Summary
Vi beskriver her en plattform som gjør kometmetoden påvisning av DNA-skader med enestående gjennomstrømming. Enheten mønstre pattedyrceller i en microarray og muliggjør parallell prosessering av 96 prøver. Tilnærmingen til rette for analyse av grunnleggende nivå for DNA-skade, eksponering-indusert DNA skade og DNA-reparasjonskinetikk.
Introduction
Den eneste celle gel elektroforese (SCGE) assay (aka kometen analyse) er en mye brukt teknikk for kvantifisering av et bredt spekter av DNA-lesjoner, inkludert basis lesjoner, abasic nettsteder, enkelttrådbrudd, dobbel tråd pauser, cross og alkali sensitive sider. Det underliggende prinsipp for analysen er at skadet DNA migrerer lettere enn uskadet DNA på grunn av oppsplitting og tap av superhelical struktur. Graden av migrering er proporsjonal med mengden av DNA-skade, og kan visualiseres ved hjelp av fluorescens-mikroskopi. Bilde-fangst og intensitet profilanalyse av individuelle komet formede DNA deretter levere parametermålinger som hale lengde, hale øyeblikk, og% DNA i halen for å avdekke nivået av DNA-skader i en celle 1-4.
Foreløpig er det to vanlige versjoner av kometmetoden: a) alkalisk komet analyse og b) nøytral kometmetoden. Den alkaliske kometmetoden er den mestbrukt versjon, som bruker en høy pH buffer for å slappe av DNA før elektroforese og dermed oppdager alle typer trådbrudd og alkali-sensitive områder. Den nøytrale komet assay, på den annen side, er mindre øvet fordi den bruker en nøytral buffer for å opprettholde de doble helikser og detektere bare dobbeltstrengbrudd 2,5. For kjemiske og fysiske stoffer som induserer DSB sin, er SSBs opprettet i konserten, og er dannet på mye høyere nivåer (f.eks γIR-indusert SSBs er en størrelsesorden mer vanlig enn DSB sin). For de fleste DNA skadelige eksponeringer, DSB sin er mye sjeldnere enn andre klasser av DNA-skader, og er dermed vanskeligere å oppdage. Vi har vist i tidligere publikasjoner deteksjonsvindu begge versjonene. 6,7
Selv om kometen analysen har blitt rutinemessig brukes for grunnleggende forskning på DNA skade og reparasjon og gentoksisitet testing 1,2,8-15, har analysen blitt rapportert å ha dårlig reproduserbarhet grunn av utvalg-til-prøven, person-til-person-og lab-til-lab variabilitet. I tillegg er analysen lav gjennomstrømning, delvis fordi bildeopptak og dataanalyse er arbeidskrevende. Sammen utgjør disse begrensningene bidrar til dens relativt lave aksept i store studier. Gjennom integrering av engineering teknologier og prinsipper, bringer CometChip en løsning på problemene med gjennomstrømming og selvmotsigelser som er forbundet med den tradisjonelle kometmetoden 6,7. Kort, for å skape den chip, blir en støpeform ved hjelp av fotolitografi microfabricated å skape microposts med en diameter så liten som for en enkelt celle. Støpeformen blir så brukt til å stemple den smeltede agarose, noe som resulterer i en matrise av mikrobrønnene etter at gelen stivner. Chips blir utviklet for å gi forskere med variabel størrelse brønner til kompatible med ulike celletyper. Slik legger du brikken, blir cellene i media lov til å bosette seg i brønnene av tyngdekraften; skytende celler blir vasket bort. Fanget cellene blir deretter innkapslet ossing et tynt lag av lavt smeltepunkt agarose, og en bunn 96 brønns plate blir deretter festet til gelen overflaten for å skape 96 macrowells, hver med hundrevis av mikrobrønner på dens bunnflate.
Denne protokollen beskriver de generelle prosedyrene for eksperimenter med denne brikken, som inkluderer gel forberedelse, celle lasting, dosering og reparasjon, cellelyse, elektroforese, og fluorescerende imaging. Vi viser to eksempler på doseresponsforsøk med lymphoblast celler eksponert kjent DNA-skadende midler, ved hjelp av alkaliske og nøytrale versjoner av analysen hhv. To reparasjonsforsøk er også vist å beskrive hvordan reparasjon respons etter eksponering kan evalueres ved hjelp av systemet.
Protocol
1. Utarbeidelse av Chip
- Fjern chip gel fra pakken og plasseres i en ett-vel rektangulær plate, gel filmsiden ned.
