Summary
Uma maneira de ganhar novos insights sobre a complexidade da resposta inflamatória do cérebro é apresentado. Descrevemos protocolos baseados em imunofluorescência, seguido por análise confocal tridimensional para investigar o padrão de co-expressão de marcadores fenotípicos microglia / macrófagos em um modelo de rato de isquemia focal.
Abstract
Depois de acidente vascular cerebral microglia / macrófagos (M / M) sofrer ativação rápida, com alterações morfológicas e fenotípicas dramáticas que incluem expressão de antígenos de superfície novas e produção de mediadores que se formam e mantêm a resposta inflamatória. Algumas evidências indicam que M / M são células altamente plástico que pode assumir anti-inflamatória (M2) de activação pró-inflamatória (M1) ou alternativo clássico após lesão cerebral aguda. No entanto, uma caracterização completa de M / M expressão do marcador fenótipo, sua co-localização e evolução temporal no cérebro ferido ainda está desaparecida.
Protocolos de coloração por imunofluorescência especificamente marcadores relevantes de activação M / M pode ser realizada no cérebro isquémico. Apresentamos aqui os protocolos baseados em imunofluorescência, seguido por análise confocal tridimensional como uma abordagem poderosa para investigar o padrão de localização e de co-expressão de marcadores fenotípicos M / M, comoCD11b, CD68, Ym1, no modelo de rato de isquemia focal induzida por oclusão permanente da artéria cerebral média (pMCAO). Análise bidimensional da área manchada revela que cada marcador é associado a uma morfologia M / M definido e tem uma dada localização na lesão isquémica. Padrões de M / M fenótipo marcador co-expressão pode ser avaliada por imagem confocal tridimensional na área isquémica. As imagens podem ser adquiridos ao longo de um volume definido (10 m z-eixo e um tamanho de 0,23 mM passo, o que corresponde a um volume de 180 x 135 x 10 mm) com um modo de varrimento sequencial para minimizar os efeitos de passagem de purga e de evitar a sobreposição de comprimento de onda. As imagens são, então, processado para obter representações tridimensionais, por meio de software Imaris. Visão sólida de três representações tridimensionais permite a definição de expressão do marcador em grupos de células. Nós mostramos que M / M têm a capacidade de se diferenciar para uma multiplicidade de fenótipos, dependendo da localização do local da lesão e time após a lesão.
Introduction
Após lesão cerebral aguda, microglia são rapidamente ativadas e passam por morfológica dramática e fenotípica muda 1-3. Esta resposta intrínseca está associada ao recrutamento de macrófagos nascido de sangue que migram para o parênquima cerebral 4,5 feridos. O papel da microglia e macrófagos que não são antigenicamente distintos (doravante referido como M / M) em lesão cerebral ainda é debatido. Um número crescente de estudos indicam que, à semelhança do que descrito para macrófagos periféricos, microglia e cérebro recrutados macrófagos pode assumir diferentes fenótipos cujos extremos correspondem ao clássico tóxico pró-inflamatória (M1) ou de protecção (M2) fenótipo anti-inflamatório. Os diferentes estados de activação, incluindo a secreção de factores pro-ou anti-inflamatórios, a libertação de moléculas neurotróficas e actividade lisossomal são caracterizadas por um padrão específico de marcadores fenotípicos, cuja expressão depende da temporaisevolução do ambiente circundante. A caracterização destes fenótipos M / M no cérebro feridos ainda é escasso. Nós usamos um modelo murino bem estabelecida de pMCAo para analisar a expressão M / M e evolução após o AVC. Protocolos de imunofluorescência base aqui apresentados visam a obtenção de uma visão sobre o aparecimento de marcadores específicos M / M fenótipo, sua localização e co-expressão celular na área isquêmica. Nós investigamos algumas moléculas associadas a diferentes estado de ativação ou fenótipo, ou seja, CD11b, um marcador de superfície expressa por leucócitos e um marcador amplamente utilizado de M / M ativação / recrutamento 6-8, CD68 um marcador de lisossomos 6,7 e Ym1 uma secreção proteína expressa pelo alternativamente ativados (M2) e macrófagos associados a recuperação e restauração da função 9-10.
Quando dois marcadores são expressos pela mesma célula, mas em diferentes compartimentos subcelulares, colocalização si só pode não ser tanto informative. Neste caso, a análise de co-expressão pode ser realizada utilizando único plano e vista por representações tridimensionais. Nós aqui descrevemos um protocolo para obter uma análise do marcador co-expressão completa tridimensional.
