Summary
O método de tomate / GFP-FLP / FRT envolve visualizando células fotorreceptoras mosaico em viver Drosophila. Ele pode ser usado para seguir os destinos das células fotorreceptoras individuais na retina durante dias ou semanas. Este método é ideal para estudos de degeneração da retina e doenças neurodegenerativas ou o desenvolvimento de células fotorreceptoras.
Abstract
O olho de Drosophila é largamente utilizado como um modelo para estudos de desenvolvimento e degeneração neuronal. Com a poderosa técnica de recombinação mitótico, telas elegantes genéticos baseados na análise clonal levaram à identificação de vias de sinalização envolvidos no desenvolvimento do olho e dos fotorreceptores (PR), a diferenciação em estádios larvares. Nós descrevemos aqui o método de tomate / GFP-FLP / DRF, o qual pode ser utilizado para análise rápida clonal no olho vivo adulto de Drosophila. As células fotorreceptoras fluorescentes são visualizados com a técnica de neutralização de córnea, em retinas com clones de mosaico gerados por recombinação mediada por flipase. Este método possui várias vantagens importantes sobre o seccionamento histológico clássico da retina: ele pode ser usado para o rastreio de alto rendimento e provou ser um método eficaz para identificar os factores que regulam PR sobrevivência e função. Ele pode ser utilizado para análises de cinética de PR degeneração da mesma estar animAl ao longo de várias semanas, para demonstrar a necessidade de genes específicos para PR a sobrevivência ou função na mosca adulta. Este método também é útil para abordar questões de autonomia em células mutantes para o desenvolvimento, tais como aqueles em que o estabelecimento da polaridade celular planar é afectada.
Introduction
A retina de Drosophila é composto de cerca de 800 unidades ommatidial (Figura 1A), que são precisamente organizados, com um eixo claramente definida de polaridade (Figura 1B). Cada unidade contém 20 células: oito células fotorreceptoras (PRS) e 12 células acessórias, incluindo cones, células de pigmento e de cerdas células 1,2. Duas classes de PR são distinguidas com base no tipo de rodopsina (Rh) que expressam. Os seis PRs exteriores (R1-6) expressam Rh1 e estão dispostos num padrão trapezoidal (Figura 1C). No centro do trapézio, os dois PRs interiores (R7/R8) expressar quatro tipos possíveis de rodopsina (RH3, RH4, RH5 ou RH6) e estão organizados de tal modo que R7 se encontra no topo da R8 3.
Mais de 2.500 genes estão envolvidos na morfogênese do olho Drosophila 4, que provou ser um modelo muito poderosa para estudos de um grande painel de processos, incluindo o desen olhovolvimento, recrutamento PR, diferenciação, polaridade celular planar, morfogênese, a sobrevivência, a apoptose e transdução visuais 5-9.
Os investigadores que trabalham no olho Drosophila têm, ao longo de muitos anos, desenvolveu técnicas de imagem da retina e realização telas genéticos sistemáticos. A maneira mais fácil para a imagem da retina adulta é olhar para a córnea em um animal imobilizado (Figura 1A). A estrutura da córnea pode ser visualizado precisamente por microscopia electrónica de varrimento e foi usado em uma tela genética em larga escala pelo consórcio URCFG ( http://www.bruinfly.ucla.edu ) 10. Esta é uma abordagem muito eficaz para a visualização de mudanças globais morfológicas na estrutura da córnea, tais como rugosidade olho ou brilho, muitas vezes induzidos por mutações em genes que controlam os primeiros passos no desenvolvimento ou viabilidade celular. No entanto, a visualização global de córnea não é sufficient para identificar os fatores que regulam PR rhabdomere morfogênese ou adulto PR viabilidade e função. Tais análises exigem uma investigação aprofundada mais de integridade PR, com base em microscopia de contraste de fase de secções de resina semi-finas tangenciais da retina 11-13. Esta técnica é adequada para análise de mosaico, em que RP mutantes podem ser identificadas pela sua falta de 14,15 pigmento vermelho.