- Vask gel i 25 ml 1 x PBS i 15 minutter, gjentas to ganger.
- Sett gel på glassplate og etiketten orienteringen av gel tilsvarende.
- Trykker en omvendt bunnløse 96-brønns plate på gel forsiktig; sørge for at alle brønner av den bunnbrønnplate er innenfor området av gelen.
- Bruk 1,5 '' bindemiddel klemmene på hver side av platen for å sikre fastspenning med glasset.
- Aspirer av overflødig PBS buffer i hver brønn.
2. Legge Cells
- Forbered cellesuspensjoner:
- For opphengcellelinjer, fortynnes cellesuspensjon i mediet for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 10 5 -10 6 celler / ml.
- For tilhenger cellelinjer, følger normale demontere / trypsinering protokoller og dilute frittliggende celler i mediet til en sluttkonsentrasjon på 10 5 -10 6 celler / ml. Hvis cellene samlet, passere cellesuspensjon i en celle-filter for å oppnå en enkel cellesuspensjon.
- Tilsett 100 ul cellesuspensjon til hver brønn av 96-brønns plate.
- Dekkplate med gelen film for å hindre fordampning av mediet.
- Tillat celler for å laste inn i minst 30 minutter i 37 ° C inkubator.
- Fjern chip fra inkubator og aspirer media fra hver brønn.
- Fjern bindemiddel klipp og bunnløse 96-brønns plate; hold brikke med glassplaten i en vinkel og forsiktig skylling med 1x PBS for å fjerne overskytende celler på agarose.
- Sjekk celle lasting ved hjelp av en lys feltet mikroskop med en 4X objektiv. Hvis utilstrekkelig lasting er observert, gjenta fra trinn 2.1.
- Plasser lastet chip på en jevn overflate (lab benk). Overleggs brikke med 1% lavt smeltepunkt (LMP) agarose som er forvarmet ved 37 ° C. Bruk omtrent 2̵1, 3 ml av LMP-agarose er nødvendig for hver enkelt chip.
- Tillat overlegg å stivne først ved RT i 3 min, og deretter bevege seg til 4 ° C kjøleskap i 5 min for fullstendig gelering.
3. Dosering og reparasjon
MERK: For å studere baseline DNA-skader nivå, gå til trinn 4.
- Forsiktig justere brønnene i brikken (laget fra foregående klem) med brønnene i en ny bunn 96-brønns plate. Re-press den bunnløse 96-brønns plate på toppen og sikker fastspenning med bindemiddel klipp.
- Tilsett 100 ul av kjemisk av ønskede dose til hver brønn av 96-brønners plate; utføre dosering / behandling på is eller i 4 ° C kjøleskap til ønsket tidsperiode.
- Etter dosering, aspirer kjemikalier fra hver brønn og skylle bort rester av kjemiske bruker 1x PBS. Hvis direkte skade er studert her, gå videre til trinn fire.
- Å studere reparasjon kinetikk, tillate celler i brikken til å reparere imedier ved 37 ° C. Lyse (fortsett til trinn 4) på bestemte tidspunkter.
MERK: Reparer kan utføres på brikken med en bunn 96-brønns plate festet, eller brikken kan kuttes opp i separate stykker etter fjerning av bunn 96-brønns plate.
4. Lysis
- Å utføre alkalisk komet analysen:
- Lag arbeider alkalisk lysis buffer ved å tilsette 1% Triton X-100 til alkalisk lysis stamoppløsning (2,5 M NaCl, 100 mM Na 2 EDTA, 10 mM Tris, pH 10). Forbered ca 25 ml av arbeids lysis buffer for hver brikke.
- Pre-kulden arbeider alkalisk lyseringsbuffer ved 4 ° C.
- Senk chip i kjølig arbeider alkalisk lysis buffer og la lyse å utføre O / N i 4 ° C kjøleskap.
- Å utføre nøytral komet analysen:
- Lag arbeider nøytral lysis buffer ved å tilsette 1% Triton X-100 og 10% DMSO til nøytral lysis stamoppløsning (2,5 M NaCl, 100 mM Na EDTA 2, 10mM Tris, 1% N -Lauroylsarcosine, pH 9,5). Forbered ca 25 ml arbeids lysis buffer for hver brikke.
- Pre-varme arbeids nøytral lysis-buffer ved 43 ° C.
- Senk chip i varmt arbeider nøytral lysis buffer og la lyse å utføre O / N i 43 ° C inkubator.
5. elektroforese
- Å utføre alkalisk komet analysen:
- Fjern lysis buffer og raskt skylle chip med 1x PBS.
