Summary
דרך להשיג תובנות חדשות על המורכבות של התגובה הדלקתית במוח מוצגת. אנו מתארים פרוטוקולים מבוססי immunofluorescence אחרי ניתוח confocal תלת ממדים כדי לחקור את הדפוס של שיתוף ביטוי של סמני פנוטיפ מיקרוגליה / מקרופאג במודל של עכברים של איסכמיה מוקד.
Abstract
לאחר מיקרוגליה שבץ המוחי / מקרופאגים (ז / ז) עובר שפעול מהיר עם שינויים מורפולוגיים ופנוטיפי דרמטיים הכוללים ביטוי של פני השטח אנטיגנים רומן וייצור של מתווכים כי לבנות ולתחזק את התגובה הדלקתית. ראיות מצביעות על כך שמתעוררים M / M הם תאי פלסטיק מאוד שיכול להניח הפעלה קלאסית פרו דלקתית (M1) או חלופית אנטי דלקתית (M2) לאחר פגיעה מוחית חריפה. עם זאת אפיון של ביטוי M / M סמן פנוטיפ, colocalization והתפתחות הטמפורלית במוח נפגע מלא עדיין חסר.
פרוטוקולי Immunofluorescence במיוחד מכתימים סמנים רלוונטיים של הפעלת M / M יכולים להתבצע במוח איסכמי. כאן אנו מציגים פרוטוקולים מבוססי immunofluorescence אחרי ניתוח confocal תלת ממדי כגישה רבת עוצמה כדי לחקור את הדפוס של לוקליזציה ושיתוף ביטוי של סמני פנוטיפ M / M כגוןCD11b, CD68, Ym1, במודל של עכברים של איסכמיה מוקד הנגרמת על ידי חסימה קבועה של עורק המוח האמצעי (pMCAO). ניתוח דו ממדי של האזור המוכתם מגלה כי כל סמן קשור למורפולוגיה M / M מוגדר ויש לו לוקליזציה נתון בנגע איסכמי. דפוסים של שיתוף ביטוי סמן פנוטיפ M / M ניתן להעריך על ידי confocal הדמיה תלת ממדית באזור איסכמי. ניתן לרכוש תמונות על נפח מוגדר (10 מיקרומטר Z-ציר וגודל צעד 0.23 מיקרומטר, המקביל ל 180 x 135 x 10 מיקרומטר נפח) עם מצב סריקה רציף כדי למזער את ההשפעות לדמם דרך ולהימנע מגל חופף. אז תמונות מעובדות להשיג הדמיות תלת ממדיות באמצעות תוכנת Imaris. השקפה מוצקה של שלוש הדמיות ממדיות מאפשרת ההגדרה של ביטוי סמן באשכולות של תאים. אנחנו מראים שיש לי M / M היכולת להבדיל כלפי מספר רב של פנוטיפים, תלוי במיקום באתר הנגע וtiשלי אחרי פציעה.
Introduction
לאחר פגיעה מוחית חריפה, מיקרוגליה במהירות מופעלים ולעבור מורפולוגיים ופנוטיפי דרמטיים משתנים 1-3. תגובה מהותית זה קשור לגיוס של מקרופאגים יליד דם אשר נודדים לתוך 4,5 parenchyma המוח נפגע. התפקיד של מיקרוגליה ומקרופאגים אשר antigenically לא להבחין (המכונה מעתה כז / ז) בפגיעה מוחית עדיין במחלוקת. מספר גדל והולך של מחקרים מצביע על כך, באופן דומה למה שתאר למקרופאגים היקפיים, מיקרוגליה ומוח מגויסים מקרופאגים יכולים להניח פנוטיפים שונים קיצוניות שמתאימה לרעיל קלאסי הפרו דלקתי (M1) או הפנוטיפ אנטי דלקתי מגן (M2). מצבי ההפעלה השונים, כולל הפרשה של גורמים פרו או אנטי דלקתיים, שחרורו של מולקולות נוירוטרופי ופעילות lysosomal מתאפיינים בדפוס מסוים של סמנים פנוטיפי, ביטוי שתלוי בזמןאבולוציה של הסביבה. האפיון של פנוטיפים M / M אלה במוח נפגע הוא עדיין מועט. אנחנו השתמשנו במודל עכברי מבוסס היטב של pMCAo לנתח ביטוי M / M ואבולוציה לאחר שבץ. פרוטוקולי Immunofluorescence מבוססים שהוצגו כאן שואפים לקבל תובנה המראה של סמנים ספציפיים M / M פנוטיפ, הלוקליזציה שלהם ושיתוף ביטוי סלולארי באזור איסכמי. אנחנו בדקנו כמה מולקולות הקשורות למצב הפעלה שונה או פנוטיפ, כלומר CD11b, סמן משטח לידי ביטוי על ידי כדוריות דם לבנות וסמן בשימוש נרחב של הפעלה / גיוס M / M 6-8, CD68 סמן של lysosomes 6,7 וYm1 הפרשה חלבון לידי ביטוי על ידי מקרופאגים מופעלים לחלופין (M2) וקשורה להחלמה ושיקום תפקוד 9-10.
