Summary
Descriviamo qui una piattaforma che consente di rilevare test della cometa di danno al DNA con velocità senza precedenti. Il dispositivo modelli di cellule di mammifero in un microarray e consente l'elaborazione parallela di 96 campioni. L'approccio facilita l'analisi del danno al DNA livello di base, danno al DNA indotto da esposizione e di riparazione del DNA cinetica.
Introduction
L'elettroforesi su gel singola cellula (SCGE) assay (aka il test della cometa) è una tecnica ampiamente utilizzata per la quantificazione di un ampio spettro di lesioni del DNA, tra cui lesioni di base, siti abasic, rotture singolo filamento, rotture del doppio filamento, legami crociati e alcali sensibile siti. Il principio alla base del saggio è che il DNA danneggiato migra più facilmente di DNA intatto a causa della frammentazione e perdita di struttura superelicoidale. L'entità della migrazione è proporzionale alla quantità di danno al DNA, e può essere osservata con un microscopio a fluorescenza. Immagine-cattura e analisi del profilo di intensità individuale DNA a forma di cometa quindi fornire misure di parametri quali la lunghezza della coda, coda momento, e il% di DNA nella coda di rivelare il livello di danno del DNA all'interno di una cellula 1-4.
Attualmente ci sono due versioni comunemente usato per il test della cometa: a) test della cometa alcalina e b) Comet assay neutrale. Il test della cometa alcalina è il più ampiamenteversione usata, che utilizza un buffer pH elevato per rilassarsi prima di elettroforesi del DNA e, quindi, rileva tutti i tipi di rotture dei filamenti e dei siti sensibili agli alcali. Il saggio cometa neutro, invece, è meno praticata perché utilizza un tampone neutro per mantenere le doppie eliche e rilevare solo rotture del doppio filamento 2,5. Per gli agenti chimici e fisici che inducono DSB, SSB vengono creati in concerto, e si formano a livelli molto più elevati (ad esempio, SSB γIR-indotte sono un ordine di grandezza più comune di quanto DSB). Per la maggior parte del DNA esposizioni dannose, DSB sono molto meno frequenti rispetto ad altre classi di danno al DNA, e sono quindi più difficili da rilevare. Abbiamo dimostrato in precedenti pubblicazioni finestra di rilevazione di entrambe le versioni. 6,7
Anche se il test della cometa è stata solitamente usata per la ricerca di base sui danni e riparazione del DNA e test di genotossicità 1,2,8-15, il dosaggio è stato riferito di avere scarsa riproducibilità a causa di campione-to-campione, da persona a persona e la variabilità lab-a-lab. Inoltre, il dosaggio è basso erogato, in parte perché l'acquisizione delle immagini e l'analisi dei dati sono laborioso. Insieme, queste limitazioni contribuiscono alla sua relativamente bassa accettazione in studi su larga scala. Attraverso l'integrazione di tecnologie e principi di ingegneria, la CometChip porta una soluzione ai problemi di throughput e incoerenze che sono associati con il tradizionale test della cometa 6,7. Brevemente, per creare il chip, uno stampo viene microfabbricati usando fotolitografia per creare microposts di diametro piccolo come quello di una singola cella. Lo stampo viene poi utilizzato per timbrare su agarosio fuso, causando una serie di pozzetti dopo il gel si solidifica. Chips sono state sviluppate per fornire ai ricercatori pozzi di dimensioni variabili a compatibile con diversi tipi di cellule. Per caricare il chip, le cellule in media sono autorizzati a stabilirsi nei pozzetti per gravità; cellule in eccesso vengono lavati via. Cellule intrappolati vengono poi ci incapsulatizione un sottile strato di agarosio a basso punto di fusione, e un fondo 96 pozzetti viene poi bloccato alla superficie del gel per creare 96 macrowells, ciascuna con centinaia di micropozzetti sulla sua superficie inferiore.