- Sikker chip i en elektroforese kammer med gel film siden ned ved hjelp av dobbeltsidig tape.
- Bring i kammeret til et 4 ° C kaldt rom.
- Fyll kammer med kald alkalisk elektroforese buffer (0,3 M NaOH, 1 mM Na EDTA 2) til et nivå som akkurat dekker gel.
- Tillat for alkalisk avkobling for 40 min.
- Kjør elektroforese på 1 V / cm og 300 mA i 30 min i kjølerommet. Juster volumet av elektroforese buffer i chamber å oppnå ønsket kjøre strøm.
- Å utføre nøytral komet analysen:
- Fjern lysis buffer og skyll chip med nøytral elektroforese buffer (2 mM Na 2 EDTA, 90 mM Tris, 90 mM borsyre, pH 8,5) i 2 x 15 min ved 4 ° C.
- Sikker chip i en elektroforese kammer med gel film siden ned ved hjelp av dobbeltsidig tape.
- Bring i kammeret til et 4 ° C kaldt rom.
- Fyll kammer med kald nøytral elektroforese buffer (2 mM Na 2 EDTA, 90 mM Tris, 90 mM borsyre, pH 8,5) til et nivå som akkurat dekker gel.
- La gelen til å sitte i kaldt rom i 60 min.
- Kjør elektroforese på 0,6 V / cm og 6 mA i 60 minutter i det kalde rom. Juster volumet av elektroforese buffer i kammeret for å oppnå ønsket strøm.
6. Fluorescent Imaging
- Fjern chip fra elektroforese kammeret fra cold rom.
- Nøytraliser gelene i nøytralisering buffer (0,4 M Tris, pH 7,5) i 2 x 15 minutter i 4 ° C kjøleskap.
- Flekker på brikken med fluorescerende DNA stain av valg (dvs. SYBR Gold, Ethidiumbromid) under fabrikkens anbefalte prosedyrer. Bilde med fluorescerende mikroskopi.
7. Data Analysis
Analyser komet Bilder etter standard kometmetoden programvare som Komet 5.5.
Representative Results
I dette første eksempel, beskriver vi tilnærming for å kvantifisere initielle nivåer av DNA-skade i humane lymfoblastoide celler etter eksponering for oksidativ skade ved hjelp av H 2 O 2. For å kunne vurdere H 2 O 2 -indusert basis lesjoner og enkelttrådbrudd, er alkaliske komet forhold brukt. Etter at lastingen er fullført, og cellene er blitt innkapslet med agarose legget, er en bunn 96-brønns plate presses mot overflaten for å skape 96-avdelinger på brikken. Hver av de 96-brønner kan doseres med en annen type eller konsentrasjon av kjemikalier. Her fire forskjellige doser av H 2 O 2 ble benyttet, og 1 x PBS, ble anvendt som negativ kontroll. Representative bilder av oppstilte kometer er vist i figur 1A, der ikke-behandlet (øverst), 50 mikrometer (i midten) og 100 mikrometer (nederst) H 2 O 2 -exposed prøvene viste ulike nivåer av komethaler. Analyse av komet bilder kan PERFORMed hjelp av kommersielt tilgjengelig programvare, som generelt kvantifiserer skadenivåer basert på den totale fluorescens intensitet og migrering avstand på hver komet halen. Målinger er vanligvis utføres på 50 til 100 kometer per tilstand og medianverdien (enten% hale DNA eller hale lengde) beregnes. Figur 1B illustrerer den prosent halen DNA responskurve analysert fra TK6 lymfoblastoide celle kometer utsatt for fire ulike konsentrasjoner av H 2 O 2. Konsistensen blant uavhengige eksperimenter demonstrerer effekten av denne tilnærmingen i vurderingen DNA skade respons fra ulike nivåer av kjemiske behandlinger i cellene.