כאשר שני סמנים באים לידי ביטוי על ידי אותו התא, אך בתאי subcellular שונים, colocalization לבד לא יכול להיות הרבה informative. במקרה זה, ניתוח של coexpression יכול להתבצע על ידי שימוש בתצוגת מישור אחד וע"י הדמיות תלת ממד. אנחנו כאן מתארים פרוטוקול כדי להשיג ניתוח תלת ממדים יסודי של coexpression סמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Immunofluorescence
הפרוטוקול הבא מבוצע על cryosections מוח העטרה שהתקבל בעכברים perfused transcardially (20 מיליליטר של PBS, 0.1 mol / ליטר, pH 7.4, ואחריו 50 מיליליטר של paraformaldehyde המצונן 4% ב-PBS). לאחר זלוף, המוח יוסרו בזהירות והועבר לסוכרוז 30% PBS ב 4 ° C למשך הלילה לcryoprotection. אז המוח מוקפא במהירות על ידי טבילה בisopentane ב-- 45 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות לפני שנחתם לתוך צלוחיות ומאוחסנים ב -70 ° C עד לשימוש. cryosections העטרה המוח (20 מיקרומטר) נחתכים באופן סדרתי וכפוף לפרוטוקול immunofluorescence 11, 6.
להביא את כל חומרים כימיים ודגימות לטמפרטורת חדר לפני השימוש. אנא שים לב כי דילולים עובדים הציגו נוגדנים וסרום כתוצאה מניסויים שנעשו על מנת לקבל את הביצועים הטובים ביותר. כאשר נוגדנים וסרום שונים משמשים, הפרוטוקול צריך להיות מאומת.
class = "jove_content"> הערה שבגלל נוגדנים עיקריים הן אנטי CD11b ואנטי CD68 מבוצעים בעכברים, כדי למנוע אות צלב על ידי אנטי עכברוש אלקסה 546, השתמשנו דילול גבוה של אנטי CD11b אחרי ההגברה אות ניאון עם ערכת ה-TSA (Cy5 tyramide). הקמנו דילול העבודה האופטימלי עבור אנטי CD11b על ידי ביצוע הפרוטוקול המתואר פרט לצעד 1.17 ושימוש לפחות 7 דילולים שונים של אנטי CD11b כפי שדווח בטבלה 1. כתוצאה מכך, 1:30,000 נבחרו להיות הדילול רק השגת: 1) אות גלויה עם Cy5 בננומטר 646 גל העירור; 2) אין אות עם אלקסה 546 בגל עירור 532 ננומטר. בדרך זו, Alexa 546 אות ניאון קשורה באופן סלקטיבי עם ביטוי CD68.
דילולים אופטימליים עבור אנטי CD11b ונוגדנים נגד CD68 עשויים להשתנות בהתאם לסוג של רקמה וחייבים להיות מוגדרים מראש כדי להתחיל את פרוטוקול שיתוף תיוג.
- שטוף cryosections המוח פעמיים עם PBS.
- בתוךcryosections cubate למשך 5 דקות בPBS המכילות 1% H 2 O 2 (שלב נדרש מאז ההגברה הניאון צריכה דגירה עם חזרת peroxidase, streptavidin-HRP, ראה שלב 1.12).
- cryosections לשטוף 2X עם PBS.