Clones mutantes Mosaico também pode ser visualizado em dissecções Todo-mount da pupa ou adulto retina, com base na sua falta de proteína verde fluorescente sinal (GFP) em microscopia de fluorescência 16,17. Estas duas técnicas são muito úteis, mas ambas são trabalhosas e demoradas e não são, portanto, adequados para o rastreio em larga escala. Nós e outros têm desenvolvido o uso de técnicas de córnea de neutralização para a imagiologia de RP produzindo proteínas fluorescentes 18,19, para facilitar a rápida análise de RP. Com esta técnica, mutanteOs clones podem ser identificados com base na autofluorescência do (w +) pigmento vermelho em adultos clones Drosophila mosaico. No entanto, este método não proporciona a resolução de uma única célula é necessária para tratar autonomia célula emite 19. Nós resolvemos esse problema através do desenvolvimento do método de Tomate / GFP-FLP / FRT, que combina a imagem de proteínas fluorescentes por neutralização córnea com recombinação mitótica 20. Este método permite que o alto rendimento, a identificação rápida e precisa de PRs mutantes em clones de mosaico, com resolução de uma única célula ( http://www.ens-lyon.fr/LBMC/ApoDrosoDatabase/ ). Ele é adequado para uso em análises cinéticas, para seguir PRs individuais ao longo de um período de semanas em viver Drosophila. Descrevemos aqui o método de tomate / GFP-FLP / FRT e dicas para a sua utilização em análises simples, cinéticos de olhos de mosaico.
Protocol
1. Cruzando com linhas de Tomate / GFP-FLP / FRT
A geração de moscas que levam o clone mutante requer um único cruzamento entre uma linhagem mutante de transporte de FRT eo correspondente Tomate / GFP-FLP / FRT voar linha.
Este trabalho utilizou a coleção BruinFly de mutações FRT-recombinados ( http://www.bruinfly.ucla.edu ). Quatro linhas de Tomate / GFP-FLP / DRF pode ser utilizado, realizando FRT Rh1-tdtomatoninaC em cada um dos braços do segundo e terceiro cromossomas combinados com fonte de flipase (ey-FLP) e expressão de GFP em todas as PRs exteriores (Rh1-Gal4 UAS -GFP) 20:
- 2L braço: linha # 43345, P {ry [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*]; P {w [+ MC] = ninaE-tdTomato-ninaC} P {2L ry [+ t7.2] = neoFRT} 40A; P {w [+ MC] = UAS-GFP-ninaC} 3
- 2R braço: linha # 43346, P {ry [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*]; P {ry [+ t7.2] = neoFRT} 42D P{W [+ MC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 2R; P {w [+ MC] = UAS-GFP-ninaC} 3
- 3L braço: linha # 43347, P {ry [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*]; P {w [+ MC] = UAS-GFP-ninaC} 2, P {w [+ MC] = ninaE-tdTomato-ninaC} P {3L ry [+ t7.2] = neoFRT} 80B/TM6B, Tb [1]
- 3R braço: linha # 43348, P {ry [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*]; P {w [+ MC] = UAS-GFP-ninaC} 2, P {ry [+ t7.2] = neoFRT} P {82B w [+ MC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 3R/TM6B, Tb [1]
Estas quatro linhas estão disponíveis no centro das ações da Bloomington Drosophila. Eles fornecida uma fonte de FLP no olho em desenvolvimento para a geração de clones mitóticos 21. O tipo selvagem cromossomo carrega uma seqüência FRT e RH1-tdTomato ninaC construir codificando a tdTomato proteína fluorescente vermelha, como um marcador para o tipo selvagem e PRs exteriores heterozigotos. Nesta construção, os últimos 41 aminoácidos da isoforma p174 do ninaC (nem inactivação ou activação C) do gene foi apsuspensa, em-quadro para o C-terminal da sequência tdTomato. A cauda C-terminal da isoforma p174 ninaC é responsável pela localização rhabdomeral da proteína de 22 e permite melhor visualização vivo de RP fluorescentes vermelhas, utilizando a técnica de neutralização de córnea. O promotor é o mínimo RH1 234 pb (-152 82) RH1 promotor. O marcador fluorescente verde GFP é expresso por todas as PRs exteriores, devido à presença do RH1-Gal4 (3kb promotor) e UAS-GFP ninaC construções. Os cruzamentos entre um estoque mosca transportando uma mutação no cromossoma x FRT (FRT-x) e as linhas de Tomate / GFP-FLP / DRF produz uma descendência com o genótipo seguinte (exemplo de mutação em 2L): RH1-Gal4, ey-FLP ; FRT40A, RH1-tdTomato ninaC / FRT40A-x; UAS-GFP ninaC. Nestes moscas, as células mutantes homozigóticos são gerados por recombinação mitótico no disco olho em desenvolvimento e se dividem para gerar um clone de fotorreceptores mutantes homozigotos (Figura 2A). HomossexualAs células mutantes zygous pode ser identificada porque expressam apenas a proteína fluorescente verde (GFP), enquanto que o de tipo selvagem e as células heterozigóticas circundante expressar tanto tdTomato e GFP (Figuras 2B e B ").
