Summary
We beschrijven hier een platform dat comet assay detectie van DNA-schade met ongekende doorvoer toestaat. De inrichting patronen zoogdiercellen in een microarray en maakt parallelle verwerking van 96 monsters. De benadering maakt analyse van basisniveau DNA schade, blootstelling DNA schade en DNA herstel kinetiek.
Introduction
De eencellige gelelektroforese (SCGE) assay (aka de komeet assay) is een veel gebruikte techniek voor de kwantificering van een breed spectrum van DNA laesies, waaronder base laesies, abasische locaties, enkele breuken, dubbele breuken, crosslinks en alkali gevoelige sites. Het onderliggende principe van de test is dat beschadigd DNA migreert sneller dan onbeschadigd DNA als gevolg van fragmentatie en verlies van superhelische structuur. De mate van migratie is evenredig met de hoeveelheid DNA schade en kan worden gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie. Beeld-opnemen en intensiteitprofiel analyse van individuele comet-vormige DNA leveren dan parameter metingen zoals staartlengte, staartmoment en% DNA in de staart naar het niveau van DNA schade in een cel 1-4 onthullen.
Momenteel zijn er twee veelgebruikte versies van de komeet assay: a) alkaline comet assay en b) neutraal comet assay. De alkaline comet assay is de meestgebruikte versie met een hoge pH buffer gebruikt om DNA ontspannen voor elektroforese en dus detecteert alle soorten breuken en alkali-gevoelige plaatsen. De neutrale comet assay, daarentegen, is onervaren omdat het een neutrale buffer om een dubbele helices behouden en alleen detecteren dubbelstrengsbreuken 2,5. Voor chemische en fysische agentia die DSB's veroorzaken, worden SSBS gemaakt in onderling overleg, en worden gevormd op een veel hoger niveau (bijvoorbeeld γIR-geïnduceerde SSBS zijn een orde van grootte meer gemeen dan DSB's). Voor de meeste DNA-beschadigende blootstellingen, DSB's zijn veel minder vaak voor dan andere klassen van DNA-schade, en zijn daardoor moeilijker te ontdekken. We hebben de detectie raam van beide versies aangetoond in eerdere publicaties. 6,7
Hoewel de komeet assay is routinematig gebruikt voor fundamenteel onderzoek op DNA-schade en herstel en genotoxiciteitsonderzoeken 1,2,8-15, is de test gemeld een slechte reproduceerbaarheid te wijten aan sample-to-monster persoon tot persoon lab tot lab variabiliteit. Bovendien is de test lage doorvoer, mede omdat beeldacquisitie en gegevensanalyse omslachtig. Samen vormen deze beperkingen bijdragen aan de relatief lage aanvaarding grootschalige studies. Door de integratie van techniek technologieën en principes, de CometChip brengt een oplossing voor de problemen van de doorvoer en inconsistenties die worden geassocieerd met de traditionele komeettest 6,7. In het kort, de chip maakt, wordt een mal microfabricated met fotolithografie om micropalen met een diameter zo klein als die van een enkele cel te creëren. De mal wordt vervolgens gebruikt om het stempel op gesmolten agarose, resulterend in een array van microputjes na de gel stolt. Chips worden ontwikkeld om onderzoekers met variabele afmetingen putten te verstrekken aan compatibel met verschillende celtypen. Om de chip te laden, worden de cellen in de media mogen vestigen in de putten door de zwaartekracht; overtollige cellen worden weggespoeld. Gevangen cellen worden ons dan ingekapselding een dunne laag smeltpunt agarose, en een bodemloze 96 putjes plaat wordt vervolgens geklemd aan het gel oppervlak 96 macrowells maken met ieder honderden microputjes op het bodemoppervlak.
Dit protocol beschrijft de algemene procedures voor experimenten met deze chip, die gelbereiding, celbelasting, dosering en reparatie, cellysis, elektroforese en fluorescentie beeldvorming omvatten. We tonen twee voorbeelden van dosis respons experimenten met lymfoblast cellen blootgesteld bekende DNA beschadigende agentia, met alkalische en neutrale versies van de test respectievelijk. Twee reparatie experimenten worden ook getoond te beschrijven hoe reparatie respons na belichting kan worden geëvalueerd met behulp van het systeem.
Protocol
1 Voorbereiding van de Spaander
- Verwijder chip gel uit de verpakking en plaats in een een-goed rechthoekige plaat, gel film naar beneden.
- Was gel in 25 ml 1x PBS gedurende 15 min, tweemaal herhalen.
- Stel gel op glasplaat en label oriëntatie van gel dienovereenkomstig.