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Protocol
1. Imunofluorescência
O protocolo seguinte é realizada em crio-secções cerebrais coronais, obtidos a partir de ratinhos transcardially perfundidos (20 ml de PBS, 0,1 mol / litro, pH 7,4, seguido por 50 ml de paraformaldeído 4% gelada em PBS). Após a perfusão, os cérebros foram cuidadosamente removidos e transferidos para 30% de sacarose em PBS a 4 ° C durante a noite para crioprotecção. Os cérebros são então rapidamente congelados por imersão em isopentano a - 45 ° C durante 3 minutos antes de ser selado em frascos e armazenada a -70 ° C até à sua utilização. Criocortes cerebrais coronais (20 um) são cortados em série e submetido a protocolos de imunofluorescência 11, 6.
Todos os reagentes e amostras à temperatura ambiente antes do uso. Por favor note que as diluições de trabalho apresentados de anticorpos e soro resultou de estudos realizados, a fim de obter o melhor desempenho. Quando diferentes anticorpos e soro são utilizados, o protocolo deve ser validado.
As diluições óptimas de anti-CD11b e anti-CD68 podem variar dependendo do tipo de tecido e deve ser definida antes do início do protocolo de co-marcação.
- Lavar criocortes cerebrais duas vezes com PBS.
- Emcriocortes Cubate por 5 min em PBS contendo 1% de H 2 O 2 (etapa necessária uma vez que a amplificação de fluorescência precisa de incubação com peroxidase de rábano, com estreptavidina-HRP, ver passo 1.12).
- Criocortes Lavar 2x com PBS.
- Incubar durante 60 min criocortes em PBS contendo 10% NGS e 0,3% de Triton.
- Incubar criocortes a 4 ° C durante a noite em PBS contendo rato primária Ab anti-CD11b [1:30.000], 10% NGS e 0,3% de Triton.
- Lavar 2x criocortes (5 min) com PBS.
- Incubar durante 60 min criocortes em PBS contendo secundário biotinilado anti-rato Ab [1:200] e 1% de NGS.
- Criocortes Lavar 2x com PBS.
- Lavar criocortes com TNT (Tris-HCl, NaCl, Tween: TRIS 0,1 M-HCl, pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 0,05% de Tween 20).
- Incubar criocortes durante 1,5 horas em TNB (tampão Tris-HCl-NaCl-Blocking: TRIS 0,1 M-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,5% de reagente de bloqueio a partir de kit adequado (ver tabela de reagentes)).
- Wash crioseções 3x vezes com TNT.
- Incubar criocortes em TNB contendo estreptavidina-HRP [1:100].
- Criosecções Lavar 3x com TNT.
- Incubar criosecções por 8 minutos em Amplificação diluente contendo Cyanine 5 tiramida [1:300].
- Criocortes Lavar 3x com PBS.
- Incubar durante 60 min criocortes em PBS contendo 10% NGS e 0,1% de Triton.
- Incubar criocortes a 4 ° C durante a noite em PBS contendo primário Rato Ab anti-CD68 [1:200], 3% de NGS e 0,3% de Triton.
- Criocortes Lavar 3x com PBS.
- Incubar criocortes durante 60 min em PBS contendo fluorconjugated secundário Ab Alexa 546 anti-rato [1:500] e 1% de NGS.
- Criocortes Lavar 3x com PBS.
- Incubar criocortes durante 10 min em PBS contendo Hoechst 1 ug / ml.
- Criocortes Lavar 3x com PBS.
- Monte criosecções em Prolong Gold.
2. Aquisição de imagens tridimensionais por microscopia confocal
- Selecione os lasers de excitação, dependendo dos comprimentos de onda dos corantes fluorescentes a ser animado (He-Ne vermelho para Cy5, CD11b, He-Ne verde para Alexa546, CD68 eo diodo UV para a Hoechst, núcleos).
- Escolha a melhor combinação espelho dicróico para a coleta de sinal luminoso.
- Configure a resolução da imagem em um mínimo de 800 x 600 pixels.
- Identificar uma área de interesse, utilizando epi-fluorescência e aumentar progressivamente a ampliação para a objetiva de 40X.
- Mudar para Laser Scanning Microscopy (LSM) modalidade.
