Summary
Un modo per acquisire nuove conoscenze nella complessità della risposta infiammatoria del cervello è presentato. Descriviamo protocolli basati immunofluorescenza-seguita da analisi confocale tridimensionale per indagare il pattern di co-espressione di marcatori fenotipici microglia / macrofagi in un modello murino di ischemia focale.
Abstract
Dopo l'ictus cerebrale microglia / macrofagi (M / M) sottoposti attivazione rapida con i cambiamenti morfologici e fenotipici drammatici che includono l'espressione di antigeni di superficie innovativi e la produzione di mediatori che si accumulano e mantengono la risposta infiammatoria. Prove emergenti indica che M / M sono cellule altamente plastica che possono assumere classico antinfiammatorio (M2) attivazione pro-infiammatoria (M1) o alternativo dopo danno cerebrale acuto. Tuttavia una caratterizzazione completa di M / M espressione marcatore fenotipo, la loro colocalizzazione e l'evoluzione temporale nel cervello danneggiato è ancora mancante.
Protocolli di immunofluorescenza specificamente colorazione pertinenti marcatori di attivazione M / M possono essere eseguite nel cervello ischemico. Presentiamo qui protocolli basati immunofluorescenza-seguita da analisi confocale tridimensionale come un approccio efficace per indagare il pattern di localizzazione e co-espressione di M / M marcatori fenotipici qualiCD11b, CD68, YM1, nel modello murino di ischemia focale indotta da occlusione permanente dell'arteria cerebrale media (pMCAO). Analisi bidimensionale della zona macchiata rivela che ciascun marcatore è associato un definito M / M morfologia e ha una data localizzazione nella lesione ischemica. Modelli di M / M marcatore fenotipo co-espressione può essere valutata da tridimensionale confocale nella zona ischemica. Le immagini possono essere acquisite nel corso di un volume definito (10 micron asse z e una dimensione 0,23 um passo, corrispondente ad un volume di 180 x 135 x 10 micron) con una modalità di scansione sequenziale per minimizzare gli effetti di spurgo-through della lunghezza d'onda ed evitare sovrapposizioni. Le immagini vengono poi elaborati per ottenere il rendering tridimensionale per mezzo di software Imaris. Vista solida di tre rendering tridimensionale consente la definizione di espressione marcatore in ammassi di cellule. Abbiamo dimostrato che le M / M hanno la capacità di differenziare verso una moltitudine di fenotipi, a seconda della posizione del sito di lesione e time dopo l'infortunio.
Introduction
Dopo il danno cerebrale acuto, microglia stanno rapidamente attivata e sottoposti drammatica morfologica e fenotipica cambia 1-3. Questa risposta intrinseca è associata al reclutamento di macrofagi del sangue nato che migrano nel infortunato 4,5 parenchima cerebrale. Il ruolo della microglia e macrofagi che non sono antigenicamente distinguibili (d'ora in poi denominato M / M) nel trauma cranico è ancora dibattuta. Un numero crescente di studi indicano che, analogamente a quanto descritto per macrofagi periferici, microglia e macrofagi reclutati cervello possono assumere diversi fenotipi i cui estremi conforme a classico pro-infiammatoria tossico (M1) o anti-infiammatoria protettiva (M2) fenotipo. I diversi stati di attivazione, compreso secrezione di fattori pro o anti-infiammatorie, rilascio di molecole neurotrofici e dell'attività lisosomiale sono caratterizzate da un modello specifico di marcatori fenotipici, la cui espressione dipende dal temporaleevoluzione dell'ambiente circostante. La caratterizzazione di questi fenotipi M / M nel cervello danneggiato è ancora scarsa. Abbiamo utilizzato un modello murino consolidata di pMCAo per analizzare l'espressione M / M e l'evoluzione dopo l'ictus. Protocolli di immunofluorescenza basato presentate qui mirano ad ottenere comprensione nella comparsa di specifici marcatori fenotipici M / M, la loro localizzazione e cellulari co-espressione nella zona ischemica. Abbiamo studiato alcune molecole associate diverso stato di attivazione o fenotipo, cioè CD11b, un marker di superficie espressa da leucociti e un indicatore ampiamente usato di M / M di attivazione / reclutamento 6-8, CD68 un marcatore dei lisosomi 6,7 e YM1 un secretoria proteina espressa alternativamente attivati (M2) e macrofagi associati al recupero e funzione di ripristino 9-10.