- Druk voorzichtig een omgekeerde bodemloze 96-well plaat op de gel; Zorg ervoor dat alle putjes van de bodemloze put plaat zijn binnen het gebied van de gel.
- Gebruik 1.5'' binder clips aan weerszijden van de plaat klemming vast met het glas.
- Zuig overtollige PBS buffer in elk putje.
2 laden Cellen
- Bereiden celsuspensies:
- Verende cellijnen celsuspensie verdund in medium tot een uiteindelijke concentratie van 10 5 -10 6 cellen / ml te verkrijgen.
- Voor aanhangend cellijnen, volgt normaal losmaken / trypsinisatie protocollen en dilute vrijstaande cellen in medium tot een uiteindelijke concentratie van 10 5 -10 6 cellen / ml. Indien cellen aggregeren passen celsuspensie in een cel filter om een enkele celsuspensie te verkrijgen.
- Voeg 100 ul celsuspensie aan elk putje van de 96-well plaat.
- Afdekplaat met de gel film om verdamping van media te voorkomen.
- Laat cellen te laden ten minste 30 min bij 37 ° C incubator.
- Verwijder chip van incubator en zuig media uit elk putje.
- Verwijder bindmiddel clips bodemloze 96-well plaat; Houd de chip met de glasplaat schuin en voorzichtig spoelen met 1x PBS om overmaat cellen in agarose te verwijderen.
- Controleer cel inladen met een helder veld microscoop met een 4x objectief. Als er onvoldoende lading wordt waargenomen, herhaal vanaf stap 2.1.
- Plaats geladen chip op een vlakke ondergrond (lab bench). Overlay chip met 1% laag smeltpunt (LMP) agarose die vooraf verwarmd bij 37 ° C. Gebruik ongeveer 2̵1, 3 ml LMP agarose is nodig voor elke chip.
- Laat overlay eerste stollen bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten en vervolgens naar 4 ° C koelkast 5 minuten voor volledige gelering.
3 Doseren en Reparatie
OPMERKING: Om de uitgangssituatie DNA-schade niveau studeren, ga dan naar stap 4.
- Lijn de putjes van de chip (gemaakt van eerdere klemming) met de putjes van een nieuwe bodemloze 96-well plaat. Re-press de bodemloze 96-well plaat aan de bovenkant en veilige klemming met bindmiddel clips.
- Voeg 100 ul van chemische of de gewenste dosis aan elk putje van de plaat met 96 putjes; uitvoeren dosering / behandeling op ijs of 4 ° C koelkast gewenste tijdsduur.
- Na het doseren, aspireren chemicaliën uit elk putje en spoel resterende chemische weg met 1x PBS. Als directe schade hier wordt bestudeerd, ga verder met stap 4.
- Om herstelkinetiek bestuderen, zodat cellen in de chip te reparerenmedia bij 37 ° C. Lyse (ga verder met stap 4) op specifieke tijdstippen.
OPMERKING: Repair kan worden uitgevoerd on-chip met een bodemloze 96-well plaat bevestigd, of de chip kan in afzonderlijke stukken knippen na verwijdering van de bodemloze 96-well plaat.
4 Lysis
- Om alkaline comet assay uit te voeren:
- Voeg werken alkalische lysis buffer toevoegen van 1% Triton X-100 lysis voorraadoplossing (2,5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris, pH 10) alkalisch. Bereid ongeveer 25 ml lysis buffer werken voor elke chip.
- Pre-chill werken alkalische lysis buffer bij 4 ° C.
- Dompelen chip in koele werken alkalische lysis buffer en laat lysis tot O / N presteren in 4 ° C koelkast.
- Naar neutraal comet assay uit te voeren:
- Voeg werken neutraal lysis buffer door het toevoegen van 1% Triton X-100 en 10% DMSO tot neutrale lysis voorraadoplossing (2,5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10mM Tris, 1% N -Lauroylsarcosine, pH 9.5). Bereid ongeveer 25 ml lysis buffer werken voor elke chip.
- Voorverwarmen werkende neutraal lysis buffer bij 43 ° C.
- Dompel chip in warme werkende neutrale lysis buffer en laat lysis O / N uitvoeren 43 ° C incubator.
5 Elektroforese
- Om alkaline comet assay uit te voeren:
- Verwijder lysis buffer en snel spoel chip met 1x PBS.
- Beveiligde chip in een elektroforese kamer met gelfilm zijde naar beneden met behulp van dubbelzijdige tape.
- Breng de kamer tot een 4 ° C koude kamer.
- Vul de kamer met koud alkalische elektroforese buffer (0,3 M NaOH, 1 mM Na2 EDTA) tot een niveau dat net voldoende de gel.