2. Preparando Drosophila para fotorreceptoras Visualization
Para PR visualização pela técnica córnea neutralização, imobilizar moscas em placas de agarose.
- Prepare um frasco de lavagem cheio de água destilada a 4 ° C e coloque-o no gelo.
- Dissolver agarose regular em água (1,2-1,5% de agarose em 100 ml de água), por aquecimento em um forno de microondas. Colocar o balão em um banho de água a 55 ° C e deixar a solução de agarose a arrefecer-se a esta temperatura. Manter a agarose a 55 ° C até à sua utilização.
- Anestesiar as moscas com CO 2, durante pelo menos 1 min.
- Verter a solução de agarose quente (a 55 ° C) em placas de Petri (35 x 10 mm, 1,37 x 0,39 cm) e colocar imediatamentediatamente a anestesiados Drosophila na agarose. Para os iniciantes, começando com 10 moscas por placa de Petri é razoável. Maior prato de Petri (60 x 15 mm, 2,362 x 0,59 cm) podem também ser utilizados.
- Sob um microscópio de dissecação, orientar a Drosophila de lado, com uma pinça, empurrar uma asa em agarose, de modo a que a asa e metade do corpo são incorporadas em agarose (Figuras 3A-3A ""). Furar a outra asa sobre a superfície da agarose. Nota: Se as moscas não são incorporados profundamente o suficiente na agarose, a mosca estará livre para mover sua cabeça durante o exame do PR, e isso vai resultar em imagens desfocadas. A orientação do olho também será perturbado. Pode ser difícil de mergulhar a Drosophila em que a agarose, devido quer a concentração de agarose ou a sua temperatura. É mais fácil de incorporar em moscas de agarose mais concentrada, mas se a agarose é muito concentrado, a mosca pode afundar. Se a agarose é muito legal, pode ser difficult para incorporar a mosca, mas uma temperatura muito elevada pode causar danos na córnea.
- Colocar a placa de Petri, em gelo e permitir que a agarose solidificar.
- Com uma pinça, orientar a cabeça de tal modo que um olho é exposto à objectiva de imersão (Figura 3A 'e 3A ""). Geralmente, um olho pode ser considerado para ser bem orientada sob o microscópio de dissecação quando o pseudopupil (visualizada como uma mancha preta) está no meio do olho. Uma orientação óptima do olho maximiza a largura do campo ommatidial em que RP estão focados. O objectivo da etapa de orientação é encontrar a região do olho, com o mais vasto campo de RP focados, geralmente no centro do olho. Este passo também é útil para a remoção de quaisquer pernas ou aristae que cobre o olho e impedindo a sua visualização.
- Cobrir a mosca com água gelada e deixar a placa de Petri, em gelo até à visualização. Água gelada mantém as moscas anestesiados.
3. VisualizandoFotorreceptores sob o microscópio
Para a visualização da RP através da córnea, este protocolo utiliza um microscópio vertical equipado com uma objectiva de água, com uma distância de trabalho (W N-Achroplan 40X/0.75).
- Colocar a placa de Petri cobertas com água gelada sobre uma lâmina de vidro sobre a fase de microscópio (Figuras 3 BC). A placa de Petri podem ser colados à placa de vidro, o que torna possível a movê-lo sem problemas com os parafusos micrométricos.
- Mergulhar a objectiva de imersão em água da placa de Petri (Figuras 3B'-3C '). Posicione a cabeça da mosca sob o feixe de excitação (começar com o filtro de GFP, por exemplo). Mova o palco cima e para baixo até que o feixe converge no olho. Quando o olho está no nível certo, tende a refletir a luz de excitação.
- Olhe pela ocular para fluorescência. Quando o olho está posicionado no centro do campo de visão, o foco abaixocórnea para visualizar os fotorreceptores fluorescentes.