Quando due marcatori sono espresse dalla stessa cellula, ma in differenti compartimenti subcellulari, solo colocalizzazione non può essere molto informative. In questo caso, l'analisi di coexpression può essere eseguita utilizzando un'unica vista in pianta e rendering tridimensionali. Siamo qui descriviamo un protocollo per ottenere un'approfondita analisi tridimensionale del marcatore coexpression.
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Protocol
1. Immunofluorescenza
Il seguente protocollo è eseguita su criosezioni cerebrali coronali ottenuti da topi transcardially perfusi (20 ml di PBS, 0,1 mol / l, pH 7,4, seguita da 50 ml di paraformaldeide refrigerate 4% in PBS). Dopo perfusione, i cervelli sono accuratamente rimossi e trasferiti al 30% di saccarosio in PBS a 4 ° C per una notte per crioprotezione. I cervelli sono poi rapidamente congelati per immersione in isopentano a - 45 ° C per 3 minuti prima di essere sigillato in fiale e conservato a -70 ° C fino all'utilizzo. Criosezioni cerebrali coronali (20 micron) sono tagliati in serie e sottoposti a protocollo immunofluorescenza 11, 6.
Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente prima dell'uso. Si prega di notare che le diluizioni di lavoro presentati di anticorpi e siero risultato di studi effettuati al fine di ottenere le migliori prestazioni. Quando vengono utilizzati diversi anticorpi e siero, il protocollo deve essere convalidato.
Le diluizioni ottimali per anti-CD11b e anticorpi anti-CD68 possono variare a seconda del tipo di tessuto e devono essere definiti prima di iniziare il protocollo co-etichettatura.
- Lavare criosezioni cervello due volte con PBS.
- Incriosezioni cubate per 5 min in PBS contenente 1% H 2 O 2 (passo richiesto, poiché l'amplificazione fluorescente bisogno incubazione con perossidasi di rafano, streptavidina-HRP, vedere il passo 1.12).
- Criosezioni Lavare 2x con PBS.
- Incubare criosezioni per 60 min in PBS contenente il 10% NGS e 0,3% Triton.
- Incubare criosezioni a 4 ° C per una notte in PBS contenente primario Ab Rat anti-CD11b [1:30.000], il 10% NGS e 0,3% Triton.
- Lavare criosezioni 2x (5 min) con PBS.
- Incubare criosezioni per 60 min in PBS contenente biotinilato secondario anti-Rat Ab [1:200] e 1% NGS.
- Criosezioni Lavare 2x con PBS.
- Lavare criosezioni con TNT (Tris-HCl, NaCl, Tween: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20).
- Incubare criosezioni per 1,5 ore a TNB (tampone Tris-HCl-NaCl-Blocking: 0.1 M TRIS-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0,5% Blocco reagente da apposito kit (vedi tabella dei reagenti)).
- Wash criosezioni 3x volte con TNT.
- Incubare criosezioni in TNB contenente streptavidina-HRP [1:100].
- Criosezioni Lavare 3x con TNT.
- Incubare criosezioni per 8 minuti in Amplification diluente contenente Cyanine 5 Tyramide [1:300].
- Criosezioni Lavare 3x con PBS.
- Incubare criosezioni per 60 min in PBS contenente il 10% NGS e 0,1% Triton.