- Zorgen voor alkalische afwikkelen voor 40 min.
- Run elektroforese op 1 V / cm en 300 mA gedurende 30 minuten in de koude kamer. Pas het volume van elektroforese buffer in de chaember gewenste bedrijfsstroom bereiken.
- Naar neutraal comet assay uit te voeren:
- Verwijder lysis buffer en spoel chip met neutrale elektroforese buffer (2 mM Na2EDTA, 90 mM Tris, 90 mM boorzuur, pH 8,5) gedurende 2 x 15 min bij 4 ° C.
- Beveiligde chip in een elektroforese kamer met gelfilm zijde naar beneden met behulp van dubbelzijdige tape.
- Breng de kamer tot een 4 ° C koude kamer.
- Vul de kamer met koud neutrale elektroforese buffer (2 mM Na2EDTA, 90 mM Tris, 90 mM boorzuur, pH 8,5) tot een niveau dat net voldoende de gel.
- Laat de gel te zitten in koude kamer gedurende 60 minuten.
- Run elektroforese 0.6 V / cm en 6 mA gedurende 60 minuten in de koude kamer. Pas het volume van elektroforese buffer in de kamer om de gewenste stroomsterkte bereiken.
6 Fluorescent Imaging
- Verwijder chip van elektroforese kamer van cold kamer.
- Neutraliseer de gels neutralisatie buffer (0,4 M Tris, pH 7,5) gedurende 2 x 15 min bij 4 ° C koelkast.
- Vlekken op de chip met fluorescerende DNA beits naar keuze (dat wil zeggen, SYBR Gold, ethidiumbromide) onder de fabriek aanbevolen procedures. Beeld met behulp van fluorescentie microscopie.
7 Data Analysis
Analyseer komeet Afbeeldingen door standaard komeettest software zoals Komet 5.5.
Representative Results
In dit eerste voorbeeld beschrijven we de aanpak voor het kwantificeren beginsituatie van DNA schade in humane lymfoblastoïde cellen na blootstelling aan oxidatieve schade met H 2 O 2. Om H 2 O 2 geïnduceerde basis letsels en enkele breuken te evalueren, worden alkaline comet voorwaarden gebruikt. Nadat het laden is voltooid en cellen zijn ingekapseld met agarose overlay wordt een bodemloze 96-well plaat geperst op het oppervlak met 96 compartimenten op de chip te maken. Elk van de 96-wells gedoseerd worden met een ander type of concentratie van chemicaliën. Hier vier verschillende doses H 2 O 2 werden gebruikt en 1x PBS werd gebruikt als negatieve controle. Representatieve beelden van array kometen getoond in Figuur 1A, wanneer onbehandeld (boven), 50 uM (midden) en 100 uM (onderste) H 2 O 2 -exposed monsters toonden verschillende komeetstaarten. Analyse van de komeet beelden kunnen worden performed behulp van commercieel verkrijgbare software, die in het algemeen gekwantificeerd schade aan op basis van de totale fluorescentie intensiteit en migratie afstand van elke komeetstaartkanon. De metingen worden meestal uitgevoerd op 50 tot 100 kometen per staat en de mediane waarde (ofwel% staart DNA of staartlengte) wordt berekend. Figuur 1B toont het percentage staart DNA-respons curve van de TK6 lymfoblastcellijn kometen blootgesteld aan vier verschillende concentraties van H geanalyseerd 2 O 2. De samenhang tussen onafhankelijke experimenten toont de effectiviteit van deze benadering bij de beoordeling DNA schade respons van verschillende niveaus van chemische behandelingen in cellen.
Om te leren over variatie tussen de monsters (bijvoorbeeld onder macrowells) en tussen herhalingen van hetzelfde experiment werd inter-sample en inter-experimentele variabiliteit in figuur 2A en 2B respectievelijk uitgezet. In elk experiment elk putje van de 96-well chip is gelijk aan een ander monster en dus de variatie well-to-well onthult de inter-sample variatie van de inrichting. Hier TK6 cellen in 12 putjes van de 96-well chip geladen werden met dezelfde dosis H 2 O 2 en onmiddellijk gelyseerd na de behandeling. Alle andere experimentele stappen werden parallel uitgevoerd en de medianen van ten minste 50 kometen van elk macrowell zijn in figuur 2A uitgezet. Het gemiddelde van de medianen is 77.53% DNA in de staart, met een standaarddeviatie is 3,99%. Uit deze gegevens berekenen we de variatiecoëfficiënt tussen monsters 5,2%, die verscheidene malen hoger dan de traditionele test tonen de verbeterde robuustheid van deze assay 6,16. Voor informatie over de reproduceerbaarheid van de test, we blootgesteld TK6 cellen in een chip met 75 uM H 2 O 2 en de onmiddellijke niveau van DNA te beschadigen. Dit experiment werd zesmaal herhaald en gegevens van elk experiment werd in F uitgezetigure 2B. Onder dezelfde experimentele omstandigheden wij gevonden variërend van 41.76% 57.87% verkregen, getoond als grijze balken in de figuur. Het gemiddelde van zes herhalingen is 49.57%, met standaardfout van het gemiddelde van slechts 2,04%. De lage variatie onder repeats impliceert dat de comet assay uitgevoerd op dit nieuwe toestel is zeer reproduceerbaar.