Nota 1: Ao olhar através da ocular, pode ser desconfortável para distinguir as partes do corpo da mosca, principalmente a parte distal do abdômen e na cabeça, por exemplo. Nesses casos, você deve olhar diretamente para o palco para reposicionar a Drosophila.
Nota 2: Classical fluorescência ou microscopia confocal pode ser usado. A microscopia confocal oferece imagens com menos de fundo e um amplo campo de PRs focadas do que a microscopia clássica. Um exemplo de configuração é um LSM510 microscópio confocal (Zeiss) com um objetivo água 40X. Melhores resultados podem ser obtidos com a abertura do orifício do microscópio confocal mais largo do que é normalmente recomendado para o objectivo. Por exemplo, usar um valor de 204, em vez de o padrão 98 para a abertura do furo.
Nota 3: Níveis mais altos de w + pigmentação do olho reduzir a fluorescência de fundo. 4. Curso de tempo de visualização de células fotorreceptoras
O cuidado é necessário quando a seguir o destino de um PR individuais dentro do mesmo olho ao longo de um período de tempo.
- Reduzir a temperatura de agarose a 45 ° C, para maximizar a sobrevivência de Drosophila. A agarose solidifica muito rapidamente a esta temperatura. Apenas um Drosophila deve ser usado por uma placa de Petri, para assegurar que as moscas não são misturados durante observações.
- Sistematicamente posicionar as moscas do mesmo lado, para a visualização do mesmo olho. Isto pode ser conseguido tomando o mosca anestesiado do seu frasco por uma asa e colocando a Drosophila na agarose. Sempre orientar o olho da mesma maneira, se possível, tornando mais fácil para encontrar clones PR que foram vistos antes.
- Identificar os clones com base na sua forma sob o microscópio confocal. O campo de visão é geralmente localizado ao lado do clone de interesse. Em such casos, os olhos devem ser reorientados debaixo de água, para o centro do campo de visão do clone de interesse, com base na polaridade do olho (Figura 4).
5. Recuperando Moscas após Visualization
- Remover a água da placa de Petri.
- Puxe a Drosophila fora da agarose com uma pinça.
- Seca-se a Drosophila num tecido.
- Retorne a Drosophila para um frasco, garantindo que ele não fique preso no alimento. Permitiu a mosca para se volta a 25 ° C.
Representative Results
O método de tomate / GFP-FLP / DRF pode ser utilizado para estudar o efeito de uma mutação ou de expressão ectópica no desenvolvimento e sobrevivência de fotorreceptores na retina de Drosophila. Ele é rápido, tornando-o ideal para fins de rastreio, como demonstrado recentemente 20. A presença de PRs mutantes ao lado do tipo selvagem PRs no mesmo olho facilita a detecção de defeitos associados com PRs mutantes e para resolver a questão da autonomia celular.
Os defeitos do desenvolvimento observados na nossa análise afectadas vários processos, incluindo o recrutamento de PR, a morfogénese e a polaridade da célula planar (PCP) estabelecimento (Figura 5). Sete na sua ausência é necessária para o recrutamento PR, em particular para R7 um do PR interior. A perda de sete em resultados revelia na perda do PR interior e alguns PRs exteriores (Figura 5A). Cabeça Granulado (GRH) está envolvido no estabelecimento PCP e alguns omatídeos são inverted em grh clones mutantes (Figura 5B). Este método faz com que seja possível identificar os fotorreceptores mutantes em ommatidia mosaico, permitindo a identificação das PRs em que é exigido o gene para a aquisição correcta da PCP. Mostrámos que grh é necessária para a aquisição correcta da PCP em R3 precursores 20. Com efeito, observou-se que, no ommatidia invertido, R4, que se origina a partir do precursor anormalmente R3, era sempre mutante. Migalhas (OCR) é uma proteína de membrana apical necessário para morfogênese rhabdomere 23. A perda de OCR nos resultados mutantes CRBS 11A22 em irregulares, PRs maiores ou menores (Figura 5C).