Questo protocollo descrive le procedure generali per esperimenti con questo chip, che comprendono la preparazione del gel, carico delle cellule, il dosaggio e la riparazione, la lisi cellulare, elettroforesi, e l'imaging fluorescente. Dimostriamo due esempi di esperimenti dose-risposta con le cellule linfoblasti esposte DNA conosciuto agenti dannosi, utilizzando alcalini e neutri versioni del test, rispettivamente. Due esperimenti di riparazione sono indicate anche per descrivere come risposta di riparazione post-esposizione può essere valutata utilizzando il sistema.
Protocol
1 Preparazione di Chip
- Rimuovere il gel chip dalla confezione e posto in un lato di un singolo-ben piatto rettangolare, gel basso.
- Lavare il gel in 25 ml di PBS 1X per 15 min, ripetere due volte.
- Impostare gel sulla lastra di vetro ed orientamento etichetta di gel di conseguenza.
- Premere delicatamente un fondo piastra a 96 pozzetti rovesciata sul gel; assicurarsi che tutti i pozzetti della piastra pozzo senza fondo sono all'interno della zona del gel.
- Utilizzare 1,5 '' legante clip su ciascun lato della piastra di bloccaggio per fissare il vetro.
- Aspirare l'eccesso di tampone PBS in ogni pozzetto.
2. celle di carico
- Preparare sospensioni cellulari:
- Per linee cellulari di sospensione, diluire la sospensione cellulare in media per ottenere una concentrazione finale di 10 5 -10 6 cellule / ml.
- Per le linee di cellule aderenti, seguire le normali Detaching protocolli / tripsinizzazione e dilute cellule staccate in media per una concentrazione finale di 10 5 -10 6 cellule / ml. Se le cellule si aggregano, passare sospensione cellulare in un filtro cella per ottenere una sospensione di cellule singole.
- Aggiungere 100 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti.
- Coprire la piastra con la pellicola di gel per evitare l'evaporazione dei media.
- Consentono alle cellule di carico per almeno 30 min a 37 ° C incubatore.
- Rimuovere chip dalla incubatori e aspirare i media da ogni pozzetto.
- Rimuovere clip legante e senza fondo piastra a 96 pozzetti; tenere il chip con la lastra di vetro in un angolo e lavare delicatamente con 1x PBS per rimuovere le cellule in eccesso su agarosio.
- Controllare il carico delle cellule utilizzando un microscopio in campo chiaro con una lente obiettivo 4X. Se il caricamento insufficiente si osserva, ripetere dal punto 2.1.
- Posizionare Chip caricato su una superficie piana (banco di laboratorio). Chip Overlay con 1% a basso punto di fusione (LMP) agarosio che è pre-riscaldato a 37 ° C. Utilizzare circa 2̵1, 3 ml di agarosio LMP è necessario per ogni chip.
- Consenti sovrapposizione solidificare prima a temperatura ambiente per 3 minuti e poi passare a 4 ° C frigorifero per 5 minuti per la completa gelificazione.
3 Dosaggio e Riparazione
NOTA: Per studiare il DNA al basale livello di danno, passare alla Fase 4.
- Allineare con cura i pozzi del chip (creato da bloccaggio precedente) con i pozzetti di una nuova piastra a 96 pozzetti fondo. Re-pressa la piastra a 96 pozzetti fondo sulla chiusura superiore e sicuro con clip legante.
- Aggiungere 100 ml di chimica di dose desiderata in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti; eseguire dosaggio / terapia in ghiaccio o 4 ° C frigorifero per tempo desiderato.
- Dopo il dosaggio, prodotti chimici di aspirato di ogni bene e sciacquare via chimica residua utilizzando 1x PBS. Se il danno diretto è studiato qui, passare alla Fase 4.
- Per studiare la cinetica di riparazione, permettere cellule nel chip di riparare insupporti a 37 ° C. Lyse (passare al punto 4) in punti temporali specifici.
NOTA: riparazione può essere effettuata on-chip con una piastra a 96 pozzetti fondo collegato, o il chip può essere tagliato in pezzi separati dopo la rimozione della piastra a 96 pozzetti fondo.
4. Lysis
- Per eseguire alcalino test della cometa:
- Fate lavorare tampone di lisi alcalina con l'aggiunta di 1% Triton X-100 di soluzione alcalina lisi magazzino (2.5 M NaCl, 100 mM Na 2 EDTA, Tris 10 mM, pH 10). Preparare circa 25 ml di lavoro tampone di lisi per ogni chip.