Tot reparatie kinetiek evalueren, worden de cellen toegestaan om hun DNA te repareren in vers medium na de behandeling. Lyseren macrowells op verschillende tijdstippen toont de verandering in DNA-schade in de tijd. Een voorbeeld is getoond in figuur 3. In dit experiment werden TK6 cellen eerst ingekapseld in de chip, behandeld met 50 uM H 2 O 2 en toegestaan te herstellen tot 60 min na blootstelling. Cellen werden gelyseerd op 0, 20, 45 en 60 minuten respectievelijk. Representatieve comet beelden op verschillende tijdstippen weergegeven in figuur 3A, en de verandering in DNA schade niveaus tijd wordt uitgezet in figuur3B. Hieruit bleek dat bijna alle van de schade is hersteld binnen 45 min na H 2 O 2 behandeling. Veel variabelen invloed hebben op de snelheid van herstel, zoals het type cellijn en chemische agentia worden gebruikt. Vandaar dat onderzoekers kunnen veranderingen aan het protocol (dat wil zeggen, de uitbreiding van reparatietijd) om extra behoeften in hun onderzoek tegemoet. Hier bieden we een ander voorbeeld van de reparatie experiment met behulp van deze chip, waarin TK6 cellen worden uitgedaagd met een andere genotoxische stof N-methyl-N '-Nitro- N -Nitrosoguanidine (MNNG) is een alkylerende stof waarvan bekend is dat base letsels waaronder 7-methylguanine induceren en 3-methyladenine. Deze letsels worden omgezet naar sites hetzij door spontane depurinatie of door enzymatische verwijdering door DNA glycosylases abasische. De verkregen basische plaats kan onder alkalische omstandigheden worden gesplitst en derhalve gedetecteerd op de chip. Eerste blootstelling veroorzaakt een aanzienlijke toename van de schade, blijkt uit de langestaarten, en na verloop van tijd deze staarten worden verminderd als de cellen te herstellen intact DNA tijdens de reparatie. Hoewel alkylering en oxidatieve schade zijn beide voornamelijk gerepareerd door de base excisie reparatie route, het aantal letsels gegenereerd en die betrokken zijn bij reparatie-eiwitten variëren. Deze variaties kunnen leiden tot verschillende tarieven van de conversie naar sites, evenals verschillende tarieven van de reparatie van de resulterende abasische locaties abasische. In figuur 4, herstelkinetiek van TK6 cellen blootgesteld aan 0,1, 1, en 3 ug / ml MNNG getoond. In dit experiment, we uitgebreid de experimenteertijd tot 2 uur na blootstelling omdat MNNG-geïnduceerde schade langer blijkt te bestaan en verwijdering trager in vergelijking met H 2 O 2 geïnduceerde schade.
Analyse van de DSB's met neutrale condities is zeer vergelijkbaar met het protocol voor de analyse van enkelstrengs laesies met behulp van de alkalische omstandigheden. Om aanvankelijke schade niveaus tonen, werden TK6 cellen blootgesteld aan variabele niveaus van Gir, en de resulterende cellen werden gelyseerd en geëlektroforeerd bij een neutrale pH (Figuur 5A). Het is opmerkelijk dat de morfologie van de komeetstaarten verschilt van de alkalische testomstandigheden. Om waarneembare gefragmenteerd DNA behalen met deze assay, de IR gebruikte dosis significant hoger (0-100 Gy) dan de dosis vereist om schade zien met de alkalische omstandigheden. Bovendien vonden we dat de staartlengte is de meest gevoelige parameter die de mate van DNA-beschadiging bij gebruik van de neutrale comet assay 7. De geanalyseerde dosis-responscurve wordt getoond in figuur 5B. Reparatie van de dubbele DNA breuken in cellen kunnen ook worden beoordeeld, en is aangetoond door Weingeist et. al. 7. Samen genomen, de neutrale CometChip biedt een waardevol instrument voor hoge doorvoer analyse van DNA-DSB's.
