Summary
一种方式来获得新的见解的大脑炎症反应的复杂性呈现。我们描述了免疫为基础的协议，其次是三维共聚焦分析，以探讨局灶性脑缺血小鼠模型共表达小胶质细胞/巨噬细胞表型标志物的图案。
Abstract
脑卒中小胶质细胞/巨噬细胞后（M / M）进行快速活化，包括新颖的表面抗原和生产的建立和维持炎症反应介质的表达显着形态学和表型的改变。新的证据表明，M / M是高塑性细胞急性脑损伤后，可以假定经典的促炎症（M1）或替代消炎（M2）的激活。但是M / M型标志物表达，他们的共存和时间演化的脑损伤的完整的特征是人仍下落不明。
免疫荧光协议专门染色的M / M激活相关标志物可在缺血性脑进行。在这里，我们提出了免疫为基础的协议，其次是三维共聚焦分析，作为一个强大的方法，调查本地化和共表达M / M型标志，如图案细胞CD11b，CD68，的Ym1，在小鼠局灶性脑缺血引起的大脑中动脉（PMCAO）的永久性闭塞模型。污渍区域的二维分析表明，每个标记是关联到一个定义的M / M的形态，并具有一个给定的定位中的缺血性损伤。 M / M的表型标记物的共表达模式可以通过在局部缺血区域的三维共聚焦成像来评估。图像可以在一个确定的容积被收购（10μm的z轴和一个0.23微米的步长大小，对应于180×135×10微米的体积）与连续扫描模式，以尽量减少渗色的效果，并避免波长重叠。图像，然后处理由软件Imaris里的手段来获得三维渲染。三维效果图实视图允许在集群细胞标志物表达的定义。我们表明，M / M具有分化向多个表型的能力，这取决于在病变部位和Ti的位置我受伤后。
Introduction
急性脑损伤，小胶质细胞迅速激活并发生剧烈的形态和表型的变化1-3。这种内在的反应相关联招聘血液出生的巨噬细胞迁移到损伤脑实质4,5。小胶质细胞和巨噬细胞的抗原性是无法区分的作用（以下称为M / M）在脑损伤仍有争议。越来越多的研究表明，与什么所述外围巨噬细胞，小胶质细胞和脑招募巨噬细胞可以假定不同的表型，其极端对应于经典的促炎性毒性（M1）或抗炎保护（M2）的表型。在不同的激活状态，包括亲或抗炎因子分泌，神经营养分子和溶酶体活性释放的特征的表型标志物的特定图案，其表达依赖于时间周围环境的演变。这些M / M表型在脑损伤的特征仍然是一知半解。我们使用PMCAO的一套行之有效的小鼠模型来分析的M / M表达和进化中风后。这里提出了一种基于免疫的协议旨在让洞察特定的M / M型标志，其本地化和细胞共同表达在缺血区的外观。我们研究了相关的不同的激活状态，或表型的分子数，即细胞CD11b，白细胞和M / M激活/招聘6-8的一种广泛使用的标记表示的表面标志物CD68溶酶体6,7和的Ym1分泌的标志蛋白替代性活化（M2）巨噬细胞表达和相关的回收和功能恢复9-10。
当两个标记都表达了相同的细胞，但在不同亚细胞区室，独自一人共定位可能不会有太大的INFormative。在这种情况下，可以通过使用单一的平面视图和三维效果进行共表达的分析。在这里，我们描述了一个协议来获取标记共表达的透彻三维分析。
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Protocol
1。免疫荧光
下面的协议是从心脏灌注小鼠（20毫升的PBS，0.1摩尔/升，pH为7.4，随后加入50毫升PBS中冷却的多聚甲醛中4％）中获得冠状脑冷冻切片进行。灌注后，大脑小心移除，并转移到30％蔗糖的PBS中于4℃过夜冷冻保护。 45℃下进行3分钟被密封到小瓶中并储存在-70℃直至使用前 - 大脑，然后迅速通过浸没在冷冻中的异戊烷。冠状脑冷冻切片（20微米）被连续切割，并进行免疫荧光协议11，6。
将所有试剂和样品至室温后方可使用。请注意，抗体和血清中所呈现的工作稀释液造成的，以获得最佳的性能做试验。当不同的抗体和血清的使用，该协议需要被验证。
最佳稀释度为抗CD11b和抗CD68抗体可能取决于组织的类型而变化，并且必须开始共同的标签协议事先定义。
- 用PBS洗两次脑冰冻切片。
- 在cubate冷冻切片5分钟，在PBS中含1％H 2 O 2（必需的，因为在荧光扩增需要孵化与辣根过氧化物酶，链霉抗-HRP步骤，参见步骤1.12）。