- דגירה cryosections ל60 דקות בPBS המכילות NGS 10% ו0.3% טריטון.
- דגירה cryosections ב 4 ° C למשך הלילה בPBS המכיל עיקרי Ab עכברוש אנטי CD11b [1:30,000], NGS 10% ו0.3% טריטון.
- לשטוף cryosections 2x (5 דק ') עם PBS.
- דגירה cryosections ל60 דקות בPBS המכילות המשני אנטי העכברוש Ab biotinylated [1:200] ו1% NGS.
- cryosections לשטוף 2X עם PBS.
- שטוף cryosections עם TNT (טריס-HCl, NaCl, Tween: 0.1 M טריס-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20).
- דגירה cryosections ל1.5 שעות בTNB (טריס-HCl-NaCl-חסימת חיץ: 0.1 M טריס-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.5% מגיב חסימה מערכה מתאימה (ראה טבלה של חומרים כימיים)).
- cryo שטפי סעיפי 3x פעמים עם TNT.
- דגירה cryosections בTNB מכיל streptavidin-HRP [1:100].
- cryosections לשטוף 3x עם TNT.
- דגירה cryosections במשך 8 דקות בהגברה ממסה המכילות Cyanine 5 tyramide [1:300].
- cryosections לשטוף 3x עם PBS.
- דגירה cryosections ל60 דקות בPBS המכילות NGS 10% ו0.1% טריטון.
- דגירה cryosections ב 4 ° C למשך הלילה בPBS המכיל Ab העכברוש אנטי CD68 העיקרי [1:200], 3% NGS ו0.3% טריטון.
- cryosections לשטוף 3x עם PBS.
- דגירה cryosections ל60 דקות בPBS המכילות Ab Alexa 546 אנטי עכברוש fluorconjugated המשני [1:500] ו1% NGS.
- cryosections לשטוף 3x עם PBS.
- דגירה cryosections עבור 10 דקות בPBS המכילות מיקרוגרם / מיליליטר Hoechst 1.
- cryosections לשטוף 3x עם PBS.
- הר cryosections בלהאריך את זהב.
2. רכישת תמונות תלת ממדיות על ידי מיקרוסקופיה confocal
s = "jove_content"> מיקרוסקופ משמש כאן היה מיקרוסקופ IX81 מצויד FV500 יחידת סריקת confocal עם 3 קווי לייזר: Ar-Kr (488nm), אדום הוא Ne-(646nm), וירוק הוא Ne-(532nm) ו דיודות UV.
- בחר לייזרי העירור בהתאם לאורכי הגל של צבעי ניאון כדי להיות נרגש (אדום הוא Ne-לCy5, CD11b; ירוק הוא Ne-לAlexa546, CD68 ודיודות UV לHoechst, גרעינים).
- בחר את השילוב הטוב ביותר עבור מראה dichroic אוסף אותות אור.
- הגדר את רזולוציית תמונה במינימום של 800 600 פיקסלים.
- לזהות את תחומי עניין של באמצעות עלית הקרינה והדרגה להגדיל את ההגדלה לאובייקטיבית 40X.
- לעבור לשיטת לייזר סריקה מיקרוסקופית (LSM).
- הפעל סריקות חוזרות ונשנות כדי להתאים את מכפיל (PMT) ורווח לכל ערוץ. לייזרים יכולים להיות מופעלים בנפרד כדי להקל להגדיר. שמור על רווח נמוך ככל האפשר כדי להימנע מאותות שאינם ספציפיים לא רצויים.
- עם repetitive סריקה פועל, העבר את מוקד השליטה להגדיר קצוות העליונים ותחתונים של ציר Z (סה"כ אורך ציר z = 10 מיקרומטר).
- תפסיק סריקה חוזרת ונשנית.
- הגדרת גודל צעד. זה צריך להיות קרוב ככל האפשר לגודל פיקסל (0.225 מיקרומטר) כדי לקבל יחס של 1:1 בגודל סטנדרטי על ציר ה-z.
- הפעל מסנן קלמן לפחות 2 פעמים.
- הפעל מצב סריקה רציף כדי למנוע תופעות לדמם דרך.