1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 1. H 2 O 2 dosisrespons van TK6 cellen middels alkaline comet assay. (A) groepsaccommodatie microwell kometen van onbehandelde TK6 lymfoblasten (boven) en TK6 cellen blootgesteld aan 50 uM (midden) en 100 uM (onderste) H 2 O 2 gedurende 20 min bij 4 ° C. Schaalbalk is 100 urn. (B) H 2 O 2 dosisrespons van TK6 cellen blootgesteld aan verschillende niveaus van H 2 O 2. Elk gegevenspunt is het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten, waarbij het mediane percentage staart DNA ten minste 50 afzonderlijke kometen werd verkregen in elk experiment. Error bars geven de standaardafwijking van het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Inter-Steekproef en Inter-experimentele variabiliteit. (A) Sample-to-Sample variatie. TK6 humane lymfoblast cellen werden in 12 putjes van de 96-well chip geladen. Elk putje werd blootgesteld aan 100 pl 50 pM H 2 O 2 gedurende 20 min bij 4 ° C. Cell werden direct gelyseerd en onderzocht% Staart DNA. Gegevens van elk putje wordt hier getoond. Elke rechthoek is de mediaan van ten minste 50 afzonderlijke kometen uit elk putje. Het gemiddelde van 12 putjes is 77,53%, standaarddeviatie is 3,99% en de variatiecoëfficiënt wordt berekend 5,2% te zijn. (B) Experiment-to-Experiment variatie. TK6 humane lymfoblast cellen werden in 96-well chip geladen blootgesteld aan 100 ul 75 uM H 2 O 2 gedurende 20 min bij 4 ° C. Cell werden direct gelyseerd en onderzocht% Staart DNA.Hetzelfde experiment werd 6 keer herhaald en de gegevens van elke herhaling wordt weergegeven als een grijze balk. Elke rechthoek is de mediaan% staart DNA van ten minste 100 afzonderlijke kometen uit elke herhaling. Het gemiddelde van 6 herhalingen is 49.57%, getoond als de achterkant bar hier. De standaardafwijking van 6 herhalingen is 4,99%, en de standaardfout van het gemiddelde wordt berekend 2,04% te zijn, weergegeven als de fout bar in de figuur.
Figuur 3. Reparatie van H 2 O 2 geïnduceerde schade in TK6 lymfoblasten. (A) Schematische voorstelling van reparatie onderzoek met representatieve kometen. TK6 cellen worden behandeld met beschadigende agentia en liet repareren media bij 37 ° C vóór lyse. (B) Reparatie kinetiek van TK6 cellen na behandeling met 50 uM H 2 O 2 gedurende 20 minuten bij 4 & #176, C. Elk gegevenspunt is het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten, waarbij het mediane percentage staart DNA ten minste 50 afzonderlijke kometen werd verkregen in elk experiment. Error bars geven de standaardafwijking van het gemiddelde van een herhaling van experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Reparatie MNNG veroorzaakte schade TK6 lymfoblasten. TK6 cellen behandeld met 0,1, 1, en 3 ug / ml MNNG gedurende 30 min bij 4 ° C en men liet herstellen in media bij 37 ° C tot 120 min na blootstelling. De mediane percentage staart DNA ten minste 50 afzonderlijke kometen werd verkregen voor elk van drie onafhankelijke experimenten. Error bars geven de standaardfoutvan het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten.
Figuur 5. IR dosisrespons van TK6 cellen met neutrale comet assay. (A) groepsaccommodatie microwell kometen van onbehandelde TK6 lymfoblasten (boven) en TK6 cellen blootgesteld aan 40 Gy (midden) en 80 Gy (onderste) gammastraling. Schaalbalk is 100 urn. (B) IR dosisrespons van TK6 cellen blootgesteld aan verschillende niveaus van gamma bestraling. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt de mediaan staartlengte (micrometer) van ten minste 300 kometen gepoolde van zes macrowells op de chip. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Discussion
Ubiquitous genotoxinen in het milieu en ook op menselijke cellen uitoefenen onvermijdelijke stress en schade aan cellulaire DNA. In feite, het is geschat dat er 1.000 s van DNA-beschadigingen aanwezig in menselijke cellen bij steady state 18. Inzicht schade gevoeligheid en reparatie kinetiek bij de mens brengt niet alleen inzicht in fundamenteel onderzoek, maar profiteert ook de ontwikkeling van geneesmiddelen. Ironisch, ondanks het vermogen van DNA schade bevorderen kanker, DNA beschadigende agentia gebruikt worden bij zeer hoge niveaus aan kanker, waardoor kennis DNA schade en gepersonaliseerde geneeskunde relevant herstellen. De CometChip is een nieuwe onderzoek apparaat dat microfabrication praktijken gebruikt om een reeds lang bestond DNA-schade assay revolutie. Voortbouwend op dezelfde principes van de traditionele komeet assay, de chip zorgt voor significant hogere doorvoer en een betere reproduceerbaarheid. We beschrijven hier werkwijzen voor het gebruik van deze chip. Om het nut en de robuustheid te verduidelijken, laten we de resultaten weerm verscheidene experimenten waarbij de chip is gebruikt om schade geïnduceerd door verschillende DNA-beschadigende agentia te beoordelen, en indien het is gebruikt voor DNA herstel te evalueren. Samen hier gepresenteerde resultaten bieden u nuttige informatie over het gebruik van de chip en tonen haar brede toepasbaarheid op het onderzoek naar DNA-schade en herstel.