- Execute varreduras repetitivas para ajustar o fotomultiplicador (PMT) eo ganho para cada canal. Lasers podem ser ativados individualmente para facilitar a configuração. Manter ganho tão baixa quanto possível, para evitar sinais não específicos indesejados.
- Com repetitive verificação em execução, mover o foco de controlo para definir extremos superior e inferior do eixo z (comprimento total do eixo z = 10 mm).
- Pare de varredura repetitivo.
- Definir tamanho do passo. Ele deve ser o mais próximo possível ao tamanho do pixel (0,225 mm) para se obter uma proporção de 1:1 de tamanho padrão ao longo do eixo z.
- Activar filtro de Kalman, pelo menos, duas vezes.
- Ative o modo de varredura seqüencial para evitar efeitos sangram-through.
- Vá a meio caminho ao longo do eixo z e executar uma varredura seqüencial xy. Confira o set-up da PMT e ganho (boa relação sinal / ruído). Se não for satisfatória, repita o passo 2.6.
- Execute aquisição xyz.
- Exportar dados como arquivo multitiff. Cada arquivo multitiff normalmente contém 3 canais de cores (azul, verde e vermelho) e 44 planos focais.
3. Ver tridimensional de Aquisições confocal e Rendering tridimensional
Fazer upload de arquivos para o software multitiff Imaris e processá-los da seguinte forma:
- Software Open.
- Selecione a vista superar.
- Faça o upload do arquivo multitiff.
- Selecione a cor desejada para cada canal.
- Remover o ruído de fundo, aumentando o valor mínimo no painel de exibição de ajuste. Ajuste cada canal individualmente.
- Vá para a vista de seção. Mover ao longo do eixo z procurando co-localização (pixels amarelos).
- Clique sobre uma área de amarelo para ver se a co-localização está presente ao longo do eixo z (ou seja, pertencem a um objecto sólido). Projecções do eixo Z são visíveis na parte direita e na parte inferior da figura.
- Tome um instantâneo.
- Volte para superar vista.
- Colheita 3D para isolar uma célula ou um grupo de células.
- Selecione um canal no painel de ajuste de exibição.
- Selecione o superam / superfícies algoritmo construtor. Etapas algoritmo:
- Selecione canal.
- Definir limite (use o mesmo valor mínimo em tele exibir o painel de ajuste).
- Definir redimensionamento.
- Definir suavização (melhor = 0,200).
- Definir aparência de cor.
- Fim algoritmo.
- Repita o passo 3,12 para cada canal.
- Desmarque canais de fluorescência no painel de ajuste de exibição e selecione todas as três superfícies.
- Mova o volume para encontrar a melhor vista.
- Tome um instantâneo.
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Representative Results
Um exemplo dos resultados obtidos quando os protocolos de rotulagem e aquisições confocal são realizadas na região isquémica é ilustrado nas Figuras 1A e 1B. Uma vista bidimensional de imagens adquiridas mostra que, em vinte e quatro horas após a isquemia (D), o marcador CD68 lisossomal (verde) é expresso em células hipertróficas amebóides CD11b (vermelho) presentes no núcleo isquémico. Na zona de fronteira células positivas (B) CD11b exibir corpos celulares redondos e processos ramificados positivas para CD68. Projeções do eixo Z (parte direita e inferior de A e B) permitir a visualização de saber se a distribuição marcador documentados na visão único plano também está presente ao longo do eixo z. Onde ocorre co-localização, pixels amarelos são gerados. CD11b é o do receptor para os fragmentos de C3 e apresenta uma distribuição de membrana. CD68 etiquetas lisossomas e é, portanto, presentes principalmente no citosol. CD11b/CD68 células duplamente positivas têm geralmente uma pequena percentagem de voxels colocalized e na maioria dos casos cerca CD11b CD68 (Figura 1A). Só quando phagosomes são obrigados a membrana da célula durante o processo de fagocitose, uma co-localização entre CD11b e CD68 é realizado (Figura 1B).