- Incubare criosezioni a 4 ° C per una notte in PBS contenente primario Ab Rat anti-CD68 [1:200], 3% NGS e 0,3% Triton.
- Criosezioni Lavare 3x con PBS.
- Incubare criosezioni per 60 min in PBS contenente fluorconjugated secondario Ab Alexa 546 anti-Rat [1:500] e 1% NGS.
- Criosezioni Lavare 3x con PBS.
- Incubare criosezioni per 10 min in PBS contenente Hoechst 1 ug / ml.
- Criosezioni Lavare 3x con PBS.
- Montare criosezioni in Prolungare oro.
2. Acquisizione di immagini tridimensionali per Microscopia confocale
- Selezionare i laser di eccitazione a seconda delle lunghezze d'onda dei coloranti fluorescenti per essere entusiasti (He-Ne rosso per Cy5, CD11b, He-Ne verde per Alexa546, CD68 e il diodo UV per la Hoechst, nuclei).
- Selezionare la migliore combinazione specchio dicroico per la raccolta segnale luminoso.
- Impostare la risoluzione delle immagini ad un minimo di 800 x 600 pixel.
- Individuare una zona di interesse utilizzando epi-fluorescenza e progressivamente aumentare l'ingrandimento con l'obiettivo 40X.
- Passare a Laser Scanning Microscopy (LSM) modalità.
- Eseguire scansioni ripetitive per regolare il fotomoltiplicatore (PMT) e il guadagno per ogni canale. I laser possono essere attivati individualmente per facilitare il set up. Mantenere guadagno più basso possibile per evitare segnali non specifici indesiderati.
- Con repetitivo scansione in esecuzione, spostare il controllo del fuoco per definire gli estremi inferiore e superiore della z (lunghezza totale asse z = 10 micron).
- Smettere di scansione ripetitiva.
- Definire passo. Dovrebbe essere il più vicino possibile alla dimensione dei pixel (0,225 micron) per ottenere un rapporto 1:1 formato standard sopra l'asse z.
- Attivare filtro di Kalman almeno 2 volte.
- Attivare la modalità di scansione sequenziale per evitare effetti sanguinare-through.
- Vai a metà strada lungo l'asse z ed eseguire una scansione sequenziale xy. Controllare il set-up di PMT e di guadagno (buon rapporto segnale / rumore). Se non è soddisfacente, ripetere il punto 2.6.
- Eseguire acquisizione xyz.
- Esportare dati come file multitiff. Ogni file multitiff genere contiene tre canali di colore (blu, verde e rosso) e 44 piani focali.
3. Tridimensionale Vista Acquisizioni confocale e rendering tridimensionale
Caricare file multitiff al software Imaris ed elaborarli come segue:
- Software Open.
- Selezionare la vista sorpassare.
- Caricare il file multitiff.
- Selezionare il colore desiderato per ogni canale.
- Rimuovere il rumore di fondo da aumentando il valore minimo sul pannello di regolazione del display. Regolare singolarmente ciascun canale.
- Vai alla vista di sezione. Muovetevi lungo l'asse z in cerca di co-localizzazione (pixel giallo).
- Istruzioni su un'area gialla per vedere se la colocalizzazione è presente lungo l'asse z (cioè appartiene ad un oggetto solido). Proiezioni asse Z sono visibili nella parte destra e inferiore della figura.
- Prendete uno snapshot.
- Torna a superare vista.
- Raccolto 3D per isolare una cella o un gruppo di celle.
- Selezionare un canale sul pannello di regolazione del display.
- Selezionare la sorpassare / superfici algoritmo costruttore. Passi algoritmo:
- Selezionare il canale.
- Definire soglia (utilizzare lo stesso valore minimo in tegli visualizzare pannello di regolazione).
- Definire ridimensionamento.
- Definire smoothing (migliore = 0,200).
- Definire l'aspetto del colore.
- Fine algoritmo.
- Ripetere passo 3.12 per ogni canale.