Een van de belangrijkste stappen in dit protocol is om effectieve cel laden volbrengen. Veel cellijnen werden getest op dit systeem, zowel suspensie en hechtende cellen. Laden met efficiëntie hangt af van vele variabelen zoals celtype, celgrootte, loading concentratie en tijd. Schorsing cellijnen zoals lymfoblastoïdcellen zijn het makkelijkst om mee te werken. Concentratie van de celsuspensie kan variëren van 10 april - 10 juni cellen per 96 putjes en laden voltooid gewoonlijk in 15-30 min. Hogere dichtheid cel vergemakkelijkt het laden en verkort de hoeveelheid tijd die nodig is voor de cellen om zich te vestigen in de microwells.
Geladen parameters voor hechtende cellen kunnen van suspensiecellen. Cellijnen zoals Chinese Hamster Ovarium (CHO) cellen bleken dezelfde beladingsrendement als suspensie cellen (na behandeling met trypsine) hebben gewonnen en aldus soortgelijke belastingsomstandigheden. Andere celtypen zoals tumorcellen die gemakkelijk cel aggregaten in suspensie, vereisen extra behandeling. Passen celsuspensies via een enkele cel filter en het toevoegen van trypsine om de schorsing media kan de vorming van cel clusters te onderdrukken tijdens het laden. Tenslotte, wat betreft laadtijd, de tijd nodig voor het vastleggen hechtende cellijnen in microputjes kan variëren van 20 minuten tot 1 uur. Als gevolg hiervan, is het aanbevolen dat gebruikers proefprojecten uit te voeren om optimale belading voorwaarden bepalen alvorens tot verder onderzoek. Loading werkzaamheid onder een helderveld microscoop worden gevisualiseerd of nauwkeuriger geopenbaard door het kleuren van de ingekapselde cellen met DAPI of andere DNAvlekken voorafgaand aan de evaluatie onder de fluorescentiemicroscoop.
Een groot voordeel van deze werkwijze en chip veelzijdigheid. Ten eerste zijn de onderzoekers niet beperkt tot een specifieke werkende cel concentratie omdat overtollige cellen worden weggespoeld, en de microarray zorgt voor een gelijkmatige komeet-dichtheid. Ten tweede kan de microputjes worden gemaakt met verschillende afmetingen aan celtypes van verschillende afmetingen op. Onder omstandigheden die meerdere cellen worden vastgelegd in een enkele microwell, multi-cell kometen zijn self-gekalibreerd en de opbrengst consistente resultaten in vergelijking met enkele cel kometen 6,7. Een ander voordeel van patroonvorming cellen in een microarray is dat alle kometen dan tevens focal plane met vaste posities, geluiddempende door ongericht kometen en geautomatiseerde beeldvorming en analyse te vergemakkelijken. De significante verbeteringen in de capaciteit en de gevoeligheid door de CometChip staat de toepassing van de test voor grootschalige studies. Tezamen verlenen de chipsa waardevol instrument voor DNA-schade-onderzoek voor onderzoekers, toxicologen, medici en epidemiologen.
Terwijl de comet assay is bekend om zijn uitstekende gevoeligheid in het detecteren van een groot aantal DNA schade, deze bepaling ook last van lage specificiteit. Met dit protocol verbetert de reproduceerbaarheid en de productie van de assay, maar niet aantonen vooruitgang in specificiteit. Niettemin multiplexen de test met andere methoden gerapporteerd efficiënt om hogere specificiteit zijn. Een voorbeeld is de opname van gezuiverde letselspecifieke enzymen. Deze enzymen kunnen anders niet op te sporen voet laesies omzetten in aantoonbare breuken en abasische locaties 1,19-21. Een veelgebruikt voorbeeld is de reparatie endonuclease formamidopyrimidine-DNA glycosylase (FPG), die oxidatieve DNA modificaties 19,22 onthult. Omdat het enzym digestie stap wordt aangebracht na cellysis, kan het systeem op dezelfde manier een behandeldsa traditionele agarose slide zonder aanpassingen aan het protocol. Hoewel de gedetailleerde protocol hier niet wordt beschreven, heeft deze aanpak is aangepast door vele traditionele comet assay gebruikers in het verleden en de protocollen kan gemakkelijk worden gevonden. In een eerdere publicatie we deze methode fluorescerende licht geïnduceerde schade 22 identificeren.