Na Figura 2, o processamento de imagem, que leva à definição de marcador co-expressão é relatado. Em A, a visão tridimensional de imagens adquiridas confocal indica a presença de células positivas para CD68 (verde) e Ym1 (vermelho) de células positivas, mas não podem ser utilizados para a definição de uma co-localização. De fato, voxels fluorescentes postura paralela à vista do observador pode produzir um sinal colocalized (amarelo), que não pode estar relacionada com a distância real entre os marcadores (não são objetos sólidos e pode haver efeitos de transparência). Para definir co-localização, uma visão única avião com projeções do eixo z deve serpreferido (B). Movendo-se ao longo do eixo Z em busca de co-localização (pixels amarelos), a projeção do eixo Z é obtido (visível à direita e parte inferior do B). Voxels fluorescentes podem ser transformar em objectos sólidos por apresentação tridimensional (Figura 2C). A rotação do volume permite a melhor vista (de C 'para C''''') para olhar para os objetos e devidamente atribuir expressão do marcador a um corpo celular específica. Alta ampliação e visão sólida de renderizações tridimensionais permitem definir a expressão do marcador em aglomerados de células (DD''). Após alta ampliação e renderização em 3D, os dois marcadores (CD68 e Ym1) parecem pertencer a diferentes células, embora em estreita proximidade.
Um exemplo da avaliação do de M / M de co-expressão do fenótipo marcador na região isquémica é mostrado na Figura 3. Co-expressão de CD11b (vermelho), uma marker de M / M de activação / recrutamento, CD68 (verde) um marcador associado com lisossomos, bem como Ym1, expressa pela alternativa activado M / M são investigadas na área isquémica. Para fornecer mais detalhes sobre o estado funcional de M / M, avaliamos a sua relação com os neurônios (NeuN, em azul). Imagens da área amostrada (Figura 3A-3D) são avaliados como objetos tridimensionais (Figuras 3A'-3D "). CD11b/CD68 células duplamente positivas são examinados pela apresentação tridimensional (Figuras 3A 'e 3B'). Análise revela que neurónios (azul) são muitas vezes envolta por células positivas para CD11b, tanto do núcleo e das fronteiras de zona isquémica em 24 horas após a isquemia. Na maioria dos casos as células vizinhas CD11b neurónios são positivos para CD68 em ambas as zonas, o que sugere que estas células estão envolvidas na fagocitose activo. Nenhuma das células positivas CD11b/Ym1 dupla (Figuras 3C e 3C ') parecem envolver um phagocyinteração tic com os neurônios, sendo células positivas duplas CD11b/Ym1 nunca em contato com células positivas NeuN.
| anti-CD11b | Amplificação TSA (Cy5) λ = 646 nm | Alexa 546 anti-rato λ = 532 nm |
| 1:800 | + | + |
| 1:1.500 | + | + |
| 1:3.000 | + | + |
| 1:5.000 | + | + |
| 1:10.000 | + | + |
| 1:30.000 | + | - |
| 1:40.000 | - | - |
Tabela 1. O ajuste fino de diluição de trabalho para o anticorpo anti-CD11b rato.
Figura 1. A co-expressão de CD11b (vermelho) e CD68 (verde) 24 horas após a microscopia pMCAO. Confocal para CD11b e CD68 mostra que no núcleo isquémico células CD11b são prevalentemente globular e alguns deles são positivas para CD68 (A). Na zona de fronteira (B) células CD11b tanto arredondadas e ramificadas são positivas para CD68. Os núcleos são em azul. Bares: 20 m.
Figura 2. Co-expressão de CD68 (verde) e Ym1 (vermelho) em 24 horas após a vista pMCAO. Tridimensional de uma imagem confocal adquirida na área isquêmica, CD68 (verde), Ym1 (vermelho) e núcleos (azul) (A). Vista um único plano com as projeções do eixo z exclui a presença de voxels colocalized (sem si amarelonal, B). Rendição tridimensional gira voxels fluorescentes em objetos sólidos (C). O volume é girado para encontrar a melhor vista (C'-C''''). Olhar mais atento a um conjunto de células (D). Apresentação tridimensional ajuda a definir se os marcadores são expressos pela mesma célula no caso de um conjunto de células (D '). CD68 e Ym1, embora em contato próximo, não são co-expressos pelas mesmas células, sendo claramente associados a diferentes núcleos (D''). Bares: 5 mm. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 3. Co-expressão de CD11b (vermelho) e NeuN (azul) com CD68 (verde) ou com Ym1 em 24 horas após pMMicroscopia confocal CAO no núcleo isquêmico. (A; renderização em 3D em A ') e na zona de fronteira (BB') revela que CD11b/CD68 células duplo positivas envolvem células positivas NeuN, possivelmente indicando a fagocitose dos neurônios. Ym1 células positivas estão localizados exclusivamente no núcleo isquémico (CD). Análise confocal de CD11b/Ym1 células duplo positivas mostra que eles não aparecem envolvidos em uma interação fagocíticas com os neurônios (células positivas NeuN, C; de renderização 3D em C '). CD11b células positivas individuais, tanto núcleo isquêmico (CC ') e zona de fronteira (DD') cercam os neurônios. Bar:. 20 mM Clique aqui para ver maior figura .