For å lære om variasjon blant prøvene (for eksempel blant macrowells) og blant ganger i det samme eksperimentet, ble inter-sample og inter eksperimentell variabilitet plottet i figur 2A og 2B respektivt. Innen hvert forsøk, hver brønn av 96-well chip tilsvarer et annet utvalg og dermed godt å vel variasjon avslører inter-sample variasjon av enheten. Her ble TK6 celler som er lagt i 12 brønner av 96-brønns chip behandlet med den samme dose av H 2 O 2 og umiddelbart lysert etter behandling. Alle andre forsøksfremgangsmåten ble utført i parallell, og medianer av minst 50 komet fra hver macrowell ble plottet i Figur 2A. Gjennomsnittet av median er 77.53% DNA i halen, med standardavvik er 3,99%. Fra disse data, beregner vi at variasjonskoeffisienten mellom prøvene er 5,2%, noe som er flere ganger lavere enn den tradisjonelle assay, demonstrerer den forbedrede robusthet av denne analysen 6,16. Å lære om reproduserbarhet av analysen, vi utsatt TK6 celler i en brikke med 75 mikrometer H 2 O 2 og analysere den umiddelbare nivå av DNA-skade. Dette eksperimentet ble gjentatt seks ganger og data fra hvert eksperiment ble plottet i Figur 2B. Under identiske eksperimentelle forhold, fikk vi resultater som strekker seg fra 41.76% til 57.87%, vist som grå søyler i figuren. Den gjennomsnitt av seks gjentagelser er 49.57%, med standard feil av gjennomsnittet av bare 2,04%. Den lave variasjon blant gjentar innebærer at kometen analysen utført på denne romanen enheten er svært reproduserbare.
For å evaluere reparasjonskinetikk, er cellene tillatt å reparere sitt DNA i friske medier etter behandling. Lysing macrowells ved forskjellige tidspunkter viser endring i DNA-skade over tid. Et eksempel er vist i figur 3.. I dette eksperimentet, ble cellene først TK6 innkapslet i brikken, behandlet med 50 uM H 2 O 2, og tillates å reparere opp til 60 min post-eksponering. Celler ble lysert ved 0, 20, 45 og 60 min henholdsvis. Representative komet bilder ved forskjellige tidspunkter er vist i figur 3A, og endring i DNA-skadenivåer over tid blir plottet i figur3B. Disse dataene viste at nesten alle av skaden er reparert innen 45 min innlegg H 2 O 2 behandling. Mange variabler kan påvirke hastigheten for reparasjon, inkludert typen av cellelinje og kjemiske middel som anvendes. Derfor forskere kan gjøre endringer i protokollen (dvs. utvide reparasjonstiden) for å imøtekomme ytterligere behov i sine undersøkelser. Her gir vi et annet eksempel på reparasjon eksperiment ved hjelp av denne brikken, hvor TK6 celler blir utfordret med en annen gentoksisk stoff N-metyl-N '-Nitro- N -Nitrosoguanidine (MNNG) er en alkyleringsmidlet kjent for å indusere basis lesjoner inkludert 7-metylguanin og 3-methyladenine. Disse lesjonene er konvertert til abasic områder enten ved spontan depurinering eller ved enzymatisk fjerning av DNA glycosylases. Den resulterende abasisk området kan spaltes under alkaliske betingelser, og således detektert på brikken. Initial eksponering fører til en betydelig økning i skade, tydelig fra den langehaler, og over tid disse haler er redusert som cellene gjenopprette intakt DNA under reparasjon. Selv alkylering og oksydativ skade er begge i hovedsak reparert av basen excision reparasjon svei, mengden av lesjonene som genereres, og proteinene som er involvert i reparasjons variere. Disse variasjonene kan føre til ulike satser for konvertering til abasic områder, samt ulike satser for reparasjon av de resulterende abasic nettsteder. I figur 4, reparasjon kinetikken for TK6 celler eksponert til 0,1, 1 og 3 ug / ml MNNG er vist. I dette eksperimentet, vi utvidet forsøket tid til 2 timer etter eksponering fordi MNNG-indusert skade ser ut til å vedvare lengre og tømmes i et saktere tempo i forhold til H 2 O 2 -indusert skade.
Analyse ved hjelp av DSB sin nøytrale betingelser er svært lik til protokollen for analysen av single-strand lesjoner ved hjelp av de alkaliske betingelser. Skal vise de første skadenivåene ble TK6 celler utsatt for variable nivåer av Gir, og de resulterende cellene ble lysert og elektroforesebehandlet på en nøytral pH (figur 5A). Det er bemerkelsesverdig at morfologi av komethaler er forskjellig fra de alkaliske analysebetingelser. For å oppnå observerbar fragmentert DNA ved bruk av denne analyse, IR-dose som benyttes er vesentlig høyere (0-100 Gy) enn den dose som kreves for å vise skade ved hjelp av de alkaliske betingelser. I tillegg har vi funnet at halelengden er den mest følsomme parameter som gjenspeiler i omfanget av DNA-skade ved bruk av den nøytrale komet assay 7. Den analyserte doseresponskurve er illustrert i figur 5B. Reparasjon av DNA-dobbelttrådbrudd i celler kan også vurderes, og har blitt vist av Weingeist et. al. 7. Til sammen nøytral CometChip tilbyr et verdifullt verktøy for høy gjennomstrømning analyse av DNA DSB sin.