Het grote voordeel van deze werkwijze is de omzet biedt, die toegang geeft tot studies die voorheen vrijwel onmogelijk waren. De mogelijkheid om 96 monsters worden verwerkt op hetzelfde platform vermindert niet alleen arbeid en tijd, maar vermindert ook experimentele geluiden en verbetert reproduceerbaarheid. Inter sample variatie is aanzienlijk lager dan de traditionele dia naar dia variant, die 2 maal hoger dan de variabilteit deze chip 6,7 zijn. Geruisloos leidt ook tot verbeterde gevoeligheid, waardoor detectie van subtiele verschillen tussen monsters. Omdat het apparaat maakt gebruik van een standard 96-well formaat, het is compatibel met de algemene onderzoeksapparatuur en HTS-technologieën. Beschouw een studie die evaluatie van 100 monsters vereist, ervan uitgaande dat een gemiddelde onderzoeker kan verwerken ~ 30 glaasjes in de loop van enkele dagen. Aangezien elk monster moet in drievoud worden uitgevoerd, zou het ongeveer een maand naar dergelijke studie, die ook onvermijdelijk zou lijden van monster tot monster variatie voltooien. Daarentegen verwerking 100 omstandigheden, elk in drievoud deze chip vereist slechts enkele borden en kan in drie dagen uitgevoerd. Deze belangrijke verbetering van de overslag opent de deur naar studies die voorheen onbereikbaar waren.
De hier gepresenteerde protocol beschrijft zowel de basis-procedures voor het uitvoeren van de standaard comet assay en de gewijzigde stappen die nodig zijn om de CometChip platform te gebruiken. Met de mogelijkheid om zowel intrinsieke DNA schade niveaus en de daaropvolgende reparatie respons te bepalen, de assay is zeer relevant voorverschillende biologische en klinische toepassingen. Informatie over de gevolgen van specifieke chemische blootstellingen op het genoom faciliteert preventie van ziekte en behandeling. Verder is er ook significant belang dat er variaties in DNA schade gevoeligheid en herstelcapaciteit tussen individuen 23,24. Deze techniek levert de doorvoer die voor dergelijke grootschalige studies. Kennis over inter-individuele variaties is van cruciaal belang voor het identificeren van gevoelige mensen en voor het ontwerpen van geïndividualiseerde therapieën of ziektes te voorkomen strategieën. Samengevat, de hier gepresenteerde technologie een hoge doorvoer, objectieve kwantitatieve DNA schade analyse platform dat de potentie om een standaardmethode nabije toekomst is.
Acknowledgments
Dit werk werd in de eerste plaats steunen door 5-UO1-ES016045 met gedeeltelijke steun van 1-R21-ES019498 en R44-ES021116. DMW werd gesteund door de NIEHS Training Grant in Environmental Toxicology T32-ES007020. Apparatuur werd verstrekt door het Center for Environmental Health Sciences P30-ES002109.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraPure LMP Agarose (low melting point) | Invitrogen | 16520 | Multiple suppliers |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco by life technologies | 14190 | Multiple suppliers |
| Crystalline NaCl | Macron Chemicals | 7581-06 | Multiple suppliers |
| Crystalline Na2EDTA | Macron Chemicals | 4931-04 | Multiple suppliers, Irritant |
| Crystalline Tris (base) | Sigma-Aldrich | T1503 | Multiple suppliers, Irritant |
| Crystalline Tris (acid) | J.T.Baker | 4106 | Multiple suppliers |
| Crystalline N-lauroylsarcosine | Sigma-Aldrich | L9150 | Multiple suppliers, Highly toxic by inhalation, Irritant |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Multiple suppliers, Harmful by ingestion., Irritant |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | Multiple suppliers, Combustible Liquid, Target Organ Effect |
| Crystalline NaOH | Macron Chemicals | 7708-06 | Multiple suppliers, Corrosive |
| Hydrochloric acid | VWR | BDH3871 | Multiple suppliers, Corrosive |
| Crystalline boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Multiple suppliers, Target Organ Effect, Teratogen, Reproductive hazard |
| CometChip | Trevigen | Under development for distribution, contact Trevigen directly to obtain materials necessary | |
| 1-well dish | Thomas Scientific | 73521-420 | |
| Bottomless 96-well plate | VWR | 655000-06 | |
| 1.5' binder clips | Staples | Multiple suppliers | |
| Glass plate | Tag Hardware | Customized to size of 96-well plate | |
| Owl Horizontal Electrophoresis System | VWR | 27372-131 | Multiple suppliers |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | Multiple suppliers |
References
- Collins, A. R. The Comet Assay for DNA Damage and Repair Principles, Applications, and Limitations. Molecular biotechnology. 26 (3), (2004).