- Deselezionare i canali di fluorescenza sul pannello di regolazione del display e selezionare tutte le tre superfici.
- Spostare il volume di trovare la migliore vista.
- Prendete uno snapshot.
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Representative Results
Un esempio dei risultati ottenuti quando vengono effettuate etichettatura protocolli e acquisizioni confocali fuori nella regione ischemica è illustrato nelle figure 1A e 1B. Una visione bidimensionale di immagini acquisite mostra che a ventiquattro anni ore dopo ischemia (A), il marcatore CD68 lisosomiale (verde) viene espresso in cellule ipertrofiche ameboide CD11b (rosso) presenti nel nucleo ischemico. Nella zona di confine cellule positive (B) CD11b mostrano corpi cellulari rotonde e processi ramificati positive per CD68. Proiezioni asse Z (parte destra e inferiore A e B) permettono di visualizzare se la distribuzione marcatore documentato nella vista unico piano è presente anche lungo l'asse z. Quando si verifica colocalization, gialli pixel vengono generati. CD11b è il recettore per frammenti C3 e presenta una distribuzione membrana. CD68 etichette lisosomi ed è quindi presente soprattutto nel citoplasma. CD11b/CD68 cellule doppio positive solito hanno una piccola percentuale di voxel colocalized e in molti casi CD11b circonda CD68 (Figura 1A). Solo quando phagosomes sono tenuti a membrana cellulare durante il processo di fagocitosi, colocalizzazione tra CD11b e CD68 è realizzato (Figura 1B).
In Figura 2, è riportato l'elaborazione dell'immagine che porta alla definizione di marcatore coexpression. In A, la visione tridimensionale di confocali immagini acquisite indica la presenza di cellule CD68 positive (verde) e YM1 (rosso) cellula positiva, ma non può essere utilizzata per la definizione di colocalizzazione. Infatti, voxel fluorescenti posa parallela alla vista dell'osservatore possono dare un segnale colocalized (giallo), che non può essere correlato alla distanza effettiva tra i marcatori (non sono oggetti solidi e ci possono essere effetti di trasparenza). Per definire colocalization, una singola vista aereo con proiezioni l'asse z deve esserepreferito (B). Muovendosi lungo l'asse Z cercando colocalizzazione (giallo pixel), la proiezione dell'asse Z è ottenuta (visibile a destra e parte inferiore B). Voxel fluorescenti possono essere trasformati in oggetti solidi per il rendering tridimensionale (Figura 2C). La rotazione del volume permette la vista migliore (da C 'a C''''') per guardare gli oggetti e correttamente assegnare espressione marcatore di un corpo cellulare specifica. Alto ingrandimento e vista solida di rendering tridimensionali consentono di definire l'espressione marcatore in ammassi di cellule (DD''). Dopo elevato ingrandimento e il rendering 3D, i due marcatori (CD68 e YM1) sembrano appartenere a celle diverse anche se nelle immediate vicinanze.
Un esempio della valutazione di M / M marcatore fenotipo coexpression nell'area ischemica è mostrata in Figura 3. Coexpression di CD11b (rosso), un marker di M / M attivazione / assunzione, CD68 (verde) un marcatore associato con i lisosomi nonché YM1, espressa da alternativa attivato M / M sono indagati nell'area ischemica. Per fornire dettagli sullo stato funzionale del M / M, abbiamo valutato il loro rapporto con i neuroni (NeuN, in blu). Immagini dell'area campionata (Figure 3A-3D) sono valutati come oggetti tridimensionali (Figure 3A'-3D '). CD11b/CD68 cellule doppio positive sono esaminate dal rendering tridimensionale (Figure 3A 'e 3B'). L'analisi rivela che i neuroni (blu) sono spesso avvolto dalle cellule positive CD11b sia in zona ischemica core e di confine a 24 ore dopo l'ischemia. Nella maggior parte dei casi le cellule CD11b neuroni circostanti sono positive per CD68 in entrambe le zone, suggerendo che queste cellule sono impegnati nella fagocitosi attiva. Nessuna delle cellule doppio positive CD11b/Ym1 (Figure 3C e 3C ') sembrano coinvolgere un phagocyinterazione con i neuroni tic, essendo cellule positive doppie CD11b/Ym1 mai a contatto con le cellule positive NeuN.