1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1. H 2 O 2 dose respons TK6 celler ved hjelp av alkalisk kometmetoden. (A) kledd mikro kometer fra ubehandlede TK6 lymphoblasts (øverst) og TK6 celler eksponert for 50 mikrometer (i midten) og 100 mikrometer (nederst) H 2 O 2 i 20 min ved 4 ° C. Scale bar er 100 mikrometer. (B) H 2 O 2 dose respons TK6 celler eksponert for ulike nivåer av H 2 O 2. Hvert datapunkt er gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter, hvor medianprosent hale-DNA på minst 50 individuelle komet ble oppnådd i hvert forsøk. Feilfelt representerer standard feil av gjennomsnittet fra tre uavhengige eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Inter-Utvalg og Inter-Experimental variabilitet. (A) Sample-to-Sample variasjon. TK6 menneskelige lymfoblasten celler ble lastet inn i 12 brønner på 96-brønnen chip. Hver brønn ble eksponert for 100 pl av 50 pM H 2 O 2 i 20 min ved 4 ° C. Cell ble umiddelbart lysert og analysert for% Tail DNA. Data fra hver brønn er vist her. Hver boks representerer median minst 50 individuelle komet fra hver brønn. Gjennomsnittet av 12 brønner er 77,53%, standardavviket er 3,99%, og variasjonskoeffisienten beregnes til å være 5,2%. (B) Experiment-til-Experiment variasjon. TK6 humane lymfoblast-celler ble lastet inn i 96-brønn-brikke, utsettes for 100 pl av 75 pM H 2 O 2 i 20 min ved 4 ° C. Cell ble umiddelbart lysert og analysert for% Tail DNA.Det samme eksperiment ble gjentatt 6 ganger, og data for hver gjentakelse er vist som et grått felt. Hver boks representerer median% halen DNA på minst 100 individuelle kometer fra hver rapport. Gjennomsnittet av seks repetisjoner er 49.57%, vist som ryggen bar her. Standardavviket til 6 repetisjoner er 4,99%, og standard feil av gjennomsnittet er beregnet til å være 2,04%, representert som feillinjen i figuren.
Figur 3. Reparasjon av H 2 O 2 -indusert skader i TK6 lymphoblasts. (A) Skjematisk av reparasjon studie med representative kometer. TK6-celler er behandlet med skadelige stoffer og tillatt å reparere i mediet ved 37 ° C før lysis. (B) Reparasjon kinetikk TK6 celler etter behandling med 50 mikrometer H 2 O 2 for 20 min på 4 & #176, C. Hvert datapunkt er gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter, hvor medianprosent hale-DNA på minst 50 individuelle komet ble oppnådd i hvert forsøk. Feilfelt representerer standard feil av gjennomsnittet fra gjentatte eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Reparer av MNNG-indusert skade på TK6 lymfoblaster. TK6 celler blir behandlet med 0,1, 1, og 3 ug / ml MNNG i 30 min ved 4 ° C og tillatt å reparere i mediet ved 37 ° C opp til 120 min stolpen eksponering. Median prosent hale-DNA på minst 50 individuelle komet ble oppnådd for hvert av tre uavhengige eksperimenter. Feilfelt representerer standard feilfor middelverdien fra tre uavhengige eksperimenter.