- Pre-gelo di lavoro tampone di lisi alcalina a 4 ° C.
- Immergere chip fresco tampone di lisi alcalina di lavoro e consentire lisi di eseguire O / N a 4 ° C frigorifero.
- Per eseguire Comet assay neutrale:
- Fate lavorare tampone di lisi neutralità aggiungendo 1% Triton X-100 e il 10% DMSO alla soluzione di lisi magazzino neutro (2.5 M NaCl, 100 mM Na 2 EDTA, 10mM Tris, 1% N -Lauroylsarcosine, pH 9,5). Preparare circa 25 ml di lavoro tampone di lisi per ogni chip.
- Preriscaldare il tampone di lisi neutro a 43 ° C.
- Immergere chip caldo tampone di lisi neutro di lavoro e permettono di eseguire lisi O / N a 43 ° C incubatore.
5. elettroforesi
- Per eseguire alcalino test della cometa:
- Rimuovere tampone di lisi e rapidamente risciacquare chip con 1x PBS.
- Chip di sicuro in una camera di elettroforesi con gel lato pellicola rivolto verso il basso con nastro biadesivo.
- Portare la camera a 4 ° C in camera fredda.
- Riempire la camera con tampone alcalino freddo elettroforesi (0,3 M NaOH, 1 mM Na 2 EDTA) ad un livello che copre solo il gel.
- Lasciare per rilassarsi alcalina per 40 min.
- Eseguire elettroforesi a 1 V / cm e 300 mA per 30 minuti nella stanza fredda. Regolare il volume di tampone per elettroforesi in chamber per ottenere corrente in esecuzione desiderato.
- Per eseguire Comet assay neutrale:
- Rimuovere tampone di lisi e risciacquare chip con buffer per elettroforesi neutro (2 mM Na 2 EDTA, 90 mM Tris, 90 mM acido borico, pH 8,5) per 2 x 15 min a 4 ° C.
- Chip di sicuro in una camera di elettroforesi con gel lato pellicola rivolto verso il basso con nastro biadesivo.
- Portare la camera a 4 ° C in camera fredda.
- Riempire la camera con tampone di elettroforesi neutro freddo (2 mM Na 2 EDTA, 90 mM Tris, 90 mM di acido borico, pH 8,5) ad un livello che copre solo il gel.
- Lasciare che il gel di sedersi in camera fredda per 60 min.
- Eseguire elettroforesi a 0.6 V / cm e 6 mA per 60 minuti nella stanza fredda. Regolare il volume di tampone di elettroforesi nella camera di ottenere corrente di funzionamento desiderato.
6. Imaging fluorescente
- Rimuovere chip dalla camera di elettroforesi da colsala d.
- Neutralizzare il gel in tampone di neutralizzazione (0,4 M Tris, pH 7.5) per 2 x 15 min a 4 ° C frigorifero.
- Colorare il chip con il DNA macchia fluorescente di scelta (cioè, SYBR oro, il bromuro di etidio) sotto la fabbrica procedure raccomandato. Immagine usando la microscopia a fluorescenza.
Analisi dei dati 7.
Analizzare cometa Immagini da software test della cometa di serie come il Komet 5.5.