Este método também pode ser usado para seguir o destino de RP individuais durante a vida adulta (Figura 6). É ideal para estudos de neurodegeneração, porque um grupo de fotorreceptores mutantes homozigóticos pode ser visto e o mesmo grupo pode ser encontrada no mesmo olho domesmo voar ao longo de um período de dias ou semanas. Por conseguinte, é possível determinar quais as RP sobreviver e que está destinado a morrer, porque cada clone tem uma forma única, que pode ser reconhecida quando o olho está posicionado sob o microscópio de fluorescência. À medida que a retina é polarizado, é possível orientar a retina para encontrar o mesmo clone de novo, na base da sua forma. Foi utilizado este método para mostrar que FATP k10307 mutação induz degeneração progressiva PR na idade adulta (Figura 6, 24). Este método de visualização pode também ser utilizado para analisar a autonomia da célula. Em FATP k10307 retina mosaico, perda PR foi restrito a FATP PRs mutantes, os PRs do tipo selvagem sendo afetados. A exigência de FATP para a viabilidade PR é, portanto, célula autônoma. Nós também foram capazes de resgatar o PR mutante FATP por reexpressing tipo selvagem FATP com um motorista RH1-Gal4 e uma construção UAS-FATP (Figura 7). Opossibilidade de realizar tais experiências de resgate é uma das vantagens do método de tomate / GFP-FLP / FRT sobre análise clonal com base em cortes histológicos da retina embedded-resina. Na verdade, a detecção de clones com o método do tomate / GFP-FLP / FRT não é afectada pela utilização de P (UAS, w +) construções de transgénicos, enquanto que a pigmentação vermelha associada com o gene de mini-branco (w +) cobre o olho com pigmento vermelho , mascarando clones de mosaico em cortes histológicos.
Figura 1. Organização do olho Drosophila. (A) A fotografia de um olho Drosophila tirada com microscópio estereoscópico. O olho de Drosophila é composto de cerca de 800 ommatidia. (B) Esquema de um campo de 64 ommatidia no meio do olho. Os seis neurônios fotorreceptores exterior (PRS) de cada omatídeo,mostrado em verde, são organizados em um trapézio estereotipada que aponta para os pólos mais próximas do olho. Eles consequentemente apontar em direções opostas na ventral e na parte dorsal do olho e são imagem de espelho de acordo com a fronteira entre as duas partes, que é chamado o equador. (C) Diagrama esquemático de um omatídeo. Cada omatídeo contém oito PRs. PRs R1 a R6, mostrados em verde, são os PRs exteriores. Eles expressam a molécula fotossensível rhodopsin1 (Rh1) e são equivalentes a células de mamíferos rod. As PRs interiores, R7 e R8, são mostradas em cinza (R7 senta em cima do R8). As PRs internos expressar rodopsina 3, 4, 5 ou 6 e são o equivalente de células cone de mamíferos. Para simplificar, somente o rhabdomere, a parte sensível à luz do PR, é mostrado para cada PR. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 3. Configurando a Drosophila para visualizatíon de córnea neutralização. (A-A'''') de fotografias de uma Drosophila imobilizadas sobre uma placa cheia com agarose. No painel A'''', um pedaço de agarose contendo o mosca foi cortado para tirar uma fotografia do perfil. A Drosophila é meio embutido no agarose, com a direita dentro da agarose ea asa esquerda preso na superfície de agarose (A, A'', A''''). Quando a Drosophila está incorporado no agarose, a cabeça é frequentemente mal posicionada para a visualização do olho (A, A '). A cabeça deve, portanto, ser reorientado com uma pinça de tal modo que o centro do olho é que aponta para cima (A'', A'' '). (B-B') diagrama esquemático, mostrando um Drosophila imobilizado sobre uma placa de agarose e o posicionamento do Drosophila no âmbito do objectivo do microscópio. (C-C ') As fotografias do pôr-do-Drosophila no palco domicroscópio sob o seu objetivo. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 4. Orientação do olho para análise curso a tempo. A figura mostra fotografias de uma cabeça Drosophila em duas orientações diferentes e os campos correspondentes do ommatidia vistos por córnea neutralização, representados como diagramas esquemáticos. (A) Durante a primeira observação, o olho é colocado de tal modo que um clone de tipo selvagem ou heterozigótica RP (amarelo) é visto no meio do campo, ao nível do equador (linha a vermelho). (B) Durante a segunda observação, o olho, muitas vezes não é exactamente a mesma orientação. Assim, o mesmo grupo de fotorreceptores pode ser encontrado de novo, mas que não é possível ver omesmo campo exata (à esquerda). O olho deve ser reorientado para o mesmo campo para ser visto novamente. A posição do equador pode ser usada como um guia. Neste exemplo, sabemos que o campo observado é muito ventral e que o olho devem, portanto, ser transformado ventralmente para colocar o equador no meio do campo observado mais uma vez, tal como na primeira observação.