- עבור חצי דרך לאורך ציר z ולהריץ סריקה רציפה XY. בדוק את ההגדרה של PMT ורווח (יחס אות / רעש טוב). אם אינו משביע רצון, חזור על שלב 2.6.
- הפעל רכישת XYZ.
- נתוני יצוא כקובץ multitiff. כל קובץ multitiff בדרך כלל מכיל 3 ערוצי צבע (כחול, ירוק ואדום) ו44 מטוסי מוקד.
3. צפו בתלת ממדי של רכישות Confocal ועיבוד תלת ממדי
להעלות קבצי multitiff לתוכנת Imaris ולעבד אותם באופן הבא:
- תוכנה פתוחה.
- בחר את התצוגה לעלות.
- העלה את קובץ multitiff.
- בחר את הצבע הרצוי עבור כל ערוץ.
- הסרת רעש מהרקע על ידי הגדלת הערך המינימאלי בלוח התאמת תצוגה. התאם כל ערוץ בנפרד.
- עבור לתצוגת הסעיף. לנוע לאורך ציר z מחפש שיתוף לוקליזציה (פיקסלים צהובים).
- לחץ על אזור צהוב כדי לראות אם colocalization נמצא לאורך ציר Z (כלומר שייך לאובייקט מוצק). תחזיות ציר ה-Z נראות בחלק הימני ותחתון של הדמות.
- קח את תמונת מצב.
- חזור כדי לעלות תצוגה.
- יבול 3D לבודד את תא או קבוצה של תאים.
- בחר ערוץ אחד בלוח התאמת תצוגה.
- בחר את קבלן האלגוריתם לעלות / משטחים. צעדי אלגוריתם:
- בחר ערוץ.
- הגדרת סף (להשתמש באותו הערך מינימאלי בtהוא מציג פנל התאמה).
- הגדרת שינוי הגודל.
- להגדיר החלקה (= 0.200 הטובים ביותר).
- הגדר את מראה צבע.
- בסופו של אלגוריתם.
- חזור על שלב 3.12 לכל ערוץ.
- בטלו את הבחירה ערוצי הקרינה בלוח התאמת תצוגה ולבחור את כל שלושה המשטחים.
- הזז את העצמה כדי למצוא את התצוגה הטובה ביותר.
- קח את תמונת מצב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דוגמא לתוצאות המתקבלות כאשר פרוטוקולי תיוג ורכישות confocal מתבצעים לאזור איסכמי מתוארת באיורים 1 א ו-1B. צפו בשני ממדים של תמונות שנרכשו עולה כי בעשרים וארבע שעות לאחר איסכמיה (א '), CD68 סמן lysosomal (הירוק) בא לידי ביטוי בתאי hypertrophic ameboid CD11b (אדום) נמצאים בליבת איסכמי. באזור גבול תאים החיוביים (B) CD11b להציג גופי תא עגולים ותהליכים מסועפים חיוביים לCD68. תחזיות ציר ה-Z (חלק ימני ותחתון של A ו-B) מאפשרות הדמיה של אם חלוקת הסמן המתועדת בתצוגת מישור אחד היא גם הווה לאורך ציר ה-z. איפה colocalization מתרחש, פיקסלים צהובים נוצרים. CD11b הוא קולטן לברי C3 ותערוכות הפצת הממברנה. CD68 תוויות lysosomes ולכן כיום בעיקר בcytosol. CD11b/CDבדרך כלל יש לי 68 תאים חיוביים כפולים אחוז קטן של voxels colocalized וברוב המקרים CD11b מקיף CD68 (איור 1 א). רק כאשר phagosomes חייב קרום תא בתהליך phagocytic, colocalization בין CD11b וCD68 ממומש (איור 1).