- 洗涤冷冻切片2倍的PBS。
- 孵育冷冻切片在PBS中含有10％NGS和0.3％的Triton 60分钟。
- 在PBS中含有初级抗体鼠抗CD11b [1:30,000]，10％NGS和0.3％的Triton孵育冷冻切片在4℃下过夜。
- 洗涤冷冻切片2×（5分钟），用PBS。
- 冰冻切片孵育在PBS中含有生物素标记的二抗鼠抗体[1:200]和1％NGS 60分钟。
- 洗涤冷冻切片2倍的PBS。
- 与TNT（：0.1M的Tris-HCl，pH值7.4,0.15 M氯化钠，0.05％吐温20的Tris-HCl，氯化钠，吐温）洗涤冷冻切片。
- 孵育冷冻切片1.5小时在TNB（Tris-盐酸 - 氯化钠 - 封闭缓冲液：0.1M Tris-盐酸，pH值7.4,0.15 M氯化钠，从适当的试剂盒的0.5％封闭试剂（见表试剂））。
- 洗冷冻部3X倍与TNT。
- 孵育含链霉素-HRP [1:100]中冰冻切片TNB。
- 洗3倍冰冻切片与TNT。
- 冰冻切片孵育含有花青5酪胺[1:300]中扩增稀释8分钟。
- 洗涤冷冻切片3倍的PBS。
- 孵育冷冻切片在PBS中含有10％NGS，0.1％的Triton 60分钟。
- 在PBS中含有初级抗体鼠抗CD68 [1:200]，3％NGS和0.3％的Triton孵育冷冻切片在4℃下过夜。
- 洗涤冷冻切片3倍的PBS。
- 冰冻切片孵育在PBS中含有fluorconjugated二抗Alexa的546抗鼠[1:500]和1％NGS 60分钟。
- 洗涤冷冻切片3倍的PBS。
- 孵育冷冻切片含有Hoechst的1微克/毫升的PBS 10分钟。
- 洗涤冷冻切片3倍的PBS。
- 在延长黄金装冰冻切片。
2。收购三维图像激光共聚焦显微镜
- 选择激励激光器取决于荧光染料被激发的波长（氦 - 氖红为Cy5标记，细胞CD11b;氦氖绿色Alexa546，CD68和紫外二极管为Hoechst公司，核）。
- 选择最佳的分色镜组合的光信号采集。
- 设置图像分辨率最低为800 x 600像素。
- 用落射荧光和逐步增加放大倍率为40倍物镜识别感兴趣的区域。
- 切换到激光扫描显微镜（LSM）的模式。
- 运行重复扫描来调节光电倍增管（PMT）和每个通道的增益。激光器可以逐个打开，以方便套起来。保持增益尽可能低，以避免不必要的非特异性信号。
- 与REPEtitive扫描运行时，将焦点移动控制来定义z轴（总z轴的长度= 10微米）的下部和上部极端。
- 停止重复扫描。
- 定义步长。它应该是尽可能地接近，以像素大小（0.225微米），以获得一个必须是标准1:1尺寸比例在z轴。
- 激活卡尔曼滤波器的至少2倍。
- 启动顺序扫描模式，以避免流血通的效果。
- 去中途沿z轴和运行的xy顺序扫描。检查设置了光电倍增管和增益（良好的信号/噪声比）。如果不理想，请重复步骤2.6。
- 运行XYZ收购。
- 将数据导出为multitiff文件。每个multitiff文件通常包含3个颜色通道（蓝色，绿色和红色）和44的焦平面。
3。共焦收购和三维渲染的三维视图
上传multitiff文件Imaris里的软件，并将它们处理如下：
- 打开软件。
- 选择超越看法。
- 上传multitiff文件。
- 为每个通道选择所需的颜色。
- 通过增加显示调整面板上的最小值从背景中消除噪音。单独调整每个通道。
- 去剖面视图。移动沿z轴寻找的共定位（黄色像素）。
- 点击一个黄色的区域，以查看是否共定位为沿z轴（ 即属于一个固体物体）存在。 Z轴凸起是可见的图中的右侧和底部。
- 拍摄快照。
- 回去超越看法。
- 裁剪三维分离的细胞或细胞群。
- 选择显示调节面板上的一个通道。
- 选择超越/面算法生成器。算法步骤：
- 选择通道。
- 定义阈值（使用相同的最小值在T他显示调节面板）。
- 定义调整大小。
- 定义平滑（最好= 0.200）。
- 定义颜色的外观。
- 结束算法。
- 每个通道重复步骤3.12。
- 取消选择荧光通道显示调节面板，并选择所有的三个面 。
- 移动音量，以找到最好的景色。
- 拍摄快照。