Representative Results
In questo primo esempio, si descrive il metodo per quantificare i livelli iniziali di danno al DNA nelle cellule linfoblastoidi umane dopo l'esposizione al danno ossidativo con H 2 O 2. Al fine di valutare H 2 O 2 -indotta lesioni di base e pause singolo filamento, vengono utilizzate condizioni cometa alcaline. Dopo il caricamento è completo e le cellule sono state incapsulato con la sovrapposizione di agarosio, una piastra a 96 pozzetti fondo viene premuto sulla superficie per creare 96 a scompartimento sul chip. Ciascuno dei 96-pozzetti può essere dosato con un tipo o concentrazione di sostanze chimiche diverse. Qui quattro diverse dosi di H 2 O 2 sono stati usati e 1x PBS è stato utilizzato come controllo negativo. Immagini rappresentative della comete schierati sono mostrati in figura 1A, dove non trattato (in alto), 50 mM (al centro) e 100 mM (in basso) H 2 O 2 -exposed campioni hanno dimostrato diversi livelli di code delle comete. Analisi di immagini della cometa può essere performed utilizzando un software disponibile in commercio, che quantifica generalmente livelli di danno basato sull'intensità di fluorescenza e la migrazione distanza totale di ciascuna coda di cometa. Le misurazioni sono comunemente eseguite su 50 a 100 comete ogni condizione e il valore mediano (sia% DNA coda o lunghezza della coda) è calcolato. Figura 1B mostra la curva di risposta del DNA percentuale coda analizzato dai TK6 comete linfoblastoidi esposte a quattro diverse concentrazioni di H 2 O 2. La coerenza tra esperimenti indipendenti dimostra l'efficacia di questo approccio nella valutazione DNA risposta al danno da vari livelli di trattamenti chimici nelle cellule.
Per conoscere le differenze tra i campioni (ad esempio, tra macrowells) e tra ripetizioni dello stesso esperimento, inter-campione e la variabilità inter-sperimentale è stato riportati nella Figura 2A e 2B, rispettivamente. All'interno di ogni esperimento, ogni pozzetto del 96-wChip ell è equivalente a un campione differente e quindi la variazione benestante ben rivela la variabilità inter-campione del dispositivo. Qui, le cellule TK6 caricati in 12 pozzetti del chip a 96 pozzetti sono stati trattati con la stessa dose di H 2 O 2 e lisate subito dopo il trattamento. Tutte le altre fasi sperimentali sono state eseguite in parallelo e le mediane di almeno 50 comete da ogni macrowell sono stati riportati nella Figura 2A. La media delle mediane è 77,53% DNA nella coda, con deviazione standard è 3,99%. Da questi dati, si calcola che il coefficiente di variazione tra campioni è 5,2%, che è diverse volte inferiore al test tradizionale, dimostrando il miglioramento della robustezza di questo test 6,16. Per conoscere la riproducibilità del test, abbiamo esposto le cellule TK6 in un chip con 75 mM H 2 O 2 e analizzare il livello immediato di danni al DNA. Questo esperimento è stato ripetuto sei volte e dati di ogni esperimento sono stati tracciati in FIGURA 2B. In condizioni sperimentali identiche, abbiamo ottenuto risultati che vanno dal 41.76% al 57.87%, indicata come barre grigie in figura. La media di sei ripetizioni è 49.57%, con l'errore standard della media di appena 2,04%. La bassa variazione tra ripetizioni implica che il test della cometa eseguita su questo nuovo dispositivo è altamente riproducibile.
Per valutare la cinetica di riparazione, le cellule sono autorizzati a riparare il loro DNA nei media fresco dopo il trattamento. Lisi macrowells in vari momenti rivela il cambiamento di danno al DNA nel corso del tempo. Un esempio è mostrato in Figura 3. In questo esperimento, le cellule TK6 stati incapsulati nel chip, trattate con 50 mM H 2 O 2, e permesso di riparare fino a 60 min post-esposizione. Le cellule sono state lisate a 0, 20, 45 e 60 minuti rispettivamente. Immagini cometa Rappresentante in diversi momenti sono mostrati in figura 3A, e la variazione dei livelli di danno al DNA nel tempo sono riportati nella Figura3B. Questi dati hanno rivelato che quasi tutto il danno viene riparato entro 45 min dopo H 2 O 2 terapia. Molte variabili possono influenzare il tasso di riparazione, compreso il tipo di linea cellulare e agente chimico utilizzato. Quindi i ricercatori possono apportare modifiche al protocollo (ad esempio, estendendo il tempo di riparazione) per soddisfare le esigenze supplementari nel loro indagini. Qui forniamo un altro esempio di esperimento di riparazione utilizzare questo chip, in cui le cellule TK6 sono sfidati con un diverso agente genotossico N -Methyl- N '-Nitro- N -Nitrosoguanidine (MNNG) è un agente alchilante noti per indurre lesioni di base, tra cui 7-metilguanina e 3-metiladenina. Queste lesioni vengono convertiti in abasic siti o di depurination spontanea o di rimozione enzimatica da glicosilasi DNA. Il sito abasic risultante può essere scisso in condizioni alcaline e quindi rilevato sul chip. Esposizione iniziale provoca un aumento significativo danno, evidente dal lungocode, e col tempo queste code sono ridotte come le cellule ripristino DNA intatto durante la riparazione. Sebbene alchilazione e danno ossidativo sono entrambi riparati principalmente dalla riparazione percorso escissione di base, la quantità di lesioni generate e le proteine coinvolte nella riparazione variano. Queste variazioni possono portare a diversi tassi di conversione abasic siti, così come diversi tassi di riparazione dei siti abasic risultanti. Nella Figura 4, riparazione cinetica di cellule TK6 esposte a 0,1, 1 e 3 mg / ml di MNNG sono mostrate. In questo esperimento, abbiamo esteso il tempo di esperimento per 2 ore post-esposizione in quanto il danno MNNG indotto sembra persistere più a lungo e viene eliminato a un ritmo più lento rispetto a H 2 O 2 indotta danni.