באיור 2, עיבוד התמונה שמוביל להגדרה של coexpression הסמן הוא מדווח. ב, התצוגה תלת ממדית של תמונות שנרכשו confocal מעידה על קיומו של תא חיובי CD68 (ירוק) וYm1 תא חיובי (אדום), אבל זה לא יכול לשמש להגדרה של colocalization. ואכן, voxels ניאון הנחת במקביל למבטו של הצופה עשויים להניב איתות colocalized (צהובה), שלא יכול להיות קשורה למרחק הממשי בין סמנים (הם לא עצמים מוצקים וייתכנו השפעות שקיפות). כדי להגדיר colocalization, נוף מישור אחד עם תחזיות של Z-הציר צריך להיותהעדיף (ב '). נע לאורך ציר ה-Z מחפש colocalization (פיקסלים צהובים), הקרנת ציר Z-מתקבלת (גלויה לימין וחלק תחתון של B). ניתן לפנות voxels ניאון לאובייקטים מוצקים על ידי עיבוד תלת ממדים (איור 2 ג). הסיבוב של הנפח מאפשר את התצוגה הטובה ביותר (מ C 'ל C''''') להסתכלות על האובייקטים וכראוי להקצות ביטוי סמן לגוף תאי ספציפי. הגדלה גבוהה ותצוגה מוצקה של הדמיות תלת ממדיות מאפשרים להגדיר ביטוי סמן באשכולות של תאים (DD''). לאחר ההגדלה גבוהה וטיוח 3D, שני סמנים (CD68 וYm1) נראים שייכים לתאים שונים אם כי בקרבת מקום.
דוגמא להערכת coexpression סמן הפנוטיפ של M / M באזור איסכמי מוצגת באיור 3. Coexpression של CD11b (אדום), marker של הפעלה / גיוס M / M, CD68 (ירוק) סמן קשורים lysosomes כמו גם Ym1, הביע על ידי M / M מופעל חלופי נחקרים באזור איסכמי. למסור פרטים על המצב התפקודי של M / M, אנו הערכנו את יחסיהם עם תאי עצב (NeuN, בכחול). תמונות של האזור שנדגם (האיורים 3A-3D) מוערכות כאובייקטים תלת ממדים (איורים 3A'-3D '). CD11b/CD68 תאים חיוביים כפולים נבחנים על ידי עיבוד תלת ממדי (3A דמויות 'ו3B'). ניתוח מגלה כי תאי עצב (כחול) לעתים קרובות עטופים על ידי תאים חיוביים CD11b בשני אזורי הליבה וגבול איסכמי ב24 שעות לאחר איסכמיה. ברוב המקרים תאים המקיפים את תאי עצב CD11b הם חיוביים עבור CD68 בשני האזורים, מה שמרמז כי תאים אלה עוסקים בphagocytosis הפעיל. אף אחד מהתאים החיוביים כפול CD11b/Ym1 (3C דמויות ו3C ') מופיע לעסוק phagocy אינטראקציה טיק עם הנוירונים, תאים חיוביים כפולים CD11b/Ym1 להיות אף פעם לא באים במגע עם תאים חיוביים NeuN.
| אנטי CD11b | ההגברה ה-TSA (Cy5) λ = 646 ננומטר | אלקסה 546 אנטי עכברוש λ = 532 ננומטר |
| 1:800 | + | + |
| 1:1.500 | + | + |
| 1:3,000 | + | + |
| 1:5,000 | + | + |
| 1:10,000 | + | + |
| 1:30,000 | + | - |
| 1:40,000 | - | - |
טבלת 1. כוונון עדין של דילול עובד עבור נוגדן אנטי CD11b חולדה.
n-page = "תמיד"> 
איור 1. Coexpression של CD11b (אדום) וCD68 (ירוק) 24 שעות לאחר pMCAO. מיקרוסקופיה confocal לCD11b וCD68 מראה כי בליבת איסכמי תאי CD11b באופן שכיח כדוריים וחלק מהם הם חיובי לCD68 (א '). באזור הגבול (ב) תאי CD11b שני מעוגלים ומסועפים הם חיוביים לCD68. גרעינים הם בכחול. בארים: 20 מיקרומטר.
איור 2. Coexpression של CD68 (ירוק) וYm1 (אדום) ב24 שעות לאחר pMCAO. תצוגה תלת ממדית של תמונת confocal שנרכשה באזור איסכמי, CD68 (ירוק), Ym1 (אדום) וגרעינים (כחול) (). צפה במטוס אחד עם תחזיות Z-ציר אינו כולל את נוכחותו של voxels colocalized (לא si צהובgnal, ב '). עיבוד תלת ממדים הופך voxels ניאון לעצמים מוצקים (C). הנפח הוא הסתובב כדי למצוא את התצוגה הטובה ביותר (C'-C''''). מקרוב למקבץ של תאים (ד '). עיבוד תלת ממדים מסייע להגדיר אם הסמנים באים לידי ביטוי על ידי אותו התא במקרה של מקבץ של תאים (ד '). CD68 וYm1, אם כי במגע קרוב, לא coexpressed על ידי אותם תאים, שצורה ברורה הקשורים לגרעינים שונים (ד''). בארים:. 5 מיקרומטר לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה.