Figura 5. Exemplos de defeitos de desenvolvimento PR detectados pelo método de tomate / GFP-FLP / FRT. (A) Visualização da sina [BG02648] PRs mutantes mosaico, mostrando a perda de PRs internos. No ommatidia mutante, RP exteriores estão agrupados em conjunto, devido à ausência do interior PR R7. De fato, sina é conhecido por ser necessário para o recrutamento PR interior. (B) Visualização de grh mosaico [s2140] PRs mutantes mostrando defeitos de polaridade. O mosaico mutante ommatidia, surrundada por um círculo, estão apontando na direção oposta a partir do tipo selvagem ommatidia, indicando uma inversão dorso-ventral. Um estudo detalhado com o método de tomate / GFP-FLP / FRT mostrou que grh foi requerido na precursor R3 para a aquisição correta de omatídeo polaridade 20. (C) Visualização de crb [j1B5] PRs mutantes mosaico, mostrando PRs mutantes homozigotos deformadas. CRB é conhecido por ser necessária para a morfogênese rhabdomere.
Figura 6. Curso de Análise de Tempo de FATP mosaico [k10307] PRs mutantes com o método de Tomate / GFP-FLP / FRT, ao longo de 14 dias. Uma FATP mosaico [k10307] retina mutante é observado no dia 1 (A, A '), dia 4 ( B, B '), dia 8 (C, C') e no dia 14 (D, D ') após a eclosão. O mesmo grupo de PRs mosaico pode ser fundaçõesd em cada ponto de tempo, no campo observado (rectângulo branco, A, B, C, D). Neste campo de PRs (A ', B', C ', D'), PRs mutantes homozigotos são marcados em verde, enquanto PRs do tipo selvagem heterozigotos e homozigotos são marcados em amarelo. A partir do dia 4 (B ') em diante, as PRs mutantes homozigotos começam a desaparecer, indicando que o FATP [k10307] mutação provoca uma degeneração progressiva dessas PRs. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 7. Resgate de FATP [k10307] PRs mutantes com um (A) Visualização de controle mosaico levando mini-branco-construir-expressando FATP. As PRs mosaico são visualizados com o método de tomate / GFP-FLP / FRT em moscas de 15 dias de idade. PRs. (B) Visualization de mosaico FATP PRs mutante, mostrando a perda de PRs mutantes. (C) Visualização de mosaico FATP PRs mutantes em um FATP mosca reexpressing no PR exterior (RH1> FATP). As PRs mutantes são resgatados. A presença de um gene mini-branco e da pigmentação dos olhos vermelhos associado na RH1> condições FATP não altera de tomate ou de fluorescência da GFP ou detecção clonal.
Discussion
O olho de Drosophila tem sido amplamente utilizada para decifrar as vias de sinalização que regulam o desenvolvimento, a sobrevivência e proliferação. No início de 1990, um grande número de telas genéticos foram realizados para identificar os caminhos necessários durante as fases iniciais de desenvolvimento do PR 25-27. A eficiência de telas genéticos foi aumentada grandemente através da técnica de recombinação mitótico, que faz com que seja possível testar as mutações de perda de função em clones de mosaico 21. Assim, o papel das mutações letais embrionárias poderiam ser sistematicamente testados em clones mutantes homozigotos nos olhos de moscas que eram de outra maneira heterozigotos. A maioria das projeções de mosaico têm-se centrado sobre o recrutamento PR cedo, a diferenciação, a projeção axonal ou morfogênese ocorrendo nas larvas ou pupas 10,25-31 desenvolvimento. Até o momento, apenas uma tela mosaico investigou os mecanismos que regulam a função adulto PR, através do monitoramento da resposta visual via electroretinOgram gravações 32. Com o método de Tomate / GFP-FLP / FRT ea possibilidade de realização de análise de curso de tempo em que vivem os animais mutantes, criamos um novo método para identificar os fatores que regulam adulto viabilidade PR e funcionar 20,24.