Figur 5. IR dose respons TK6 celler ved hjelp av nøytrale kometmetoden. (A) med alt inkludert mikro kometer fra ubehandlede TK6 lymphoblasts (øverst) og TK6 celler eksponert for 40 Gy (i midten) og 80 Gy (nederst) gammastråling. Scale bar er 100 mikrometer. (B) IR doserespons av TK6 celler eksponert for ulike nivåer av gamma-bestråling. Hvert datapunkt representerer medianen hale lengde (mikrometer) på minst 300 kometer samlet fra seks macrowells på brikken. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Allestedsnærværende genotoxins i miljøet og også innenfor menneskeceller utøve uunngåelig stress og skade på mobilnettet DNA. Faktisk har det blitt anslått at det er 1000 s av DNA-lesjoner er til stede i humane celler ved steady state 18. Forstå skade mottakelighet og reparasjon kinetikk hos mennesker ikke bare bringer innsikt til grunnleggende forskning, men også fordeler narkotika utvikling. Ironisk nok, til tross for muligheten for skade på DNA for å fremme kreft, blir DNA-ødeleggende midler som brukes ved svært høye nivåer for å behandle kreft, noe kunnskap om DNA-skade og reparasjon relevant for personlig medisin. Den CometChip er en roman forskning enhet som utnytter microfabrication praksis for å revolusjonere en lang eksisterte DNA skade analysen. Bygge på de samme prinsippene for den tradisjonelle kometmetoden, gir chip betydelig høyere gjennomstrømning og bedre reproduserbarhet. Vi beskriver her metoder for bruk av denne brikken. For å klargjøre sin nytteverdi og robusthet, vi vise resultater from flere eksperimenter hvor brikken har blitt brukt for å vurdere skader forårsaket av flere ulike DNA skadelige stoffer, og der det har blitt brukt til å evaluere DNA-reparasjon. Sammen resultatene presentert her gi nyttig informasjon for bruk av chip og demonstrere sin brede anvendelighet til forskning på DNA skade og reparasjon.
En av de viktigste trinnene i denne protokollen er å oppnå effektiv celle lasting. Mange cellelinjer har blitt testet på dette systemet, inkludert både fjæring og heftende celler. Last effektivitet er avhengig av mange variabler slik som celletype, cellestørrelse, lastkonsentrasjon og tid. Suspensjon cellelinjer så som lymfoblastoide celler er lettest å arbeide med. Konsentrering av cellesuspensjonen kan variere fra 10 april-10 juni celler per 96-brønn og lasting fullfører vanligvis i 15-30 min. Høyere celletetthet forenkler lasting og forkorter tiden det tar for cellene å bosette seg i mikro.
Henter parametere for heftende celler kan avvike fra opphengs celler. Cellelinjer som kinesisk hamster Ovarian (CHO) celler, ble funnet å ha lignende lasteeffektivitet som oppheng celler (etter trypsinization) og dermed bruke lignende belastningsforhold. Andre celletyper, så som svulstceller som lett danner celleaggregater i suspensjon, krever ytterligere håndtering. Passerer cellesuspensjoner gjennom en enkelt celle filter og tilsetning trypsin til suspensjonen media kan undertrykke dannelsen av celleklynger under lasting. Til slutt, når det gjelder lasting tid, den tid som kreves for å fange adherente cellelinjer i mikrobrønnene kan variere fra 20 min til 1 time. Som et resultat, anbefales det at brukerne utføre pilotforsøk for å bestemme optimale belastningsforhold før du går videre til ytterligere undersøkelser. Lasting effekt kan visualiseres under et sterkt mikroskop felt eller mer nøyaktig avdekket ved å farge de innkapslede celler med DAPI eller annen DNAflekker før evaluering under fluorescerende mikroskop.
En stor fordel med denne metoden, og chip er allsidighet. Først blir forskere ikke begrenset til en bestemt arbeidscellekonsentrasjonen, fordi overskytende celler blir vasket bort, og microarray sikrer ensartet komet-tetthet. For det andre kan de mikrobrønner gjøres med variable størrelser for å romme celletyper med forskjellige størrelser. Under forhold som flere celler er fanget i en enkelt mikro, multi-celle kometer er selv kalibrert og avkastnings konsistente resultater i forhold til encellete kometer 6,7. En annen fordel med patterning celler i en microarray er at alle kometer er da på samme fokusplan med faste stillinger, redusere støy som skyldes ufokusert kometer og tilrettelegging automatisert bildebehandling og analyse. De betydelige forbedringer i gjennomstrømningen og følsomhet gitt av CometChip muliggjøre anvendelsen av analysen for stor-skala-studier. Til sammen brikken giSA verdifullt verktøy for DNA skadevurdering for forskere, toksikologer, klinikere og epidemiologer.
Mens kometen analysen er kjent for sitt gode følsomhet i å oppdage et bredt spekter av DNA-skade, denne analysen også lider av lav spesifisitet. Ved hjelp av denne protokollen forbedrer reproduserbarhet og gjennomstrømming av analysen, men viser ikke avansement i spesifisitet. Likevel, multiplekses for analysen med andre metoder er blitt rapportert å være effektive for å oppnå større spesifisitet. Et eksempel er inkluderingen av renset lesjon-spesifikke enzymer. Disse enzymene kan konvertere ellers ikke målbare basis lesjoner i påvisbare trådbrudd og abasic nettsider 1,19-21. Et mye brukt eksempel er reparasjon endonuclease Formamidopyrimidin-DNA glykosylase (Fpg), som avslører oksidative DNA modifikasjoner 19,22. Fordi enzymet fordøyelsen trinn påføres etter cellelyse, kan systemet bli behandlet på samme måte som enSA tradisjonelle agarose lysbilde uten endringer i protokollen. Selv om den detaljerte protokollen ikke er beskrevet her, har denne tilnærmingen blitt bearbeidet av mange tradisjonelle kometmetoden brukere i det siste og protokollene kan lett finnes. I en tidligere publikasjon, brukte vi denne metoden til å identifisere fluorescerende lys-indusert skade 22.