איור 3. Coexpression של CD11b (אדום) וNeuN (כחול) עם CD68 (ירוק) או עם Ym1 ב24 שעות אחרי הצהריים. CAO מיקרוסקופיה confocal בליבת איסכמי (; 3D rendering ב') ובאזור גבול (BB ") מגלה כי תאים חיוביים כפול CD11b/CD68 עוטפים את התאים חיוביים NeuN, מה שיכול לרמז phagocytosis של נוירונים. התאים החיוביים Ym1 נמצאים באופן בלעדי לליבת איסכמי (CD). ניתוח confocal של תאים חיוביים כפול CD11b/Ym1 מראה כי הם אינם מופיעים מעורבים באינטראקצית phagocytic עם הנוירונים (תאים חיוביים NeuN, C; 3D rendering בC "). תאים חיוביים יחיד CD11b בשתי ליבת איסכמי (CC ") ואזור גבול (DD ') מקיפים את תאי עצב. בר:. 20 מיקרומטר לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מציגים כאן פרוטוקולים מבוססי immunofluorescence אחרי ניתוח confocal תלת ממדי כגישה רבת עוצמה כדי לחקור לוקליזציה ושיתוף ביטוי של סמני פנוטיפ M / M לאזור איסכמי (לניתוח מפורט יותר ראה נ"צ 6). שיטה זו משלבת מכתים ספציפי של סמן הרלוונטי של הפעלת M / M עם confocal הדמיה תלת ממדית. הכוונון העדין של נוגדנים, סרום וfluorconjugated דילולים עובדים מאפשר אות אופטימלית יחס רעש של הסמנים הנחקרים. עיבוד תמונה כדי להשיג שלוש הדמיות ממדיות מאפשר הגדרה של ביטוי סמן באשכול של תאים, מה שהופך את תמונות שנרכשו מעידות על המצב התפקודי של M / מ ' מספר גדל והולך של מחקרים מסכים כעת כי M / M הוא תאי פלסטיק מאוד שיכול לרכוש פנוטיפים מגוונים ולעסוק בתוכניות פונקציונליות שונות בהתאם לאותות שמסביב. הסביבה הדלקתית מתפתחת לאורך זמן ועשויה לתזמרקיטוב של M / M, מה שהופך במחקרי vivo הרבה יותר מאלפות מאשר במודלים חוץ גופית, שבו לא ניתן לשחזר את הרשת של תאים שגויסו / מופעלים המלאה.
שינויים ופתרון בעיות
הפרוטוקולים שהוצגו כאן פותחו במיוחד על cryosections מוח עכבר (20 מיקרומטר). דילולים חוזר ונוגדנים המשמשים עשויים להיות שונה בהתאם לסוג בעל חיים או לאופי של הרקמה נחשבה. בנוסף, פרוטוקול immunofluorescence יכול להיות שונה כדי לכלול colabeling נוירון. במקרה זה צעדים 1.17 ו1.19 של הפרוטוקול עשויים להיות שונה באופן הבא:
- דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה בPBS המכיל Ab העכברוש אנטי CD68 העיקרי [1:200], עכבר Ab העיקרי נגד NeuN [1:100], NGS 3% ו0.3% טריטון.
- דגירה של 60 דקות בPBS המכילות Ab Alexa fluorconjugated המשני 546 אנטי עכברוש [1:500], Ab Alexa 488 אנטי עכבר [1:500]ו -1% NGS.
באפשרותך להוסיף נוגדנים אחרים מאשר נגד NeuN לאיתור אנטיגנים אחרים. במקרה זה לשקול נוגדנים שהושגו במינים שונים מחולדה כדי למנוע תגובתיות צולבת עם נוגדנים משני. שקול גם נוגדני Alexa משניים עם ספקטרום עירור פליטה אינה חופף עם הצבעים האחרים בשימוש.