Analisi delle DSB utilizzando condizioni neutre è molto simile al protocollo per l'analisi delle lesioni single-strand utilizzando le condizioni alcaline. Per visualizzare i livelli di danno iniziale, le cellule TK6 sono stati esposti a livelli variabili di GIR, e le cellule risultanti sono state lisate ed elettroforesi a pH neutro (Figura 5A). È interessante notare che la morfologia delle code di cometa è differente dalle condizioni di saggio alcaline. Per raggiungere osservabile DNA frammentato da questo test, la dose IR utilizzato è significativamente più alta (0-100 Gy) rispetto alla dose necessaria per vedere i danni utilizzando le condizioni alcaline. Inoltre, abbiamo trovato che la lunghezza della coda è il parametro più sensibile nel riflettere l'entità del danno al DNA quando si utilizza il test della cometa neutro 7. La curva di risposta alla dose analizzato è illustrato nella Figura 5B. Riparazione del DNA rotture del doppio filamento nelle cellule può anche essere valutato, ed è stato dimostrato da Weingeist et. al. 7. Nel loro insieme, il CometChip neutro offre un valido strumento per l'analisi ad alto rendimento di DSB DNA.
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Figura 1. H 2 O 2 dosi risposta delle cellule TK6 utilizzando alcaline test della cometa. (A) le comete di pozzetti duplicati aggiornati da linfoblasti non trattati TK6 (in alto) e le cellule TK6 esposte a 50 micron (al centro) e 100 mM (in basso) H 2 O 2 per 20 minuti a 4 ° C. Barra della scala è di 100 micron. (B) H 2 O 2 dose-risposta delle cellule TK6 esposte a vari livelli di H 2 O 2. Ciascun punto di dati rappresenta la media di tre esperimenti indipendenti, in cui è stata ottenuta la mediana DNA percentuale coda di almeno 50 singoli comete in ogni esperimento. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media di tre esperimenti indipendenti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Inter-Sample e Inter-Sperimentale Variabilità. (A) variazione del campione a campione. Linfoblasti cellule umane TK6 stati caricati in 12 pozzetti del chip a 96 pozzetti. Ogni pozzetto è stato esposto a 100 pl di 50 mM H 2 O 2 per 20 minuti a 4 ° C. Cellulare sono stati immediatamente lisate e analizzati per% Tail DNA. I dati di ciascun pozzetto vengono qui mostrati. Ogni scatola rappresenta la mediana di almeno 50 comete individuali di ogni bene. La media di 12 pozzi è 77,53%, deviazione standard è 3,99%, e il coefficiente di variazione è calcolata per essere 5,2%. (B) Esperimento-to-Experiment variazione. Linfoblasti cellule umane TK6 stati caricati nel chip 96 pozzetti, esposto a 100 pl di 75 mM H 2 O 2 per 20 min a 4 ° C. Cellulare sono stati immediatamente lisate e analizzati per% Tail DNA.Lo stesso esperimento è stato ripetuto 6 volte e dati di ogni ripetizione viene visualizzato come una barra grigia. Ogni scatola rappresenta la mediana DNA% coda di almeno 100 comete individuali da ogni ripetizione. La media di 6 ripetizioni è 49.57%, indicato come la barra di nuovo qui. La deviazione standard di 6 ripetizioni è 4,99%, e l'errore standard della media è calcolata per essere 2,04%, rappresentato come la barra di errore in figura.