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Representative Results
当标记协议和共焦的采集进行入缺血区得到的结果的一个例子示于图1A和1B。获得的图像的二维视图显示，在缺血后24小时（A），溶酶体标记CD68（绿色）表示肥厚ameboid CD11b的细胞（红色）出现在缺血中心。在边境区（B）的CD11b阳性细胞显示圆形胞体和积极的CD68分枝过程。 Z轴投影（A和B的右侧和底部）允许的记录是否在同一平面视图中的标记分布也沿z轴现有的可视化。凡发生共定位，生成黄色像素。 CD11b的是该受体为C3片段，并显示出膜的分布。 CD68标记的溶酶体，因此是主要存在于细胞质中。 CD11b/CD68双阳性细胞通常具有共定位体素的一个小的百分比，并且在大多数情况下，细胞CD11b包围CD68（ 图1A）。只有当吞噬体都在吞噬过程中结合到细胞膜上，CD11b和CD68之间的共定位来实现（ 图1B）。
在图2中，报道，导致标记的共表达的定义中的图像处理。在A，共聚焦所采集的图像的三维视图表示CD68阳性细胞（绿色）和的Ym1（红色）阳性细胞的存在，但它可能不被用于共定位的定义。事实上，荧光体素铺设平行于观察者的观点可能会产生一个共同定位信号（黄色），可能不涉及到（他们是不牢固的物体，可能有透明效果）标记之间的实际距离。来定义的共定位，与z-轴的突起的单一平面视图应优选的（B）。移动沿Z轴寻找共定位（黄色像素）时，获得的Z轴投影（可见光到右侧和 B的底部部分）。荧光体素可以通过三维渲染（ 图2C）将变成固体物体。卷的旋转允许最佳观赏（从C'到C'''''）为观察对象，并适当标志物表达分配给特定的细胞体。高倍率及三维效果图实视图下使能在细胞簇（DD'）的定义标志物表达。高放大倍率和3D渲染后，这两个标记（CD68和的Ym1）似乎属于不同的细胞，虽然近在咫尺。
在缺血区域中的M / M的表型标记物的共表达的评价的一个实例示于图3。细胞CD11b（红色），一马共表达M / M激活/招聘rker，CD68（绿色）与溶酶体以及的Ym1相关的标志物，以替代激活的M / M表示正在调查在缺血区。提供有关M / M功能状态的详细信息，我们评估其与神经元（神经元核抗原，蓝色）的关系。采样区域（ 图3A-3D）的图像被评价为三维物体（ 图3A'-3D'）。 CD11b/CD68双阳性细胞通过立体呈现（ 图3A及3B'）检查。分析表明，神经元（蓝色）通常是由CD11b的阳性细胞在缺血后24小时包裹在缺血性核心和边缘区。在大多数情况下，周围神经细胞CD11b的细胞是阳性的CD68在两个区域中，这表明这些细胞所从事的活动的吞噬作用。概无CD11b/Ym1双阳性细胞（ 图3C和3C'）出现搞一个phagocy与神经元相互作用抽动，即CD11b/Ym1双阳性细胞老死不相往来的NeuN阳性细胞接触。
| 抗CD11b | TSA放大（Cy5标记）λ= 646 nm处 | Alexa的546抗大鼠λ= 532 nm处 |
| 1:800 | + | + |
| 1:1.500 | + | + |
| 1:3,000 | + | + |
| 1:5000 | + | + |
| 1:10,000 | + | + |
| 1:30,000 | + | - |
| 1:40,000 | - | - |
表1中。微调工作稀释鼠抗CD11b抗体。
图1。的细胞CD11b（红色）和CD68（绿色）共表达PMCAO。共聚焦显微镜对细胞CD11b和CD68 后24小时显示，在缺血中心CD11b的细胞都偏球状，其中有些是积极的，以CD68（A）。在边境区（B）两个圆，分枝CD11b的细胞是阳性CD68。细胞核为蓝色。酒吧：20微米。
图2。 CD68（绿色）和的Ym1（红色）在PMCAO。三维在缺血区，CD68（绿色），的Ym1（红色）和细胞核（蓝色）（A）收购了共焦图像的视图后24小时共表达 。与z轴投影单一的平面视图不包括共同定位体素的存在（没有黄色SIGNAL，B）。三维渲染变成荧光体素成固体物体（C）。音量旋转找到最好的视图（C'-C''''）。仔细观察到细胞簇（D）。三维渲染有助于确定是否标记由相同的细胞中的细胞（D'）的簇的情况下表达。 CD68和的Ym1，虽然在密切接触，并非由同一细胞共表达，显然正在以不同的原子核（D''）相关联。酒吧：5微米点击这里查看大图 。