| anti-CD11b | TSA amplificazione (Cy5) λ = 646 nm | Alexa 546 anti-ratto λ = 532 nm |
| 1:800 | + | + |
| 1:1.500 | + | + |
| 1:3,000 | + | + |
| 1/5.000 | + | + |
| 1:10.000 | + | + |
| 1:30.000 | + | - |
| 1:40.000 | - | - |
Tabella 1. Messa a punto di diluizione di lavoro per l'anticorpo di ratto anti-CD11b.
Figura 1. Coexpression di CD11b (rosso) e CD68 (verde) 24 ore dopo pMCAO. Microscopia confocale per CD11b e CD68 mostra che nel core ischemico cellule CD11b sono prevalentemente globulare e alcuni di loro sono positive per CD68 (A). Nella zona di confine (B) le cellule CD11b sia arrotondate e ramificate sono positivi per CD68. Nuclei sono in blu. Bar: 20 micron.
Figura 2. Coexpression di CD68 (verde) e YM1 (rosso) a 24 ore dopo pMCAO. Vista tridimensionale di una immagine confocale acquisita nella zona ischemica, CD68 (verde), YM1 (rosso) e nuclei (blu) (A). Vista singola aereo con proiezioni z-asse esclude la presenza di voxel colocalized (no si giallode segnal, B). Rendering tridimensionale trasforma voxel fluorescenti in oggetti solidi (C). Il volume viene ruotato per trovare la migliore visualizzazione (C'-C''''). Closer guardare ad un ammasso di cellule (D). Rendering tridimensionale contribuisce a definire se i marcatori sono espresse dalla stessa cella nel caso di un gruppo di cellule (D '). CD68 e YM1, sebbene a stretto contatto, non sono coexpressed dalle stesse cellule, essendo chiaramente associati a diversi nuclei (D''). Bar:. 5 micron Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Coexpression di CD11b (rosso) e NeuN (blu) con CD68 (verde) o con YM1 a 24 ore dopo pM. CAO microscopia confocale nel core ischemico (A; Rendering 3D in A ') e nella zona di frontiera (BB') rivela che le cellule doppio positive CD11b/CD68 avvolgono le cellule positive NeuN, possibilmente indicando la fagocitosi dei neuroni. YM1 cellule positive sono esclusivamente nel nucleo ischemico (CD). Analisi confocale di cellule doppio positive CD11b/Ym1 mostra che non appaiono coinvolti in un'interazione fagocitica con neuroni (cellule positive NeuN, C;, 3D in C '). CD11b singole cellule positive sia di base ischemica (CC ') e la zona di confine (DD') circondano i neuroni. Bar:. 20 micron Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
Vi presentiamo qui protocolli basati immunofluorescenza, seguita da analisi confocale tridimensionale come un approccio efficace per indagare la localizzazione e la co-espressione di M / M marcatori fenotipici nella zona ischemica (per un'analisi più dettagliata vedi rif 6). Questo metodo combina colorazione specifica pertinente marker di attivazione M / M con confocale tridimensionale. La messa a punto di anticorpi, siero e fluorconjugated diluizioni di lavoro permette di segnale ottimale rumore dei marcatori indagati. L'elaborazione delle immagini per ottenere tre rendering tridimensionale consente la definizione di espressione marcatore in agglomerato di cellule, rendendo le immagini acquisite indicativi dello stato funzionale della M / M. Un numero crescente di studi oggi concordano sul fatto che M / M sono cellule altamente plastica che possono acquisire diversi fenotipi e coinvolgere diversi programmi funzionali a seconda dei segnali circostanti. L'ambiente infiammatorio evolve nel tempo e può orchestrare ilpolarizzazione di M / M, rendendo gli studi in vivo molto più istruttivo di modelli in vitro, in cui la rete completa delle cellule reclutate / attivate non può essere riprodotto.