- Olive, P. L., Banáth, J. P. The comet assay a method to measure DNA damage in individual cells. Nature. 1 (1), 23-29 (2006).
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and biophysical research communications. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental cell research. 175 (1), 184-191 (1988).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Molecular biotechnology. 26 (3), 249-261 (2004).
- Wood, D. K., Weingeist, D. M., Bhatia, S. N., Engelward, B. P. Single cell trapping and DNA damage analysis using microwell arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10008-10013 (2010).
- Weingeist, D. M., et al. Single-cell microarray enables high-throughput evaluation of DNA double-strand breaks and DNA repair inhibitors. Cell cycle. 12 (6), 907-915 (2013).
- Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
- Witte, I., Plappert, U., de Wall, H., Hartmann, A. Genetic toxicity assessment: employing the best science for human safety evaluation part III: the comet assay as an alternative to in vitro clastogenicity tests for early drug candidate selection. Toxicological sciences : an official journal of the Society of Toxicology. 97 (1), 21-26 (2007).
- Valverde, M., Rojas, E. Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay. Mutation research. 681 (1), 93-109 (2009).
- Møller, P. Genotoxicity of environmental agents assessed by the alkaline comet assay. Basic & clinical pharmacology & toxicology. 96, Suppl 1.. 1-42 (2005).
- Dusinska, M., Collins, A. R. The comet assay in human biomonitoring: gene-environment interactions. Mutagenesis. 23 (3), 191-205 (2008).
- Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models. Cell biology and toxicology. 25 (1), 5-32 (2009).
- McKenna, D. J., McKeown, S. R., McKelvey-Martin, V. J. Potential use of the comet assay in the clinical management of cancer. Mutagenesis. 23 (3), 183-190 (2008).
- Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. -L. Oxidatively generated damage to the guanine moiety of DNA: mechanistic aspects and formation in cells. Accounts of chemical research. 41 (8), 1075-1083 (2008).
- Forchhammer, L., et al. Variation in the measurement of DNA damage by comet assay measured by the ECVAG† inter-laboratory validation trial. Mutagenesis. 25 (2), 113-123 (2010).
- Olive, P. L., Wlodek, D., Banáth, J. P. DNA double-strand breaks measured in individual cells subjected to gel electrophoresis. Cancer research. 51 (17), 4671-4676 (1991).
- Frelon, S., Douki, T., Ravanat, J. L., Pouget, J. P., Tornabene, C., Cadet, J. High-performance liquid chromatography--tandem mass spectrometry measurement of radiation-induced base damage to isolated and cellular DNA. Chemical research in toxicology. 13 (10), 1002-1010 (2000).
- Georgakilas, A. G., Holt, S. M., Hair, J. M., Loftin, C. W. Measurement of oxidatively-induced clustered DNA lesions using a novel adaptation of single cell gel electrophoresis (comet assay). Current protocols in cell biology. , Suppl Chapter 6, Unit 6.11.. (2010).
- Fortini, P., Raspaglio, G., Falchi, M., Dogliotti, E. Analysis of DNA alkylation damage and repair in mammalian cells by the comet assay. Mutagenesis. 11 (2), 169-175 (1996).
- Collins, A. R., Dusinská, M., Horská, A. Detection of alkylation damage in human lymphocyte DNA with the comet assay. Acta biochimica Polonica. 48 (3), 611-614 (2001).
- Ge, J., et al. Standard fluorescent imaging of live cells is highly genotoxic. Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83 (6), 552-560 (2013).
- Trzeciak, A. R., Barnes, J., Evans, M. K. A modified alkaline comet assay for measuring DNA repair capacity in human populations. Radiation research. 169 (1), 110-121 (2008).
- Marcon, F., Andreoli, C., Rossi, S., Verdina, A., Galati, R., Crebelli, R. Assessment of individual sensitivity to ionizing radiation and DNA repair efficiency in a healthy population. Mutation research. 541 (1-2), 1-8 (2003).
