlich festgestellt, dass auch im verletzten Gehirn aktiviert M / M Phänotypen exprimieren gemischt und Funktionen als Ergebnis der komplexen Netzwerk von Immunzellinteraktionen 12. FACS-Analyse liefert eine quantitative Messung der Polarisation state des gesamten M / M Bevölkerung. , Eine große Einschränkung bei dieser Technik liegt jedoch in der zugeordneten der fehlenden Lokalisierung von M / M Markierungen in Bezug auf die Läsion. Darüber hinaus das Protokoll Zellsuspensionen aus Gewebeproben zu erhalten, können Zellen Stress und möglicherweise ihren Phänotyp zu ändern. MRT und Spektroskopie erlauben, M / M-Zellen in den Bereichen des Gehirns in vivo zu lokalisieren, haben aber eine geringe Auflösungsvermögen und kann nicht für das Studium eine breite Palette von M / M Marker angewendet werden.
Dreidimensionale konfokale Analyse liefert Informationen über die Lokalisation und Co-Expression von M / M-Phänotyp-Marker in den ischämischen Bereich und sollten daher mit den Techniken, die oben berichtet, M / M Polarisationszustände gründlich zu untersuchen, in Verbindung gebracht werden.
Fazit und zukünftige Anwendungen
Der beschriebene Ansatz ist geeignet für eine breite Palette von Anwendungen im Bereich der Schlaganfallforschung sowie in anderen acute oder chronischen neurologischen Krankheiten, bei denen eine Doppelrolle des M / M in Verletzungen und Erholung vorgeschlagen. Darüber hinaus könnte die beschriebene Post-Processing-Analyse fruchtbar genutzt werden, um eine Co-Expression oder Co-Lokalisation auf zellulärer Ebene oder in den Fällen, wo Signale selektiv in verschiedenen Raumebenen lokalisiert werden müssen analysieren.
In der nächsten Zukunft könnte diese Technik deutlich verbessert werden, wie effizientere Geräte verfügbar wird. Die konfokale Mikroskope konnten die Vorteile der Einrichtung von Systemen mit höherer Empfindlichkeit, mehrere Laserlinien-und Software für die automatische und schnelle Gewebeproben zu nehmen. Dies führt zu einer höheren Bildqualität, dickere Acquired Volumen und die gleichzeitige Erfassung mehrerer Signale mit dem Ziel, die Umwandlung aller biologischen Information in ein digitales Bild führen. Schließlich möchte die Entwicklung von neuen transgenen Tiermodellen mit spezifischen Markern mit fluoreszierenden Reporter markiert Analyse von Co-expr ermöglichenession in vivo durch Anwendung dreidimensionaler Bildanalyse zur Zweiphotonenmikroskopie.
Dieser Ansatz kann ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Komplexität der Gehirnfunktion mit der Perspektive der Entwicklung künftiger Therapiestrategien anfällig für eine Schutz fahren Phänotyp verstehen zu vertreten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Stefano Fumagalli ist ein Fellow der Monzino Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Rat Anti-mouse CD11b | Kindly provided by Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy | ||
| Rat Anti-mouse CD68 | AbD Serotec | MCA 1957 | |
| Rabbit Anti-mouse Ym1 | Stem Cell Technologies | 1404 | |
| H–chst 33342 | Life technologies | H21492 | |
| Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN) | CHEMICON | MAB377 | |
| Biotinilated Goat Anti-Rat antibody | Jackson Immuno Research | 112-065-143 | |
| TSA Cyanine 5 System | Perkin Elmer | NEL705A001KT | |
| Prolong Gold | Invitrogen | P36930 | |
| Anti-rat alexa 546 | Invitrogen | A-11081 | |
| Anti mouse Alexa 488 | Invitrogen | A-21121 | |
| Anti-rabbit Alexa 594 | Invitrogen | A-11037 | |
| Normal Goat Serum | Vectors Laboratories | S-1000 | |
| Tritin X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417-100 | |
| Equipment | |||
| Cryostat CM1850 | Leica | ||
| Olympus IX81 confocal microscope | Olympus | ||
| AnalySIS software | Olympus | ||
| Imaris software 5.0 | Bitplane | ||
| Photoshop cs2 | Adobe Systems | ||
| Software packages GraphPad Prism version 4.0 | GraphPad Software Inc. | ||
References
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Yenari, M. A., Kauppinen, T. M., Swanson, R. A. Microglial activation in stroke: therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7, 378-391 (2010).
- Iadecola, C., Anrather, J. The immunology of stroke: from mechanisms to translation. Nat. Med. 17, 796-808 (2011).
- Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J. Leukoc. Biol. 87, 779-789 (2010).
- Schilling, M., Besselmann, M., Muller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp. Neurol. 196, 290-297 (2005).
- Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. Journal of Neuroinflammation. 8, 174-193 (2011).
- Zanier, E. R., et al. Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect mice brain after trauma. Crit. CareMed. 39 (11), 2501-2510 (2011).
- Capone, C., et al. Neurosphere derived cells exert a neuroprotective action by changing the ischemic microenvironment. PLoS ONE. 2, e373 (2007).
- Bhatia, S., et al. Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance ofalternatively activated phenotype. PLoS One. 6, e15943 (2011).
- Raes, G., Noel, W., Beschin, A., Brys, L., de Baetselier, P., Hassanzadeh, G. H. FIZZ1 and Ym as tools to discriminate between differentially activated macrophages. Dev. Immunol. 9, 151-159 (2002).
- Gesuete, R., et al. Recombinant C1 inhibitor in brain ischemic injury. Ann. Neurol. 66, 332-342 (2009).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophages plasticity and polarization: in vivo veritas. J. Clin. Invest. 122 (3), 787-795 (2012).