图3。的细胞CD11b（红色）和的NeuN（蓝色）CD68（绿色）或在的Ym1时后24小时共表达，在缺血中心曹共聚焦显微镜（A; 3D渲染A“）和边缘区（BB'）显示，CD11b/CD68双阳性细胞包围的NeuN阳性细胞，可能表明神经细胞的吞噬作用。 YM1阳性细胞专门设成缺血核心（CD）。 CD11b/Ym1双阳性细胞的共聚焦分析显示，它们就不会出现涉及与神经元细胞吞噬相互作用（的NeuN阳性细胞，C; 3D渲染在C'）。单细胞CD11b阳性细胞在缺血性心（CC'）和边缘区（DD'）环绕神经元。酒吧：20微米点击这里查看大图 。
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Discussion
我们在座的免疫为基础的协议，其次是三维共聚焦分析作为一个强大的方法，调查国产化的M / M型标志物和共表达到缺血区域（更详细的分析见文献6）。此方法结合了M / M活化与三维共焦成像相关的标记物的特异性染色。抗体，血清和fluorconjugated工作稀释度的微调提供了最佳的信号被调查指标的信噪比。图像处理以获得三维渲染允许在细胞群标志物表达的定义，使得所获取的图像表示的M / M的功能状态越来越多的研究认为，现在的M / M是高塑性的细胞，可以获取不同的表型和从事不同功能的程序会根据周围的信号。炎症环境演变随着时间的推移，可能编排偏振的M / M，使得在体内研究更为启发比体外模型，其中招募/活化细胞的完整的网络不能被再现。
修改和故障排除
这里提出的协议已经在小鼠脑冰冻切片（20微米）而开发。使用的工作稀释液和抗体可以根据动物的种类或组织考虑的性质进行修改。此外，免疫荧光协议可以被修改以包括神经元colabeling。在这种情况下，步骤1.17和协议的1.19可作如下修改：
- 在PBS中含有初级抗体鼠抗CD68 [1:200]，初级抗体小鼠抗神经元核抗原[1:100]，3％NGS和0.3％的Triton孵育在4℃下过夜。
- 孵育的PBS中含有fluorconjugated二抗Alexa的546抗鼠[1:500]，抗体Alexa的488抗鼠60分钟[1:500]和1％NGS。
您可以添加抗体比抗的NeuN其他用于检测其他抗原。在这种情况下，考虑在不同物种从大鼠，以避免与第二抗体的交叉反应性获得的抗体。也考虑第二Alexa抗体与用其他染料不重叠的激发，发射光谱。
该协议用 于三维共焦采集可被修改（ 即增加了z轴的长度），从而获得更厚的图像体积（步骤2.7）。保持z轴的像素比为1:1（步骤2.9）。
本协议中的关键步骤
免疫荧光协议需要通过执行适当的阴性对照来验证。阴性对照应通过省略第一抗体或通过使用一个初级抗体，其不与分析样品的物种反应并具有相同的是进行otype和所关注的抗体的恒定区（ 即在相同的免疫物种中获得）。
在使用来自同一物种的免疫两种抗体双重免疫荧光染色，适当的阴性对照，必须通过省略仅用于第二初级抗体来进行。如果你是工作在不同时间点获得的组织，执行阴性对照在每个时间点，作为M / M标记物表达可能会随时间而改变。
该技术的局限性
三维共焦成像，可能难以提供整个受伤部位的代表性图片。尽管三维分析得出的M / M标志物表达的特定细胞内的一个可靠的代表性，这可能不会延长整个M / M目前在感兴趣的地区的人口。为了克服这个限制，你应该提供的利益，过关的大脑区域有足够的采样BLY使用电动显微镜阶段进行公正的组织取样。显然，增加单位面积获得的帧的数目将导致一个更耗时的过程。
相对于现有方法的意义
M / M极化标志物的表达已经被不同的技术方法，包括体外模型（细胞培养物暴露于极化剂），流式细胞仪分析，MRI和光谱，所有与特定的限制，此前相关分析。同时提供能够诱导的M / M极化的因素的信息， 在体外模型可能无法完全反映复杂的M / M 在体内的反应。它确实已经确立，在受伤的大脑，激活的M / M表达混合表型和功能，免疫细胞相互作用12复杂网络的结果。 FACS分析提供了偏振秒的定量测量泰特整个M / M人口。然而，与此技术相关的主要限制在于缺少有关的病变的M / M标记定位。此外，该协议从组织标本取得的细胞悬浮液可强调细胞，并可能改变其表型。磁共振成像和光谱学允许在体内的脑区域内的M / M细胞的定位，但是具有低分辨能力的，不能适用于研究范围广泛的M / M标记。