Riparazione di H 2 O 2 indotta da danni Figura 3. Nei linfoblasti TK6. (A) Schema di studio di riparazione con comete rappresentativi. Cellule TK6 sono trattati con agenti dannosi e permesso di riparare in media al 37 ° C prima di lisi. (B) Riparazione cinetica di cellule TK6 dopo il trattamento con 50 mM H 2 O 2 per 20 min a 4 e #176, C. Ciascun punto di dati rappresenta la media di tre esperimenti indipendenti, in cui è stata ottenuta la mediana DNA percentuale coda di almeno 50 singoli comete in ogni esperimento. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media da esperimenti ripetuti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Riparazione di danni MNNG indotta in linfoblasti TK6. TK6 cellule sono trattate con 0,1, 1 e 3 mg / MNNG ml per 30 minuti a 4 ° C e lasciata a riparare in mezzi a 37 ° C fino a 120 min postale esposizione. La mediana DNA percentuale coda di almeno 50 singoli comete stata ottenuta per ciascuno dei tre esperimenti indipendenti. Le barre di errore rappresentano l'errore standarddella media di tre esperimenti indipendenti.
Figura 5. Dose-risposta IR delle cellule TK6 utilizzando comet assay neutrale. (A) disposte micropozzetti comete da linfoblasti non trattati TK6 (in alto) e le cellule TK6 esposte a 40 Gy (al centro) e 80 Gy (in basso) raggi gamma. Barra della scala è di 100 micron. Dose-risposta (B) IR delle cellule TK6 esposte a vari livelli di raggi gamma. Ogni punto di dati rappresenta la lunghezza della coda mediana (micron) di almeno 300 comete raccolti da sei macrowells sul chip. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Genotossine ubiquitario nell'ambiente e anche all'interno delle cellule umane esercitano inevitabile stress e danni al DNA cellulare. In realtà, è stato stimato che ci sono 1.000 s di lesioni presenti nelle cellule umane allo stato stazionario 18 DNA. Capire danni suscettibilità e cinetica di riparazione negli esseri umani non solo porta intuizione di ricerca di base, ma beneficia anche lo sviluppo di farmaci. Ironia della sorte, nonostante la possibilità di danni al DNA per promuovere il cancro, DNA agenti dannosi sono utilizzati a livelli molto alti per curare il cancro, facendo conoscenza di danni al DNA e riparare pertinenti alla medicina personalizzata. Il CometChip è un dispositivo di ricerca romanzo che utilizza pratiche di microfabbricazione di rivoluzionare un lungo-esisteva test danno al DNA. Sulla base degli stessi principi del tradizionale test della cometa, il chip fornisce un throughput significativamente più alto e migliore riproducibilità. Descriviamo qui i metodi per l'utilizzo di questo chip. Per chiarire la sua utilità e la robustezza, mostriamo risultati from diversi esperimenti in cui il chip è stato utilizzato per valutare il danno indotto da diversi agenti che danneggiano il DNA differente, e dove è stato utilizzato per valutare la riparazione del DNA. Insieme, i risultati qui presentati forniscono informazioni utili per utilizzare il chip e dimostrano la sua ampia applicabilità per la ricerca sul danno e riparazione del DNA.
Uno dei passi più importanti di questo protocollo è quello di realizzare efficaci carico delle cellule. Molte linee cellulari sono stati testati su tale sistema, che comprende sia la sospensione e cellule aderenti. Caricamento efficienza dipende da molte variabili quali il tipo di cellule, le dimensioni delle cellule, la concentrazione di carico e di tempo. Linee cellulari di sospensione come le cellule linfoblastoidi sono le più facili da lavorare. Concentrazione di sospensione cellulare può variare dal 10 aprile - 10 giugno cellule per 96 pozzetti e caricamento di solito completa in 15-30 min. Maggiore densità cellulare facilita il carico e riduce la quantità di tempo necessario per le cellule per risolvere nei pozzetti.
