Summary
脳の炎症反応の複雑さに新たな洞察を得るための方法が提示される。我々は、局所虚血のマウスモデルにおけるミクログリア/マクロファージの表現型マーカーの共発現パターンを調べるために、三次元共焦点免疫蛍光分析を行っベースのプロトコルを記載している。
Abstract
脳卒中のミクログリア/マクロファージの後に（M / M）は、新規表面抗原の発現および構築し、炎症反応を維持するメディエーターの産生を含む劇的な形態学的および表現型変化と急速な活性化を受ける。新たな証拠は、M / Mは、急性脳損傷後の古典（M1）の炎症誘発性または代替抗炎症（M2）の活性化を引き受けることができる、高度なプラスチック細胞であることを示しています。しかし負傷した脳内のM / Mの表現型マーカー発現、彼らの共局在的、時間的進化の完全な特徴付けは、依然として行方不明です。
具体的にはM / M活性化の関連するマーカーを免疫蛍光染色プロトコルは、虚血性脳内で行うことができる。ここでは、局在化およびのようなM / M表現型マーカーの共発現パターンを調査するための強力なアプローチとして、三次元共焦点免疫蛍光分析を行っベースのプロトコルを提示のCD11b、CD68、Ym1は、中大脳動脈（pMCAOの）の永久閉塞によって誘発される局所的虚血のマウスモデルにおいて。染色された領域の二次元解析では、各マーカーが定義され、M / Mの形態に関連しており、虚血性病変内の指定されたローカライズを持っていることが明らかになった。 M / M表現型マーカーの共発現のパターンは、虚血領域における三次元共焦点イメージングによって評価することができる。画像は、ブリードスルーの影響を最小限にし、波長の重なりを回避する順次走査モードで（180 X 135×10ミクロンの体積に相当する、10〜z軸と0.23μmのステップサイズ）規定された体積にわたって取得することができる。画像は、IMARISソフトウェアを用いて三次元レンダリングを得るために処理される。 3次元レンダリングの固体ビューは細胞のクラスターにおけるマーカー発現の定義を可能にする。我々は、M / M、病変部位およびtiの場所に応じて、多数の表現型に分化する能力を有することを示す私損傷後。
Introduction
急性脳損傷の後、ミクログリアは急速に活性化し、劇的な形態学的および表現型を受けている1〜3に変更されます。この組み込み関数応答が負傷脳実質4,5内に移動血液由来のマクロファージの動員に関連している。脳損傷における抗原的に区別できない小膠細胞およびマクロファージの役割（以下、M / Mという）まだ議論されている。研究が増えても同様に、末梢マクロファージについて記載されたものに、ミクログリアおよび脳はマクロファージが、その極端な（M1）の古典的な前炎症性毒性または抗炎症保護（M2）の表現型に対応して異なる表現型をとることができる募集、ことを示している。炎症または抗炎症因子の分泌を含む異なる活性化状態、神経栄養性分子およびリソソーム活性の放出は、その発現が時間的に依存する表現型マーカーの特定のパターンによって特徴付けられる周囲の環境の進化。負傷した脳内のこれらのM / Mの表現型の特徴付けはまだ乏しいです。私たちは、脳卒中後のM / Mの発現と進化を分析するpMCAOのの老舗マウスモデルを使用していました。ここで紹介する免疫蛍光ベースのプロトコルは、特定のM / M表現型マーカー、それらの局在と虚血領域における細胞の共発現の外観への洞察を得ることを目指しています。我々は、異なる活性化状態または表現型に関連するいくつかの分子を調べ、すなわちのCD11b、白血球及びM / Mの活性化/人材紹介6-8の広く使われているマーカーによって発現される表面マーカー、CD68リソソーム6,7とYm1は分泌のマーカータンパク質は、代替的にアクティブ化（M2）、マクロファージで発現し、回復と機能回復9月10日に関連付けられている。
2マーカーが同じセルによってではなく、様々な細胞内コンパートメントで表現されている場合、単独の共局在はあまりINFできない場合がありますormative。この場合、共発現の分析は、単一の平面図を用いて三次元レンダリングを行うことができる。ここでは、マーカーの同時発現の完全な三次元解析を得るためのプロトコルを記載している。
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Protocol
1。免疫蛍光