הפרוטוקול לרכישת confocal תלת ממדים עשוי להיות שונה (כלומר הגדלת אורך ציר ה-z) כדי להשיג כרכי תמונה עבים יותר (שלב 2.7). שמור על יחס של 1:1 פיקסל על ציר Z (שלב 2.9).
שלבים קריטיים בפרוטוקול
פרוטוקולי Immunofluorescence צריכים להיות מאומתים על ידי ביצוע הבקרות השליליות המתאימות. ביקורת שלילית צריכה להתבצע על ידי השמטת הנוגדן הראשוני או על ידי שימוש בנוגדן ראשוני שאינו מגיב עם המינים של המדגם ניתח ואשר אותה היאotype ואזור קבוע (כלומר שהושג באותו מין שחוסנו) של הנוגדן של עניין.
בצביעת הקרינה הכפולה שבו שני נוגדנים מאותו המין שחוסנו משמשים, השליטה השלילית המתאימה חייבת להתבצע על ידי השמטת הנוגדן הראשוני השני רק בשימוש. אם אתה עובד על רקמות שהושגו בנקודות זמן שונות, לבצע בקרה השלילית בכל נקודת זמן, כביטוי סמן M / M עשוי להשתנות לאורך זמן.
מגבלות של הטכניקה
confocal הדמיה תלת ממדית לא יכולה לספק תמונה מייצגת של האזור הפגוע כולה. למרות שהניתוח תלת ממדים מניב ייצוג אמין של ביטוי סמן M / M בתוך תאים ספציפיים, זה לא יכול להיות מורחב לכל הנוכחים אוכלוסיית M / M בשטח של עניין. כדי להתגבר על מגבלה זו, אתה צריך לספק דגימה מספקת של האזור במוח של העניין, possiבליי באמצעות במה מיקרוסקופ ממונעת לבצע דגימת רקמה משוחדת. כמובן, להגדיל את מספר המסגרות שנרכשו בכל אזור יגרום להליך זמן רב יותר.
משמעות ביחס לשיטות קיימות
הביטוי של סמנים של קיטוב M / M כבר נותח בעבר על ידי גישות טכניות שונות, כוללים במודלים חוץ גופית (בתרביות תאים שנחשפו לסוכני קיטוב), ניתוח FACS, MRI וספקטרוסקופיה, כולם קשורות למגבלות מסוימות. תוך מתן מידע על הגורמים יכולים לגרום לקיטוב M / M, במבחנה מודלים עשויים שלא לשקף את M המורכב / M לגמרי בתגובה vivo. זה אכן כבר נקבע גם כי במוח נפגע, M מופעל / M לבטא פנוטיפים ופונקציות מעורבים, כתוצאה מהרשת המורכבת של אינטראקציות תא חיסון 12. ניתוח FACS מספק מדד כמו של הקיטובטייט של האוכלוסייה כל M / M. עם זאת, מגבלה עיקרי הקשורים לטכניקה זו מתגוררת בחוסר הלוקליזציה של סמני M / M בביחס לנגע. יתר על כן הפרוטוקול להשיג השעיות תא מדגימות רקמה עשוי להדגיש תאים ואולי לשנות את הפנוטיפ שלהם. MRI וספקטרוסקופיה מאפשרים למקם תאי M / M בתוך האזורים במוח in vivo, אבל יש כוח ברזולוציה נמוך, ולא יכולים להיות מיושמים ללימוד מגוון רחב של סמני M / M.
ניתוח confocal תלת ממדי מספק מידע על הלוקליזציה ושיתוף הביטוי של סמני פנוטיפ M / M לאזור איסכמי ולכן יש הקשורים בטכניקות שדווחו לעיל כדי לחקור מצבי קיטוב M / M ביסודיות.
יישומי סיכום ועתיד
הגישה המתוארת היא מתאימה למגוון רחב של יישומים בתחום מחקר שבץ, כמו גם בacut האחרדואר או מחלות נוירולוגיות כרוניות שבו תפקיד כפול של M / M בפציעה והתאוששות הוצע. בנוסף הניתוח שלאחר העיבוד תאר עלול להיות מנוצל פורה לנתח כל coexpression או colocalization ברמה תאית או במקרים בם אותות צריכים להיות מקומיים באופן סלקטיבי במטוסי מרחבי שונים.