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Discussion
Apresentamos aqui protocolos baseados em imunofluorescência, seguido por análise confocal tridimensional como uma abordagem poderosa para investigar a localização e co-expressão de marcadores do fenótipo M / M para a área isquêmica (para uma análise mais detalhada, ver ref 6). Este método combina a coloração específica de marcador relevante de activação M / M e um imagem confocal tridimensional. O ajuste fino de anticorpos no soro, e fluorconjugated diluições de trabalho permite melhor sinal-ruído dos marcadores investigados. O processamento de imagem para obter três representações tridimensionais permite a definição de expressão do marcador em aglomerado de células, fazendo com que as imagens adquiridas indicativo do estado funcional de M / M. Um número crescente de estudos concordam que M / M são células altamente plástico que pode adquirir diversos fenótipos e envolver diferentes programas funcionais dependendo dos sinais circundantes. O ambiente inflamatório evolui ao longo do tempo e pode orquestrar apolarização de M / M, fazendo com que os estudos in vivo, muito mais instrutivo do que em modelos in vitro, em que a rede completa de células activadas / recrutados não pode ser reproduzida.
Modificações e solução de problemas
Os protocolos aqui apresentados foram desenvolvidos especificamente em criossecções rato cerebrais (20 mm). Diluições de trabalho e os anticorpos utilizados podem ser modificados de acordo com as espécies de animais ou para a natureza do tecido considerado. Além disso, o protocolo de imunofluorescência pode ser modificado para incluir colabeling neurónio. Neste caso, os passos de 1.17 e 1.19 do protocolo pode ser alterado da seguinte forma:
- Incubar a 4 ° C durante a noite em PBS contendo primário Rato Ab anti-CD68 [1:200], rato primária Ab anti-NeuN [1:100], 3% de NGS e 0,3% de Triton.
- Incubar por 60 minutos em PBS contendo fluorconjugated secundário Alexa 546 Ab anti-Rato [1:500], Ab Alexa 488 anti-rato [1:500]e 1% de NGS.
Você pode adicionar outros do que anti-NeuN anticorpos para a detecção de outros antígenos. Neste caso, consideram anticorpos obtidos em diferentes espécies de rato para evitar reactividade cruzada com anticorpos secundários. Considere também anticorpos Alexa secundárias com um espectro de emissão de excitação não-sobreposição com outros corantes utilizados.
O protocolo para a aquisição confocal tridimensional podem ser modificados (ou seja, o aumento do comprimento do eixo z), de modo a obter-se mais espessos volumes de imagem (passo 2.7). Manter uma proporção de 1:1 de pixel sobre o eixo z (passo 2.9).
As etapas críticas no âmbito do protocolo
Protocolos de imunofluorescência precisam ser validados através da realização de controlos negativos apropriados. Um controlo negativo não deve ser realizada por omitindo o anticorpo primário, ou por meio de um anticorpo primário que não reage com as espécies da amostra analisada e que tem o mesmo éotype e região constante (isto é obtido com as mesmas espécies imunizados) do anticorpo de interesse.
Na coloração de fluorescência dupla, onde são usados dois anticorpos das mesmas espécies imunizados, o controlo negativo apropriado deve ser realizada por omitindo apenas o segundo anticorpo primário utilizada. Se você estiver trabalhando em tecidos obtidos em momentos diferentes, realize o controle negativo em cada ponto do tempo, como M / M expressão do marcador pode variar ao longo do tempo.
Limitações da técnica
Imagem confocal tridimensional pode não fornecer uma imagem representativa de toda a área lesada. Embora a análise tridimensional proporciona uma representação de confiança de M / M de expressão do marcador dentro de células específicas, que não pode ser alargada a todo M / M população presente na área de interesse. Para superar esse limite, você deve fornecer uma amostragem suficiente de a área do cérebro de interesse, posbly usando um palco motorizado microscópio para realizar amostragem de tecido imparcial. Obviamente, o aumento do número de quadros adquiridos por área resultaria num processo mais demorado.