三维共聚焦分析提供的M / M型标志物的定位和共表达到缺血区的信息，因此应与上述报道彻查的M / M偏振态的技术有关。
结论和未来的应用
所描述的方法适用于各种各样的在中风研究领域的应用，以及在其它ACUTe或其中的M / M人身伤害和恢复的双重角色提出了慢性神经系统疾病。此外所描述的后处理分析可以卓有成效地利用来分析在细胞水平或在这些情况下，信号需要不同空间平面有选择的任何本地化的共表达或共定位。
在接下来的将来作为更有效的设备变为可用此技术可显著改善。共聚焦显微镜可以利用的一组镜头的系统具有更高的灵敏度，多重激光线和软件，自动和快速的组织取样。这将导致更高的图像质量，更厚的后天卷和同时采集的多个信号转换成与所有的生物体信息转换为数字图像的目的。最后，与标记有荧光记者特异性标志物新的转基因动物模型的开发将允许合作expr的分析分裂国家在体内通过将三维图像分析，以双光子显微镜。
这种方法可以代表一个功能强大的工具，以了解大脑功能的复杂性与未来发展治疗策略容易驱动型保护的角度。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Rat Anti-mouse CD11b | Kindly provided by Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy | ||
| Rat Anti-mouse CD68 | AbD Serotec | MCA 1957 | |
| Rabbit Anti-mouse Ym1 | Stem Cell Technologies | 1404 | |
| H–chst 33342 | Life technologies | H21492 | |
| Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN) | CHEMICON | MAB377 | |
| Biotinilated Goat Anti-Rat antibody | Jackson Immuno Research | 112-065-143 | |
| TSA Cyanine 5 System | Perkin Elmer | NEL705A001KT | |
| Prolong Gold | Invitrogen | P36930 | |
| Anti-rat alexa 546 | Invitrogen | A-11081 | |
| Anti mouse Alexa 488 | Invitrogen | A-21121 | |
| Anti-rabbit Alexa 594 | Invitrogen | A-11037 | |
| Normal Goat Serum | Vectors Laboratories | S-1000 | |
| Tritin X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417-100 | |
| Equipment | |||
| Cryostat CM1850 | Leica | ||
| Olympus IX81 confocal microscope | Olympus | ||
| AnalySIS software | Olympus | ||
| Imaris software 5.0 | Bitplane | ||
| Photoshop cs2 | Adobe Systems | ||
| Software packages GraphPad Prism version 4.0 | GraphPad Software Inc. | ||
References
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