O método de tomate / GFP-FLP / FRT tem várias vantagens importantes sobre o corte histológico clássico de olhos embebidos em resina. Em primeiro lugar, este método é muito mais rápido, mais barato e mais fácil de realizar do que o método histológico, desde que um microscópio de fluorescência equipado com um objetivo de imersão de água apropriado está disponível (ver Tabela de Reagentes e Equipamentos). Em segundo lugar, o método de tomate / GFP-FLP / DRF pode ser usado em conjunção com a expressão do transgene, tais como a expressão de P (UAS, w +), transportando uma mini-branco do transgene. Em contraste com os cortes histológicos, em que w + é utilizado para a detecção clonal no sistema de tomate / GFP-FLP / FRT, P (UAS, w +) não interfere com d clonaletection base de proteína fluorescente tomate. Usando P (UAS-FATP, w +) moscas transgénicas, fomos capazes de visualizar o resgate de PRs mutantes FATP (Figura 7). Em terceiro lugar, uma armadilha chave de todos os tipos de análise clonal, incluindo as baseadas em tomate / GFP-FLP / FRT, é a ambigüidade do genótipo de PRs perdidos. De facto, pode não ser claro se a PR está ausente, devido à falta de uma função de um gene específico, ou por causa de um efeito celular não autónomo, particularmente na fronteira entre o clone mutante. O método de tomate / GFP-FLP / FRT contorna este problema, para a degeneração, tornando possível seguir do tipo selvagem e mutantes PRs no mesmo animal em períodos de várias semanas. Nós fomos capazes de seguir o destino de PRs individuais por cinética análises sobre diferentes FATP moscas mutantes (Figura 6). O mesmo clone pode ser reconhecido num dado animal em momentos diferentes, por causa da forma precisa dos clones de tipo selvagem circundantes. Fomos capazes de mostrar inequívocaly que todos os PRs em falta foram mutante para FATP, indicando que o papel dos mutantes FATP em PRs é célula-autônoma. Assim, através da monitorização da perda de fotorreceptores na análise cinética, é possível determinar o genótipo de fotorreceptores em modelos de degeneração de início adulto. Finalmente, o método de tomate / GFP-FLP / FRT provou ser muito poderosa para a identificação de factores que regulam o estabelecimento de PCP 20. A possibilidade de atingir um grande número de ommatidia mosaico para um fenótipo de polaridade, sem a necessidade de secções, facilita a determinação rápida do PR requisito para o estabelecimento de PCP. No entanto, a análise mais fina da integridade PR exigiria o corte tradicional seguido por contraste de fase ou microscopia eletrônica.
Em conclusão, o método de tomate / GFP-FLP / FRT abre novas possibilidades para a seleção mosaico eficiente para identificar os fatores que regulam os processos de desenvolvimento de relações públicas e funções adulto PR, como a visresposta ual e viabilidade.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
PLATIM e droso-Tools instalações do UMS3444 Biosciences, Lyon, França. A pesquisa da BM foi apoiada por doações da Fondation pour la Recherche Médicale do CNRS (ATIP) ea ANR-12-BSV1-0019-01. PD foi apoiado por Retina França associação e da École Normale Supérieure de Lyon (França). CL foi apoiado por La Ligue Nationale contre le Cancer associação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Agarose | Euromedex | D5-E | Regular agarose is used to immobilize the flies |
| Petri dish | BD Falcon | 353001 | 35 x 10 mm, 1.37 x 0.39 inch |
| Cold-ice water | To maintain the flies anesthetized | ||
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Dutcher | SMZ645 | |
| Water Bath | Julabo | 9550102 | To keep the agarose solution at warm temperature |
| 40X Water objective | Zeiss | 420967-9900-000 | Water dipping objective for the confocal microscope |
References
- Hardie, R. C. Sensory physiology 5. Ottoson, D. 5, 1-79 (1985).
- Wolff, T., Ready, D. F. Cell death in normal and rough eye mutants of Drosophila. Development. 113, 825-839 (1991).
- Rister, J., Desplan, C. The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates. Dev Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).
- Halder, G., Callaerts, P., Gehring, W. J. Induction of ectopic eyes by targeted expression of the eyeless gene in Drosophila. Science. 267, 1788-1792 (1995).