Modifiche e risoluzione dei problemi
I protocolli qui presentati sono stati specificamente sviluppati su criosezioni cervello di topo (20 micron). Diluizioni di lavoro e anticorpi utilizzati possono essere variate in funzione delle specie animali o per la natura del tessuto in esame. Inoltre, il protocollo immunofluorescenza può essere modificato per includere colabeling neurone. In questo caso passi 1.17 e 1.19 del protocollo può essere modificato come segue:
- Incubare a 4 ° C per una notte in PBS contenente primario Ab Rat anti-CD68 [1:200], primario del mouse Ab anti-NeuN [1:100], 3% NGS e 0,3% Triton.
- Incubare per 60 min in PBS contenente fluorconjugated secondario Ab Alexa 546 anti-Rat [1:500], Ab Alexa 488 anti-topo [1:500]e l'1% NGS.
Puoi aggiungere anticorpi diversi da quelli anti-NeuN per la rilevazione di altri antigeni. In questo caso considerare anticorpi ottenuti in diverse specie di ratto per evitare reattività crociata con anticorpi secondari. Considerate anche anticorpi secondari Alexa con spettri di eccitazione-emissione non-sovrapposizione con gli altri coloranti impiegati.
Il protocollo per l'acquisizione confocale tridimensionale può essere modificato (cioè aumentando la lunghezza asse z) in modo da ottenere più spessi volumi immagine (passo 2.7). Mantenere un rapporto 1:1 pixel su asse z (passo 2.9).
Fasi critiche all'interno del protocollo
Protocolli di immunofluorescenza devono essere convalidati eseguendo gli opportuni controlli negativi. Il controllo negativo deve essere effettuata omettendo l'anticorpo primario o utilizzando un anticorpo primario che non reagisce con le specie del campione analizzato e che ha lo stesso èotype e regione costante (cioè ottenuto nella stessa specie immunizzati) dell'anticorpo di interesse.
In doppia colorazione a fluorescenza in cui vengono utilizzati due anticorpi delle stesse specie immunizzati, il controllo negativo appropriato deve essere effettuata da omettendo unicamente il secondo anticorpo primario utilizzato. Se si sta lavorando su tessuti ottenuti in diversi momenti, eseguire il controllo negativo in ogni tempo, come espressione marcatore M / M può variare nel tempo.
Limiti della tecnica
Confocale tridimensionale non può fornire un quadro rappresentativo di tutta la zona danneggiata. Anche se l'analisi tridimensionale permette una rappresentazione affidabile di espressione marcatore M / M all'interno di cellule specifiche, questo non può essere estesa tutta M / M popolazione presente nell'area di interesse. Per superare questo limite, è necessario fornire un campione sufficiente della zona del cervello di interesse, possibilitàBly utilizzando un palco microscopio motorizzato per eseguire il campionamento del tessuto imparziale. Ovviamente, aumentando il numero di fotogrammi acquisiti per area comporterebbe una procedura più tempo.