Parametri di carico per cellule aderenti possono differire da cellule in sospensione. Le linee cellulari quali ovarica di criceto cinese (CHO) cellule, sono stati trovati ad avere simile efficienza di carico come cellule in sospensione (dopo tripsinizzazione) e utilizzare condizioni di carico analoghe così. Altri tipi di cellule, come le cellule tumorali che formano facilmente aggregati di cellule in sospensione, richiedono ulteriori manipolazioni. Passando sospensioni cellulari attraverso un filtro a singola cella e l'aggiunta di tripsina ai media sospensione può sopprimere la formazione di gruppi di cellule durante il caricamento. Infine, in termini di tempo di caricamento, il tempo richiesto per l'acquisizione linee cellulari aderenti nei pozzetti può variare da 20 minuti a 1 ora. Di conseguenza, si raccomanda che gli utenti eseguono esperimenti pilota per determinare le condizioni di carico ottimali, prima di procedere ad ulteriori indagini. Caricamento efficacia può essere visualizzato al microscopio in campo chiaro o più precisamente rivelato da colorazione delle cellule incapsulate con DAPI o di altro DNAmacchie prima della valutazione al microscopio a fluorescenza.
Uno dei principali vantaggi di questo metodo e chip è la versatilità. In primo luogo, i ricercatori non sono limitati ad una concentrazione cellulare di lavoro specifico perché le cellule in eccesso vengono lavate via, e il microarray assicura uniforme cometa densità. In secondo luogo, i pozzetti possono essere realizzati con dimensioni variabili per accomodare tipi cellulari di diverse dimensioni. In circostanze che più celle vengono catturati in una singola micropozzetti, comete multi-cellulari sono risultati di auto-calibrato e resa coerente rispetto alle comete monocellulari 6,7. Un altro vantaggio di patterning cellule in un microarray è che tutte le comete sono quindi allo stesso piano focale con posizioni fisse, ridurre il rumore a causa di comete sfocate e facilitare l'imaging e di analisi automatizzata. I miglioramenti significativi nella velocità e sensibilità fornite dal CometChip consentono l'applicazione del test per studi su larga scala. Nel loro insieme, il chip forniscesa strumento prezioso per la valutazione dei danni del DNA per ricercatori, tossicologi, medici ed epidemiologi.
Mentre il test della cometa è nota per la sua eccellente sensibilità nel rilevare una vasta gamma di danni al DNA, questo saggio soffre anche di bassa specificità. Usando questo protocollo migliora notevolmente la riproducibilità e la velocità del test, ma non dimostra l'avanzamento in specificità. Tuttavia, il multiplexing il test con altre metodologie è stato segnalato per essere efficace nel raggiungere una maggiore specificità. Un esempio è l'inclusione di enzimi specifici per lesione purificati. Questi enzimi possono convertire le lesioni di base altrimenti non rilevabili in rotture dei filamenti rilevabili e siti abasic 1,19-21. Un esempio ampiamente utilizzato è la riparazione endonucleasi glicosilasi formamidopyrimidine-DNA (FPG), che rivela le modifiche del DNA ossidativo 19,22. Poiché la fase di digestione enzimatica viene applicato dopo lisi cellulare, il sistema può essere trattato allo stesso modo unsa tradizionale slitta di agarosio, senza modifiche al protocollo. Anche se il protocollo dettagliato non è descritto qui, questo approccio è stato adattato da molti utenti tradizionali Comet test in passato e protocolli possono essere trovati facilmente. In una pubblicazione precedente, abbiamo usato questo metodo per identificare luce fluorescente indotto danni 22.