Significado no que diz respeito aos métodos existentes
A expressão dos marcadores de M / M de polarização tem sido previamente analisada por abordagens diferentes técnicas, incluindo modelos in vitro (culturas de células expostas a agentes de polarização), análise de FACS, e espectroscopia de ressonância magnética, todos associados com limitações específicas. Ao fornecer informações sobre os fatores capazes de induzir M / M polarização, modelos in vitro podem não espelhar completamente o complexo M / M em resposta vivo. Tem de facto sido bem estabelecido que, no cérebro lesionado, activado M / M expressam fenótipos e funções misturadas, como um resultado da rede complexa de interacções de células imunitárias 12. A análise FACS fornece uma medida quantitativa da polarização state de toda a população M / M. No entanto, a maior limitação associada a esta técnica reside na falta de localização de marcadores m / m em relação à lesão. Além disso, o protocolo para obter suspensões de células a partir de amostras de tecido pode enfatizar as células e possivelmente alterar seu fenótipo. Ressonância magnética e espectroscopia de permitir localizar as células M / M nas áreas do cérebro in vivo, mas tem um poder de resolução baixa e não pode ser aplicado para estudar uma vasta gama de marcadores de M / M.
Análise confocal tridimensional fornece informações sobre a localização e co-expressão de marcadores do fenótipo M / M para a área isquêmica e deve, portanto, ser associados com as técnicas relatadas acima para investigar estados de polarização M / M completamente.
Conclusão e futuras aplicações
A abordagem descrita é adequada para uma ampla gama de aplicações no campo da pesquisa de acidente vascular cerebral, bem como em outros acute ou doenças neurológicas crônicas, onde foi proposto um duplo papel de M / M em lesões e recuperação. Além disso, a análise pós-tratamento descrito pode ser proveitosamente explorados para analisar qualquer co-expressão ou co-localização no nível celular ou naqueles casos em que os sinais têm de ser selectivamente localizadas em diferentes planos espaciais.
Em um futuro próximo esta técnica poderia ser significativamente melhorada como equipamento mais eficiente se torna disponível. Microscópios confocal poderia aproveitar o set-up de sistemas com maior sensibilidade, múltiplas linhas de laser e software para amostras de tecido automática e rápida. Isto irá resultar em maior qualidade de imagem, os volumes adquiridos mais espessas e aquisição simultânea de vários sinais com o objectivo de converter toda a informação biológica numa imagem digital. Finalmente, o desenvolvimento de novos modelos animais transgénicos com marcadores específicos marcados com repórteres fluorescentes que permitem a análise de co-expressão in vivo através da aplicação de análise de imagem tridimensional para microscopia de dois fótons.
Esta abordagem pode representar uma ferramenta poderosa para entender a complexidade do funcionamento do cérebro com a perspectiva de desenvolver estratégias terapêuticas futuras propenso a conduzir um fenótipo de proteção.
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Disclosures
Autores têm nada a revelar.
Acknowledgments
Stefano Fumagalli é um companheiro da Fundação Monzino.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Rat Anti-mouse CD11b | Kindly provided by Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy | ||
| Rat Anti-mouse CD68 | AbD Serotec | MCA 1957 | |
| Rabbit Anti-mouse Ym1 | Stem Cell Technologies | 1404 | |
| H–chst 33342 | Life technologies | H21492 | |
| Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN) | CHEMICON | MAB377 | |
| Biotinilated Goat Anti-Rat antibody | Jackson Immuno Research | 112-065-143 | |
| TSA Cyanine 5 System | Perkin Elmer | NEL705A001KT | |
| Prolong Gold | Invitrogen | P36930 | |
| Anti-rat alexa 546 | Invitrogen | A-11081 | |
| Anti mouse Alexa 488 | Invitrogen | A-21121 | |
| Anti-rabbit Alexa 594 | Invitrogen | A-11037 | |
| Normal Goat Serum | Vectors Laboratories | S-1000 | |
| Tritin X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417-100 | |
| Equipment | |||
| Cryostat CM1850 | Leica | ||
| Olympus IX81 confocal microscope | Olympus | ||
| AnalySIS software | Olympus | ||
| Imaris software 5.0 | Bitplane | ||
| Photoshop cs2 | Adobe Systems | ||
| Software packages GraphPad Prism version 4.0 | GraphPad Software Inc. | ||
References
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