以下のプロトコルを経心的に灌流したマウス（PBS中の冷却したホルムアルデヒドを50mlの4％、続いてPBS、0.1モル/リットル、pH7.4の20mlの）から得られた冠状脳の凍結切片上で行われる。灌流後、脳を慎重に除去し、凍結保護のために4℃で一晩PBS中30％スクロースに移した。バイアルに密封し、-70℃で使用するまで保存される前に、3分間45°C - 脳を急速にイソペンタンに浸漬することによって凍結させる。冠状脳凍結切片（20μm）を連続的にカットし、免疫蛍光プロトコル11、6を受ける。
使用前に室温にすべての試薬およびサンプルを持参してください。抗体および血清の提示作業希釈は最高のパフォーマンスを得るために作ら試験から生じたことに注意してください。異なる抗体および血清が使用される場合、プロトコルは、検証される必要がある。
抗CD11bおよび抗CD68抗体のための最適な希釈は、組織のタイプに応じて変えることができると共標識化プロトコルを開始する前に定義する必要があります。
- PBSで2回脳凍結切片を洗浄します。
- で1％H 2 O 2を含有するPBS中で5分間cubate凍結切片（蛍光増幅が西洋ワサビペルオキシダーゼ、ストレプトアビジン-HRPとのインキュベーションを必要とするため工程が必要、ステップ1.12参照）。
- 洗浄凍結切片をPBSで2回。
- 10％のNGSおよび0.3％トリトンを含むPBS中で60分間の凍結切片をインキュベートする。
- PBSは、一次抗体、ラット抗CD11b [1:30,000]、10％NGSおよび0.3％トリトンを含有する4℃で一晩凍結切片をインキュベートする。
- 洗浄は、PBSで2回（5分）凍結切片。
- ビオチン化二次抗ラットAB [1:200]と1％のNGSを含むPBS中で60分間の凍結切片をインキュベートする。
- 洗浄凍結切片をPBSで2回。
- TNTで洗浄する凍結切片（トリス-HCl、NaClを、ツイーン：0.1 M TRIS-塩酸、pH 7.4、0.15 MのNaCl、0.05％のTween 20）。
- TNB中で1.5時間、凍結切片をインキュベートします（バッファをトリス塩酸-NaClのブロッキング：0.1 Mトリス塩酸、pH 7.4、0.15MのNaCl、適切なキットは0.5％ブロッキング試薬（試薬の表を参照））。
- ウォッシュクライオのセクションでは、TNTで時間を3倍。
- ストレプトアビジン-HRP [1:100]を含むTNB中の凍結切片をインキュベートする。
- 洗浄は、TNTで3回凍結切片。
- シアニン5チラミド[1:300]を含む増幅希釈液中で8分間の凍結切片をインキュベートする。
- 洗浄凍結切片をPBSで3回。
- 10％のNGSおよび0.1％トリトンを含むPBS中で60分間の凍結切片をインキュベートする。
- 一次抗体ラット抗CD68 [1:200]、3％NGSおよび0.3％トリトンを含むPBSで一晩4℃で凍結切片をインキュベートする。
- 洗浄凍結切片をPBSで3回。
- fluorconjugated二次抗体アレクサ546抗ラット[1:500]と1％のNGSを含むPBS中で60分間の凍結切片をインキュベートする。
- 洗浄凍結切片をPBSで3回。
- ヘキスト1μg/ mlのを含むPBS中で10分間凍結切片をインキュベートする。
- 洗浄凍結切片をPBSで3回。
- 長引かゴールド凍結切片をマウントします。
2。共焦点顕微鏡による三次元画像の取得
- 励起する蛍光色素の波長によって励起レーザを選択します（Cy5の、CD11bのためのHe-Ne赤、Alexa546、CD68およびヘキスト、核についてのUVダイオードのヘリウムネオングリーン）。
- 光信号収集のための最高のダイクロイックミラーの組み合わせを選択します。
- 800×600ピクセルの最小の画像の解像度を設定します。
- 落射蛍光を利用して、関心領域を特定し、徐々に対物レンズ40倍に倍率を上げる。
- レーザー走査顕微鏡（LSM）モダリティに切り替えます。
- 光電子増倍管（PMT）と、各チャンネルのゲインを調整するために繰り返しスキャンを実行します。レーザは、セットを容易にするために個々にオンにすることができる。不要な非特異的シグナルを避けるために、可能な限り低く、利得を保持します。
- REPEとtitiveスキャン実行して、z軸（合計z軸の長さ=10μm）を、下限および上限の極端な値を定義するためにフォーカス制御を移動する。
- 反復的なスキャンを停止します。
- ステップサイズを定義します。これは、z軸上で1：01標準サイズ比を得るために、画素サイズ（0.225ミクロン）のできるだけ近くにあるべきである。
- カルマンフィルタを少なくとも2回をアクティブにします。