בעתיד הקרוב טכניקה זו יכולה להיות שיפור משמעותי כמו ציוד יעיל יותר הופך להיות זמין. מיקרוסקופים confocal יכולים לנצל את ההקמה של מערכות עם רגישות גבוהה יותר, קווי לייזר מרובים ותוכנה לדגימת רקמות אוטומטית ומהירה. זה יגרום באיכות גבוהה יותר תמונה, כרכים עבים הנרכשים ורכישה בו זמנית של אותות מרובים במטרה להמיר את כל המידע הביולוגי לתמונה דיגיטלית. לבסוף, הפיתוח של מודלים של בעלי חיים מהונדסים חדשים עם סמנים ספציפיים מתויגים עם כתבי ניאון יאפשר ניתוח של שיתוף expression in vivo על ידי יישום ניתוח תמונה תלת ממדי לשני פוטונים במיקרוסקופ.
גישה זו יכולה לייצג כלי רב עוצמה כדי להבין את המורכבות של תפקוד המוח עם נקודת המבט של פיתוח אסטרטגיות טיפוליות עתידיות נוטה לנהוג בפנוטיפ מגן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש מחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
סטפנו פומגלי הוא עמית של קרן Monzino.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Rat Anti-mouse CD11b | Kindly provided by Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy | ||
| Rat Anti-mouse CD68 | AbD Serotec | MCA 1957 | |
| Rabbit Anti-mouse Ym1 | Stem Cell Technologies | 1404 | |
| H–chst 33342 | Life technologies | H21492 | |
| Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN) | CHEMICON | MAB377 | |
| Biotinilated Goat Anti-Rat antibody | Jackson Immuno Research | 112-065-143 | |
| TSA Cyanine 5 System | Perkin Elmer | NEL705A001KT | |
| Prolong Gold | Invitrogen | P36930 | |
| Anti-rat alexa 546 | Invitrogen | A-11081 | |
| Anti mouse Alexa 488 | Invitrogen | A-21121 | |
| Anti-rabbit Alexa 594 | Invitrogen | A-11037 | |
| Normal Goat Serum | Vectors Laboratories | S-1000 | |
| Tritin X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417-100 | |
| Equipment | |||
| Cryostat CM1850 | Leica | ||
| Olympus IX81 confocal microscope | Olympus | ||
| AnalySIS software | Olympus | ||
| Imaris software 5.0 | Bitplane | ||
| Photoshop cs2 | Adobe Systems | ||
| Software packages GraphPad Prism version 4.0 | GraphPad Software Inc. | ||
References
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Yenari, M. A., Kauppinen, T. M., Swanson, R. A. Microglial activation in stroke: therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7, 378-391 (2010).
- Iadecola, C., Anrather, J. The immunology of stroke: from mechanisms to translation. Nat. Med. 17, 796-808 (2011).
- Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J. Leukoc. Biol. 87, 779-789 (2010).
- Schilling, M., Besselmann, M., Muller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp. Neurol. 196, 290-297 (2005).
- Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. Journal of Neuroinflammation. 8, 174-193 (2011).
- Zanier, E. R., et al. Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect mice brain after trauma. Crit. CareMed. 39 (11), 2501-2510 (2011).
- Capone, C., et al. Neurosphere derived cells exert a neuroprotective action by changing the ischemic microenvironment. PLoS ONE. 2, e373 (2007).
- Bhatia, S., et al. Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance ofalternatively activated phenotype. PLoS One. 6, e15943 (2011).
- Raes, G., Noel, W., Beschin, A., Brys, L., de Baetselier, P., Hassanzadeh, G. H. FIZZ1 and Ym as tools to discriminate between differentially activated macrophages. Dev. Immunol. 9, 151-159 (2002).
- Gesuete, R., et al. Recombinant C1 inhibitor in brain ischemic injury. Ann. Neurol. 66, 332-342 (2009).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophages plasticity and polarization: in vivo veritas. J. Clin. Invest. 122 (3), 787-795 (2012).