Significatività rispetto ai metodi esistenti
L'espressione di marcatori di M / M polarizzazione è già stato analizzato da diversi approcci tecnici, compresi i modelli in vitro (colture cellulari esposte ad agenti polarizzanti), analisi FACS, risonanza magnetica e spettroscopia, tutti associati con specifiche limitazioni. Fornendo informazioni sui fattori in grado di indurre M / M polarizzazione, modelli in vitro possono non rispecchiare completamente il complesso M / M in risposta vivo. È infatti stato ben stabilito che nel cervello danneggiato, attivato M / M esprimere fenotipi e funzioni misti, come risultato della complessa rete di interazioni cellule immunitarie 12. Analisi FACS fornisce una misura quantitativa della polarizzazione state di tutta la popolazione M / M. Tuttavia, una limitazione maggiore associata a questa tecnica risiede nella mancanza di localizzazione di marcatori M / M rispetto alla lesione. Inoltre, il protocollo di ottenere sospensioni di cellule da campioni di tessuto può sottolineare cellule ed eventualmente modificare il loro fenotipo. Risonanza magnetica e spettroscopia permettono di localizzare le cellule M / M all'interno delle aree del cervello in vivo, ma hanno una potenza bassa risoluzione e non può essere applicato per studiare una vasta gamma di marcatori M / M.
Analisi confocale tridimensionale fornisce informazioni sulla localizzazione e co-espressione di M / M marcatori fenotipo nella zona ischemica e deve quindi essere associato con le tecniche sopra riportati per indagare a fondo M / M stati di polarizzazione.
Conclusione applicazioni e future
Il metodo descritto è adatto per un'ampia gamma di applicazioni nel campo della ricerca corsa così come in altre acute o malattie neurologiche croniche in cui è stato proposto un duplice ruolo di M / M infortuni e di recupero. Inoltre l'analisi post-trattamento descritto potrebbe essere utilmente sfruttata per analizzare qualsiasi coexpression o colocalizzazione a livello cellulare o nei casi in cui devono essere selettivamente localizzata in diversi piani spaziali segnali.
Nel prossimo futuro questa tecnica potrebbe essere significativamente migliorata come apparecchiature più efficienti diventa disponibile. Microscopi confocale potrebbero sfruttare il set-up dei sistemi con maggiore sensibilità, molteplici linee laser e software per il campionamento automatico e veloce dei tessuti. Questo si tradurrà in una maggiore qualità dell'immagine, masse acquisite spessi e acquisizione simultanea di segnali multipli con lo scopo di convertire tutte le informazioni biologiche in un'immagine digitale. Infine, lo sviluppo di nuovi modelli animali transgenici con marcatori specifici taggate con i giornalisti fluorescenti consentirebbe analisi di co-espressione in vivo applicando analisi di immagine tridimensionale di microscopia a due fotoni.
Questo approccio può rappresentare un potente strumento per comprendere la complessità della funzione cerebrale con la prospettiva di sviluppare future strategie terapeutiche inclini a guidare un fenotipo protettivo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Stefano Fumagalli è un collega della Fondazione Monzino.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Rat Anti-mouse CD11b | Kindly provided by Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy | ||
| Rat Anti-mouse CD68 | AbD Serotec | MCA 1957 | |
| Rabbit Anti-mouse Ym1 | Stem Cell Technologies | 1404 | |
| H–chst 33342 | Life technologies | H21492 | |
| Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN) | CHEMICON | MAB377 | |
| Biotinilated Goat Anti-Rat antibody | Jackson Immuno Research | 112-065-143 | |
| TSA Cyanine 5 System | Perkin Elmer | NEL705A001KT | |
| Prolong Gold | Invitrogen | P36930 | |
| Anti-rat alexa 546 | Invitrogen | A-11081 | |
| Anti mouse Alexa 488 | Invitrogen | A-21121 | |
| Anti-rabbit Alexa 594 | Invitrogen | A-11037 | |
| Normal Goat Serum | Vectors Laboratories | S-1000 | |
| Tritin X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417-100 | |
| Equipment | |||
| Cryostat CM1850 | Leica | ||
| Olympus IX81 confocal microscope | Olympus | ||
| AnalySIS software | Olympus | ||
| Imaris software 5.0 | Bitplane | ||
| Photoshop cs2 | Adobe Systems | ||
| Software packages GraphPad Prism version 4.0 | GraphPad Software Inc. | ||
References
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