- ブリードスルー効果を避けるために、シーケンシャルスキャンモードを有効にします。
- ハーフウェイz軸に沿って移動し、XY順次スキャンを実行します。 PMTの設定およびゲイン（良好な信号/ノイズ比）を確認してください。満足できない場合は、手順2.6を繰り返します。
- XYZ買収を実行します。
- multitiffファイルとしてデータをエクスポートします。各multitiffファイルは、通常、3色チャネル（青、緑、赤）と44の焦点面が含まれています。
3。共焦点取得の立体図と3次元レンダリング
IMARISソフトウェアにmultitiffファイルをアップロードし、次のようにそれらを処理する。
- オープンソフトウェア。
- 上回るビューを選択します。
- multitiffファイルをアップロードします。
- 各チャネルの希望の色を選択します。
- 表示調整パネルの最小値を大きくすることにより、バックグラウンドのノイズを除去する。個別に各チャネルを調整します。
- セクション·ビューに移動します。共局在（黄ピクセル）を探して、Z軸に沿って移動する。
- （ すなわち、固体のオブジェクトに属している）の共局在は、z軸に沿って存在しているかどうかを見るために、黄色のエリアをクリックしてください。 Z軸投影は、図の右と下の部分に表示されます。
- スナップショットを作成します。
- ビューを上回る戻ります。
- 細胞または細胞のクラスターを単離するために、3Dをトリミング。
- 表示調整パネル上の1チャンネルを選択します。
- 上回る/サーフェスアルゴリズムビルダーを選択します。アルゴリズムステップ：
- チャンネルを選択します。
- しきい値を定義します（Tで同じ最小値を使用彼は） 調整パネルを表示します 。
- サイズ変更を定義します。
- （0.200 =最良）スムージング定義します。
- 色の外観を定義する。
- アルゴリズムを終了する。
- 各チャンネルについて、手順3.12。
- 表示調整パネルの蛍光チャネルの選択を解除し、すべての3 の面を選択します。
- 最高の景色を見つけて、ボリュームを移動します。
- スナップショットを作成します。
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Representative Results
標識プロトコルおよび共焦点買収が虚血領域に行われる場合の結果の一例が図1Aおよび図1Bに示されている。取得された画像の二次元図で二十四時間虚血（A）の後で、リソソームマーカーCD68（緑）が虚血性コア中に存在する肥厚性アメーバ様CD11b細胞（赤色）において発現されることを示している。ボーダーゾーン（B）にはCD11b陽性細胞は、丸い細胞体とCD68に対する肯定枝状のプロセスを表示します。 Z軸突起（右と下の部分A及びB）は、単一の平面図に記載されたマーカーの分布はまた、z軸に沿って存在するか否かの可視化を可能にする。共局在が発生した場合には、黄色のピクセルが生成されます。 CD11bのは、C3フラグメントのための受容体であり、膜の分布を示す。 CD68は、リソソームにラベル付けし、主に細胞質ゾル中にこのように存在している。 CD11b/CD68二重陽性細胞は、通常、共局在ボクセルの小さな割合を有し、ほとんどの場合には、CD11bのCD68（ 図1A）を取り囲む。ファゴソームは、食作用プロセスの間に細胞膜に結合している場合にのみ、CD11bおよびCD68との間の共局在（ 図1B）が実現される。
図2においては、マーカーの共発現の定義につながる画像処理が報告されている。 Aにおいて、共焦点取得された画像の三次元図でCD68陽性細胞（緑色）及びYm1は（赤）陽性細胞の存在を示すが、それは共局在化の定義のために使用されなくてもよい。確かに、観察者の視野に平行に敷設蛍光ボクセルは、マーカー（これらは立体物ではなく、透明効果があるかもしれない）の間の実際の距離に関係されないよう、共局在信号（黄色）を得たことがあります。共局在を定義するには、z軸の投影を持つ単一の平面図であるべき（B）が好ましい。共局在（黄色画素）を探してZ軸に沿って移動すると、Z軸投影（右及びBの下部に見える）が得られる。蛍光ボクセルは3次元レンダリング（ 図2C）により、立体オブジェクトに変えることができる。ボリュームの回転は、オブジェクトを見て、適切に特定の細胞体にマーカー発現を割り当てるための（ 'C''''に' Cからの）最高の眺めを可能にします。高倍率と3次元レンダリングの固体ビューが細胞（DD''）のクラスターでマーカー発現を定義することができます。高倍率と3Dレンダリングした後、2マーカー（CD68およびYm1は）が近接しているが、異なるセルに属しているように見える。