- Mollereau, B., Domingos, P. M. Photoreceptor differentiation in Drosophila: from immature neurons to functional photoreceptors. Dev Dyn. 232, 585-592 (2005).
- Mollereau, B. Cell death: what can we learn from flies? Editorial for the special review issue on Drosophila apoptosis. Apoptosis. 14, 929-934 (2009).
- Charlton-Perkins, M., Brown, N. L., Cook, T. A. The lens in focus: a comparison of lens development in Drosophila and vertebrates. Mol Genet Genomics. 286, 189-213 (2011).
- Jenny, A. Planar cell polarity signaling in the Drosophila eye. Curr Top Dev Biol. 93, 189-227 (2010).
- Montell, C. Drosophila visual transduction. Trends Neurosci. 35, 356-363 (2012).
- Chen, J., et al. Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers. PLoS Biol. 3, e59 (2005).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in the Drosophila ommatidium. Dev Biol. 120, 366-376 (1987).
- Mendes, C. S., et al. ER stress protects from retinal degeneration. Embo J. 28, 1296-1307 (2009).
- Jenny, A. Preparation of adult Drosophila eyes for thin sectioning and microscopic analysis. J Vis Exp. , (2011).
- Mollereau, B., et al. Two-step process for photoreceptor formation in Drosophila. Nature. 412, 911-913 (2001).
- Domingos, P. M., et al. Spalt transcription factors are required for R3/R4 specification and establishment of planar cell polarity in the Drosophila eye. Development. 131, 5695-5702 (2004).
- Mendes, C. S., et al. Cytochrome c-d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina. EMBO Rep. 7, 933-939 (2006).
- Domingos, P. M., et al. Regulation of R7 and R8 differentiation by the spalt genes. Dev Biol. 273, 121-133 (2004).
- Mollereau, B., et al. A green fluorescent protein enhancer trap screen in Drosophila photoreceptor cells. Mech Dev. 93, 151-160 (2000).
- Pichaud, F., Desplan, C. A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia. Development. 128, 815-826 (2001).
- Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila. Dev Biol. 351, 128-134 (2011).
- Golic, K. G. Site-specific recombination between homologous chromosomes in Drosophila. Science. 252, 958-961 (1991).
- Porter, J. A., Hicks, J. L., Williams, D. S., Montell, C. Differential localizations of and requirements for the two Drosophila ninaC kinase/myosins in photoreceptor cells. J Cell Biol. 116, 683-693 (1992).
- Johnson, K., Grawe, F., Grzeschik, N., Knust, E. Drosophila crumbs is required to inhibit light-induced photoreceptor degeneration. Curr Biol. 12, 1675-1680 (2002).
- Dourlen, P., et al. Drosophila fatty acid transport protein regulates rhodopsin-1 metabolism and is required for photoreceptor neuron survival. PLoS Genet. 8, e1002833 (2012).
- Mlodzik, M., Hiromi, Y., Weber, U., Goodman, C. S., Rubin, G. M. The Drosophila seven-up gene, a member of the steroid receptor gene superfamily, controls photoreceptor cell fates. Cell. 60, 211-224 (1990).
- Gaul, U., Chang, H., Choi, T., Karim, F., Rubin, G. M. Identification of ras targets using a genetic approach. Ciba Found Symp. 176, 85-92 (1993).
- Wassarman, D. A., Therrien, M., Rubin, G. M. The Ras signaling pathway in Drosophila. Curr Opin Genet Dev. 5, 44-50 (1995).
- Janody, F., et al. A mosaic genetic screen reveals distinct roles for trithorax and polycomb group genes in Drosophila eye development. Genetics. 166, 187-200 (2004).
- Legent, K., Steinhauer, J., Richard, M., Treisman, J. E. A screen for X-linked mutations affecting Drosophila photoreceptor differentiation identifies Casein kinase 1alpha as an essential negative regulator of wingless signaling. Genetics. 190, 601-616 (2012).
- Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127, 851-860 (2000).
- Berger, J., et al. Systematic identification of genes that regulate neuronal wiring in the Drosophila visual system. PLoS Genet. 4, e1000085 (2008).
- Bayat, V., et al. Mutations in the mitochondrial methionyl-tRNA synthetase cause a neurodegenerative phenotype in flies and a recessive ataxia (ARSAL) in humans. PLoS Biol. 10, e1001288 (2012).