Il principale vantaggio di questo metodo è la velocità che fornisce, che apre le porte a studi che prima erano praticamente impossibile. La capacità di elaborare 96 campioni sulla stessa piattaforma non solo riduce il lavoro e il tempo, ma riduce anche i rumori sperimentali e migliora notevolmente la riproducibilità. Variazione Inter campione è significativamente inferiore rispetto al tradizionale variazione slide-to-scivolo, che può essere di 2 volte superiore alla variazione osservata con questo chip 6,7. Rumorosità ridotta porta anche a una maggiore sensibilità, consentendo la rilevazione di differenze più sottili tra i campioni. Poiché il dispositivo utilizza una standard formato a 96 pozzetti, che sia compatibile con le apparecchiature generale ricerca e HTS tecnologie. Si consideri uno studio che richiede la valutazione di 100 campioni, partendo dal presupposto che un ricercatore medio può elaborare ~ 30 vetrini nel corso di diversi giorni. Dato che ogni campione deve essere eseguita in triplice copia, ci sarebbe voluto circa un mese per completare un tale studio, che sarebbe anche inevitabilmente soffrono da campione a campione variazione. Al contrario, l'elaborazione di 100 condizioni, ciascuna in triplice copia, con questo chip richiede solo pochi piatti e possono essere eseguiti in tre giorni. Questo importante miglioramento del throughput apre la porta a studi che prima erano irraggiungibili.
Il protocollo presentato qui descrive entrambe le procedure di base per eseguire il test della cometa di serie e le misure modificate necessari per utilizzare la piattaforma CometChip. Con la capacità di misurare entrambi i livelli di danno al DNA inerenti e la successiva risposta di riparazione, il saggio è molto importante peruna varietà di applicazioni biologiche e cliniche. Le informazioni sull'impatto delle specifiche esposizioni chimiche sul genoma facilita la prevenzione e la cura delle malattie. Inoltre, vi è anche un interesse significativo nel determinare variazioni nel DNA danni sensibilità e capacità di riparazione tra gli individui 23,24. Questa tecnica fornisce il throughput richiesto per tali studi su larga scala. La conoscenza inter-variazioni individuali è fondamentale per identificare le persone sensibili e per la progettazione di terapie individualizzate o strategie prevenzioni. Nel loro insieme, la tecnologia qui presentato fornisce un elevato throughput, piattaforma di analisi del danno al DNA oggettiva e quantitativa che ha il potenziale per diventare una metodologia standard nel prossimo futuro.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato essenzialmente il sostegno da 5-UO1-ES016045 con il parziale supporto da 1-R21-R44-ES019498 e ES021116. DMW è stato sostenuto dal NIEHS Training Grant Tossicologia ambientale T32-ES007020. Attrezzatura è stato fornito dal Centro per le Scienze Salute ambientale P30-ES002109.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraPure LMP Agarose (low melting point) | Invitrogen | 16520 | Multiple suppliers |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco by life technologies | 14190 | Multiple suppliers |
| Crystalline NaCl | Macron Chemicals | 7581-06 | Multiple suppliers |
| Crystalline Na2EDTA | Macron Chemicals | 4931-04 | Multiple suppliers, Irritant |
| Crystalline Tris (base) | Sigma-Aldrich | T1503 | Multiple suppliers, Irritant |
| Crystalline Tris (acid) | J.T.Baker | 4106 | Multiple suppliers |
| Crystalline N-lauroylsarcosine | Sigma-Aldrich | L9150 | Multiple suppliers, Highly toxic by inhalation, Irritant |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Multiple suppliers, Harmful by ingestion., Irritant |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | Multiple suppliers, Combustible Liquid, Target Organ Effect |
| Crystalline NaOH | Macron Chemicals | 7708-06 | Multiple suppliers, Corrosive |
| Hydrochloric acid | VWR | BDH3871 | Multiple suppliers, Corrosive |
| Crystalline boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Multiple suppliers, Target Organ Effect, Teratogen, Reproductive hazard |
| CometChip | Trevigen | Under development for distribution, contact Trevigen directly to obtain materials necessary | |
| 1-well dish | Thomas Scientific | 73521-420 | |
| Bottomless 96-well plate | VWR | 655000-06 | |
| 1.5' binder clips | Staples | Multiple suppliers | |
| Glass plate | Tag Hardware | Customized to size of 96-well plate | |
| Owl Horizontal Electrophoresis System | VWR | 27372-131 | Multiple suppliers |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | Multiple suppliers |
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