虚血領域中のM / M表現型マーカーの共発現の評価の一例が図3に示されている。のCD11b（赤）、MAの共発現M / Mの活性化/人材紹介のrker、CD68（緑）の代替で表現リソソームなどYm1はに関連したマーカーは、M / Mが虚血領域において研究されて活性化した。 M / Mの機能状態に関する詳細を提供するために、我々はニューロン（NeuNを、青）との関係を評価した。サンプリングされた領域（ 図3A〜3D）の画像は、三次元物体（ 図3A'-3D '）として評価される。 CD11b/CD68二重陽性細胞が3次元レンダリング（ 図3A 'および3B'）で検査される。分析では、神経細胞（青色）は、多くの場合、虚血24時間後の両方の虚血性コアとの国境地帯でのCD11b陽性細胞によって包まれていることが明らかになった。ほとんどの場合、神経細胞の周囲のCD11b細胞は、これらの細胞が活発な貪食作用に従事していることを示唆し、両ゾーンで、CD68陽性である。 CD11b/Ym1二重陽性細胞（ 図3Cおよび3C '）のいずれもphagocyに係合するように表示されないニューロンとTICの相互作用、のNeuN陽性細胞と接触してCD11b/Ym1二重陽性細胞は決してされていません。
| 抗CD11b | TSA増幅（Cy5の）λ= 646 nmの | アレクサ546抗ラットλ= 532 nmの |
| 1:800 | + | + |
| 1:1.500 | + | + |
| 1:3,000 | + | + |
| 1:5,000 | + | + |
| 1:10,000 | + | + |
| 1:30,000 | + | - |
| 1:40,000 | - | - |
表1。ラット抗CD11b抗体の作業希釈の微調整。
図1。 CD11bの（赤色）およびCD68（緑色）pMCAOの24時間後の共発現。CD11bおよびCD68のために共焦点顕微鏡は、虚血コアCD11b細胞において優勢に球状であり、それらのいくつかは、CD68（A）に陽性であることを示している。ボーダーゾーン（B）は丸みを帯びた分枝の両方CD11b細胞は、CD68に陽性である。核は青である。バー：20μmである。
図2。 pMCAOの24時間後にCD68（緑）、Ym1は（赤色）の共発現。共焦点虚血領域で取得した画像、CD68（緑）、Ym1は（赤）および核（青）（A）の3次元図である。 z軸突起を、単一の平面図で共局在ボクセルの存在（無黄Siから除外gnal、B）。 3次元レンダリングは、ソリッドオブジェクト（C）への蛍光ボクセルを回す。ボリュームは最高の眺め（C'-C''''）を見つけるように回転される。近い細胞のクラスター（D）に目を向ける。三次元レンダリングは、マーカーが細胞（D '）のクラスターの場合には同一の細胞によって発現されるかを定義するのに役立つ。 CD68とはYm1は、密着して、同一の細胞によって同時発現されていないが、明らかに異なる核（D''）に関連付けられている。バー：5μmのは大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図3。時以降24時間でCD68（緑）またはYm1はとのCD11b（赤）とのNeuN（青）の共発現CAOの虚血性心（A; 3Dは、Aでのレンダリング'）内の共焦点顕微鏡。とボーダーゾーン（BB中は'）CD11b/CD68二重陽性細胞は、おそらく神経細胞の食作用を示す、のNeuN陽性細胞を包むことが明らかになった。 YM1陽性細胞は、専ら、虚血性心（CD）に位置しています。 CD11b/Ym1二重陽性細胞の共焦点分析は、それらが神経細胞に貪食作用に関与表示されないことを示しています（のNeuN陽性細胞、C、3Dは、Cでのレンダリング'）。虚血性心（C-C '）とボーダーゾーン（D-D'）の両方でのCD11b単一の陽性細胞が神経細胞を取り囲んでいる。バー：20μmの大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
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Discussion