Den store fordelen med denne metoden er gjennomstrømningen det gir, som åpner dørene til studier som tidligere var nesten umulig. Evnen til å behandle 96 prøver på samme plattform reduserer ikke bare arbeidskraft og tid, men også reduserer eksperimentelle lyder og forbedrer reproduserbarhet. Inter prøvevariasjon er vesentlig lavere enn de tradisjonelle slide-til-bilde variant, som kan være 2 ganger høyere enn variasjonen observert med denne brikken 6,7. Redusert støy fører også til forbedret følsomhet, slik at deteksjon av flere små forskjeller mellom prøvene. Fordi enheten bruker en standard 96-brønners format, er den kompatibel med generell forskningsutstyr og HTS teknologier. Vurdere en studie som krever evaluering av 100 prøver, forutsatt at en gjennomsnittlig forsker kan behandle ~ 30 glassplater i løpet av flere dager. Gitt at hver prøve må utføres i tre eksemplarer, ville det ta omtrent en måned å fullføre en slik studie, som også ville uunngåelig lider prøve til prøve variasjon. I motsetning til dette prosess 100 forhold, hver i triplikat, med denne brikken krever bare noen få plater, og kan bli utført i tre dager. Denne stor forbedring i gjennomstrømningen åpner døren til studier som tidligere var uoppnåelig.
Protokollen presenteres her beskriver både de grunnleggende prosedyrer for utførelse av standard kometmetoden og de modifiserte trinn kreves for å bruke CometChip plattformen. Med evnen til å måle både iboende DNA skadenivåer og den etterfølgende reparasjonsrespons, er svært relevant for analysenen rekke biologiske og kliniske anvendelser. Informasjon om virkningen av spesifikke kjemiske eksponeringer på genomet letter sykdomsforebygging og behandling. Videre er det også betydelig interesse for å bestemme variasjoner i DNA-skade følsomhet og reparasjon kapasitet hos individer 23,24. Denne teknikken gir en gjennomstrømning som kreves for slike store studier. Kunnskap om interindividuelle variasjoner er kritisk for å identifisere mottakelige personer og for å utforme individuelle behandlinger eller preventions strategier. Tatt sammen, teknologien som presenteres her gir en høy gjennomstrømning, objektiv og kvantitativ DNA skade analyse plattform som har potensial til å bli en standard metodikk i nær fremtid.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble først og fremst støtte med 5-UO1-ES016045 med delvis støtte fra ett-R21-ES019498 og R44-ES021116. DMW ble støttet av NIEHS Training Grant i miljøtoksikologi T32-ES007020. Utstyr ble gitt av Center for Environmental Health Sciences P30-ES002109.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraPure LMP Agarose (low melting point) | Invitrogen | 16520 | Multiple suppliers |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco by life technologies | 14190 | Multiple suppliers |
| Crystalline NaCl | Macron Chemicals | 7581-06 | Multiple suppliers |
| Crystalline Na2EDTA | Macron Chemicals | 4931-04 | Multiple suppliers, Irritant |
| Crystalline Tris (base) | Sigma-Aldrich | T1503 | Multiple suppliers, Irritant |
| Crystalline Tris (acid) | J.T.Baker | 4106 | Multiple suppliers |
| Crystalline N-lauroylsarcosine | Sigma-Aldrich | L9150 | Multiple suppliers, Highly toxic by inhalation, Irritant |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Multiple suppliers, Harmful by ingestion., Irritant |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | Multiple suppliers, Combustible Liquid, Target Organ Effect |
| Crystalline NaOH | Macron Chemicals | 7708-06 | Multiple suppliers, Corrosive |
| Hydrochloric acid | VWR | BDH3871 | Multiple suppliers, Corrosive |
| Crystalline boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Multiple suppliers, Target Organ Effect, Teratogen, Reproductive hazard |
| CometChip | Trevigen | Under development for distribution, contact Trevigen directly to obtain materials necessary | |
| 1-well dish | Thomas Scientific | 73521-420 | |
| Bottomless 96-well plate | VWR | 655000-06 | |
| 1.5' binder clips | Staples | Multiple suppliers | |
| Glass plate | Tag Hardware | Customized to size of 96-well plate | |
| Owl Horizontal Electrophoresis System | VWR | 27372-131 | Multiple suppliers |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | Multiple suppliers |
References
- Collins, A. R. The Comet Assay for DNA Damage and Repair Principles, Applications, and Limitations. Molecular biotechnology. 26 (3), (2004).