ここでは虚血領域への局在化およびM / M表現型マーカーの共発現を調査するための強力なアプローチ（より詳細な分析のために、参考文献6を参照）のような三次元共焦点解析に続いて免疫蛍光ベースのプロトコルを提示する。この方法は、3次元共焦点イメージングとM / Mの活性化の関連マーカーの特異的染色を兼ね備えています。抗体、血清および作業希釈液をfluorconjugatedの微調整を検討したマーカーのSN比に最適な信号を可能にする。三次元レンダリングを得るための画像処理は、M / M.の機能状態を示す取得された画像を作り、セルのクラスタ内のマーカー発現の定義を可能にする研究が増えて、今のM / Mは、多様な表現型を獲得し、周囲の信号に応じて、異なる機能のプログラムを係合することができる、高度なプラスチック細胞であることに同意するものとします。炎症環境は、時間の経過とともに進化し、組織化することがM / Mの偏光、in vivo試験の方がはるかに有益in vitroモデルよりも、リクルート/活性化した細胞の完全なネットワークを再現することができないこと。
修正とトラブルシューティング
ここに提示プロトコルは、具体的には、マウス脳の凍結切片（20ミクロン）上で開発されている。使用される作業希釈物および抗体は、動物種に、又は考えられる組織の性質に応じて変更することができる。また、免疫蛍光プロトコルはニューロンcolabelingを含むように修飾することができる。この場合、1.17〜ステップと、次のようにプロトコルの1.19に変更してもよい。
- 一次抗体ラット抗CD68を含むPBS [1:200]、一次抗体マウス抗NeuNの[1:100]、3％NGSおよび0.3％トリトン中で一晩4℃でインキュベートする。
- fluorconjugated二次抗体アレクサ546抗ラット[1:500]、アブアレクサ488抗マウスを含むPBS中で60分間インキュベートします[1:500]そして1％NGS。
あなたは他の抗原を検出するための抗NeuNの以外の抗体を追加することがあります。この場合、二次抗体との交差反応性を回避するために、ラットの異なる種で得られた抗体は、検討してください。使用される他の染料とオーバーラップしていない励起発光スペクトルと二次Alexaの抗体を考えてみましょう。
三次元共焦点取得のためのプロトコルは、より厚い画像ボリューム（ステップ2.7）が得られるように（ すなわち、z軸の長さを増加させる）を変更することができる。 z軸上の1:1ピクセル比（ステップ2.9）に保つ。
プロトコルの中の重要なステップ
免疫プロトコルは、適切な陰性対照を実施することによって検証される必要がある。陰性対照は、一次抗体を省略するか、または同じで分析された試料の種と反応していない一次抗体を使用して実行されるべきである目的の抗体のotypeの定常領域（ すなわち 、同じ免疫した種で得られた）。
同じ免疫した種から2の抗体が使用されている二重蛍光染色では、適切な負の制御が使用される唯一の二次抗体を省略して実行する必要があります。あなたは、異なる時点で得られた組織上で作業している場合、M / Mマーカーの発現は経時的に変化し得るように、各時点において負の制御を行う。
技術の限界
三次元共焦点イメージングは、全体の損傷部位の代表画像を提供することはできません。三次元解析は、特定のセル内のM / Mマーカー発現の確実な表現が得られるにもかかわらず、これは、関心領域全体M / M集団に存在する拡張されなくてもよい。この制限を克服するためには、興味、possiの脳領域の十分なサンプリングを提供するべきであるBLY公平な組織採取を行うために電動顕微鏡ステージを使用して。明らかに、面積当たりの取得したフレーム数を増やすと、より多くの時間のかかる手順をもたらすであろう。
既存の方法に関して、重要性
M / M分極のマーカーの発現は、以前のインビトロモデル（細胞培養物は、偏光剤に曝露）、FACS解析、MRI、および分光法、特に制限に関連付けられたすべてを含む様々な技術的アプローチにより分析された。 M / Mの分極を誘導することができる要因に関する情報を提供しながら、in vitroモデルは完全に複雑なM / M の生体内反応を反映しない場合があります。それは確かによく負傷脳において、活性化M / Mは、免疫細胞の相互作用の複雑なネットワーク12の結果として、混合した表現型および機能を発現することが確立されている。 FACS分析は、偏sの定量的尺度を提供する全体のM / Mの人口のテイト。しかし、この技術に関連した主な制限は、病変に関してM / Mマーカーの局在性の欠如にあります。さらに、組織標本から細胞懸濁液を得るためのプロトコルは、細胞をストレスおよび場合によってはそれらの表現型を変化させることができる。 MRIおよび分光法は、 インビボでの脳領域内M / M細胞を局在化することを可能にするが、低い分解能を有し、M / Mマーカーの広い範囲を研究するために適用することができない。
三次元共焦点分析は、虚血領域へのM / M表現型マーカーの局在化および共発現に関する情報を提供し、従って、十分にM / Mの偏光状態を調べるために、上記技術に関連すると報告されるべきである。
まとめと今後のアプリケーション
記載されたアプローチは、脳卒中の研究の分野において、ならびに他のACUTで幅広い用途に適しているEまたは傷害と回復中のM / Mの二重の役割が提案されている慢性神経疾患。また記載され後処理解析が実り、細胞レベルで、または信号が選択的に異なる空間の平面にローカライズする必要があるような場合に任意の共発現または共局在を分析するために悪用される可能性があります。
より効率的な設備が利用可能になるように、次の将来的にこの技術を大幅に向上させることができた。共焦点顕微鏡は、高感度、複数のレーザ·ラインと自動で高速な組織サンプリングのためのソフトウェアを搭載したシステムのセットアップを利用することができます。これは、より高い画像品質、より厚い後天的ボリュームおよびデジタル画像にすべての生体情報を変換する目的で、複数の信号の同時取得をもたらす。最後に、蛍光レポーターでタグ特異的マーカーを使用して新しいトランスジェニック動物モデルの開発は、exprの同時分析を可能にする二光子顕微鏡に三次元画像解析を適用することによってインビボで ession。
このアプローチは、保護表現型を駆動する傾向が将来の治療戦略を開発するの斜視図で脳機能の複雑さを理解するための強力なツールを表すことができる。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
ステファノフマガッリはMonzino財団の仲間です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Rat Anti-mouse CD11b | Kindly provided by Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy | ||
| Rat Anti-mouse CD68 | AbD Serotec | MCA 1957 | |
| Rabbit Anti-mouse Ym1 | Stem Cell Technologies | 1404 | |
| H–chst 33342 | Life technologies | H21492 | |
| Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN) | CHEMICON | MAB377 | |
| Biotinilated Goat Anti-Rat antibody | Jackson Immuno Research | 112-065-143 | |
| TSA Cyanine 5 System | Perkin Elmer | NEL705A001KT | |
| Prolong Gold | Invitrogen | P36930 | |
| Anti-rat alexa 546 | Invitrogen | A-11081 | |
| Anti mouse Alexa 488 | Invitrogen | A-21121 | |
| Anti-rabbit Alexa 594 | Invitrogen | A-11037 | |
| Normal Goat Serum | Vectors Laboratories | S-1000 | |
| Tritin X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417-100 | |
| Equipment | |||
| Cryostat CM1850 | Leica | ||
| Olympus IX81 confocal microscope | Olympus | ||
| AnalySIS software | Olympus | ||
| Imaris software 5.0 | Bitplane | ||
| Photoshop cs2 | Adobe Systems | ||
| Software packages GraphPad Prism version 4.0 | GraphPad Software Inc. | ||
References
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