- Olive, P. L., Banáth, J. P. The comet assay a method to measure DNA damage in individual cells. Nature. 1 (1), 23-29 (2006).
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and biophysical research communications. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental cell research. 175 (1), 184-191 (1988).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Molecular biotechnology. 26 (3), 249-261 (2004).
- Wood, D. K., Weingeist, D. M., Bhatia, S. N., Engelward, B. P. Single cell trapping and DNA damage analysis using microwell arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10008-10013 (2010).
- Weingeist, D. M., et al. Single-cell microarray enables high-throughput evaluation of DNA double-strand breaks and DNA repair inhibitors. Cell cycle. 12 (6), 907-915 (2013).
- Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
- Witte, I., Plappert, U., de Wall, H., Hartmann, A. Genetic toxicity assessment: employing the best science for human safety evaluation part III: the comet assay as an alternative to in vitro clastogenicity tests for early drug candidate selection. Toxicological sciences : an official journal of the Society of Toxicology. 97 (1), 21-26 (2007).
- Valverde, M., Rojas, E. Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay. Mutation research. 681 (1), 93-109 (2009).
- Møller, P. Genotoxicity of environmental agents assessed by the alkaline comet assay. Basic & clinical pharmacology & toxicology. 96, Suppl 1.. 1-42 (2005).
- Dusinska, M., Collins, A. R. The comet assay in human biomonitoring: gene-environment interactions. Mutagenesis. 23 (3), 191-205 (2008).
- Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models. Cell biology and toxicology. 25 (1), 5-32 (2009).
- McKenna, D. J., McKeown, S. R., McKelvey-Martin, V. J. Potential use of the comet assay in the clinical management of cancer. Mutagenesis. 23 (3), 183-190 (2008).
- Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. -L. Oxidatively generated damage to the guanine moiety of DNA: mechanistic aspects and formation in cells. Accounts of chemical research. 41 (8), 1075-1083 (2008).
- Forchhammer, L., et al. Variation in the measurement of DNA damage by comet assay measured by the ECVAG† inter-laboratory validation trial. Mutagenesis. 25 (2), 113-123 (2010).
- Olive, P. L., Wlodek, D., Banáth, J. P. DNA double-strand breaks measured in individual cells subjected to gel electrophoresis. Cancer research. 51 (17), 4671-4676 (1991).
- Frelon, S., Douki, T., Ravanat, J. L., Pouget, J. P., Tornabene, C., Cadet, J. High-performance liquid chromatography--tandem mass spectrometry measurement of radiation-induced base damage to isolated and cellular DNA. Chemical research in toxicology. 13 (10), 1002-1010 (2000).
- Georgakilas, A. G., Holt, S. M., Hair, J. M., Loftin, C. W. Measurement of oxidatively-induced clustered DNA lesions using a novel adaptation of single cell gel electrophoresis (comet assay). Current protocols in cell biology. , Suppl Chapter 6, Unit 6.11.. (2010).
- Fortini, P., Raspaglio, G., Falchi, M., Dogliotti, E. Analysis of DNA alkylation damage and repair in mammalian cells by the comet assay. Mutagenesis. 11 (2), 169-175 (1996).
- Collins, A. R., Dusinská, M., Horská, A. Detection of alkylation damage in human lymphocyte DNA with the comet assay. Acta biochimica Polonica. 48 (3), 611-614 (2001).
- Ge, J., et al. Standard fluorescent imaging of live cells is highly genotoxic. Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83 (6), 552-560 (2013).
- Trzeciak, A. R., Barnes, J., Evans, M. K. A modified alkaline comet assay for measuring DNA repair capacity in human populations. Radiation research. 169 (1), 110-121 (2008).
- Marcon, F., Andreoli, C., Rossi, S., Verdina, A., Galati, R., Crebelli, R. Assessment of individual sensitivity to ionizing radiation and DNA repair efficiency in a healthy population. Mutation research. 541 (1-2), 1-8 (2003).
