Fare ve İnsan Kolon Doku Primer miyofibroblastlar İzolasyonu

Summary

Miyofibroblast normal ve hastalık her iki durumda önemli fizyolojik işlemleri düzenleyen gastrointestinal sistemin etkili bir stromal hücresidir. Biz, fare ve in vitro deney için kullanılabilir insan kolon dokusu, hem birincil miyofibroblastlar izolasyonu sağlayan bir tekniği açıklar.

Abstract

Miyofibroblast çok GI fonksiyonları kritik rolü için önemli bir önem kazanmaktadır mide-bağırsak (GI) sistemi içinde bir stromal hücresidir. Birkaç miyofibroblast hücre çizgileri bu hücrelerin in vitro çalışma için ticari olarak mevcut olmakla birlikte, deneysel hücre kültür koşullarına maruz bırakılan bir hücre hattından araştırma sonuçları işin aşırı indirgemeci doğası gereği doğal sınırlamaları vardır. Birincil miyofibroblastlann bir hücre çizgisinde tespit deneysel bulguları teyit açısından büyük bir avantaj sunmaktadır. Bir hayvan modelinde birincil miyofibroblastlar izolasyonu daha yakından hastalık durumu çalışılmaktadır taklit eden şartlar altında miyofibroblastlar çalışma sağlar. Hücreler altta yatan hastalığı olan hastalarda doğrudan gelir beri insan kolon dokusundan birincil miyofibroblastlar izolasyonu, tartışmasız en uygun deneysel verileri sağlar. Biz u olabilir köklü bir tekniği açıklarFare ve insan kolon dokusunun hem birincil miyofibroblastlar izole etmek tilized. Bu izole edilmiş hücreler, bağırsak epitel altı miyofibroblastlar tutarlı a-düz kas aktin ve vimentin pozitif ve desmin-negatif olmak karakterize edilmiştir. Birincil miyofibroblast hücreler hücre kültürü içinde büyütülmüş ve pasajların sınırlı sayıda fazla deneysel amaçlar için kullanılabilir.

Introduction

Gastrointestinal (Gİ) sistem fonksiyonunun düzenlenmesi mukoza tabakası ve onun altında yatan mezenşimin arasındaki karmaşık, dinamik etkileşimleri içerir. Bu etkileşimler, normal dengesini korumak için hizmet değil, aynı zamanda patolojik koşullar altında ¹ hastalık durumlarının gelişmesine yol açabilir. Miyofibroblastlar mukozal rejenerasyon, onarım ve fibrozis ² içeren kritik Gİ süreçlerin bir dizi düzenleyen hücre subpopülasyonunun ülkelerle birlikte bir parakrin iletişim epitel tabakası alttaki bulunan stromal hücrelerin bir alt vardır.

İn situ miyofibroblastlar primer özelliklerinin çok paylaştığı için 18Co hücre hattı yaygın olarak miyofibroblast fonksiyonu çalışma için kullanılmıştır, insan kolon miyofibroblast hücre hattının bir örneğidir. Bunlar protein a-düz kas aktin ekspresyonu (α-SMA) ve vimentin yanı sıra, bir dizi ekspresyonunu içerirörneğin, epidermal büyüme faktörü reseptörü, ya da lizofosfatidik ^{asit, 3,4} için reseptör olarak, hücre yüzeyi reseptörlerinin. Çünkü bu ortak ince yapı özellikleri, hem de biyolojik işlevi ⁵ benzerlikler, 18Co hücre hattı, enflamatuar barsak hastalığı veya kolorektal kanser ^3,6 gibi birçok hastalık durumlarının bağlamında miyofibroblast fonksiyonunu incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, hücre satırını kullanarak doğal sınırlamalar ve endişeler vardır. Bu büyüme oranları ve diğer hücre popülasyonları ile etkileşimler de dahil olmak üzere hücrenin fenotipini ve biyolojik işlevi değiştirerek, primer hücrelerden hücre çizgileri ayıran zamanla genotipik instabilitedir. Hücre hatları, aynı zamanda kullanımı için önemli bir sınırlamadır GI mikro-(epitel, stromal ve vasküler bileşenlerinin), normal bileşenleri eksikliği. Bu nedenle, deneysel hücre çizgisi araştırmadan çıkan sonuçlar ri azaltmak için daha fazla doğrulama gerektirirmisinterpretation sk.

Birincil miyofibroblastlar bir hücre hattı ⁷ belirlenen deneysel bulguları teyit etmek için, insan ve fare kolon dokusundan elde edilebilir. Yöntem ilk Mahida, et al. ⁸ tarafından tarif edilen, ve protokol, fare ve insan kolon ⁹ birincil miyofibroblastlar izole etmek için de kullanılabilir, çok iyi tarif edilen tekniklerden biridir. Bağırsak hastalığının herhangi bir fare modeli için, bu teknik, bunlar komşu hücreler ile etkileşime nasıl çalışma veya normal ya da patolojik GI ^10,11 süreçleri iki katkı birincil miyofibroblastlar izole etmek için kullanılabilir. Bu teknik miyofibroblastlar şifa, fibrozis, ve kolorektal adenom ve karsinom gelişimine mukozal nasıl katkıda incelemek için kullanılabilir. Birincil miyofibroblastlar da benign (iltihaplı bağırsak hastalığı, striktür, divertikülit) ya da kötü huylu c operasyon zamanında rezeke edilmiş insan kolon dokusundan elde edilebilirşartlarından. İnsan ve fare kolon dokusundan izole edilmiş primer hücrelerde hücre kültürü içinde büyütülmüş ve pasajların sınırlı sayıda üzerinde kullanılabilir.

Protocol

1.. Kolon Doku elde

Fare

Mantığını ve araştırma hedefleri detaylandıran, hayvan deneyleri gerçekleştirmek için bir protokol, teslim ve Hayvancılık Araştırma Gözetim bizim kurumsal Dairesi tarafından onaylandı.

1. Servikal dislokasyon inhale izofluran ile fare Euthanize.
2. Ventral orta hat kesi yapmak, uzakta küçük bağırsak geri çekin ve kolon tanımlamak. Yanal mesane ve rahim (varsa) geri çekin ve kasık kemiği belirlemek ve rektum maruz ince makasla kesti.
3. Kolon kapalı rektum dorsal mezenter incelemek ve anüs çekum kolon harekete ve küçük bağırsak kolon kesmek için transect.
4. Buz soğukluğunda fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) 'de örnek yerleştirin.
5. Buz gibi soğuk PBS ile bir 10 ml şırınga doldurun ve kolon ope kesilmiş, daha sonra içeriğini temizlemek için birkaç kez lümen kolon temizlemen boy-bilge makas kullanarak.
6. Buz soğukluğunda PBS ile 20 ml içeren, 50 ml konik bir tüp içinde kolon yerleştirin. Kolon, herhangi bir yönde yerleştirilmiş olmak zorunda değildir. Akışkan, partikül madde ile temizlenene kadar PBS değiştirerek kolon yıkayın.

Insan

Bu dokusunun yanısıra, potansiyel riskleri ve yararları bir değerlendirmesini elde önemini ayrıntılı, cerrahi hastalarında insan dokusu elde etmek bir protokol, teslim ve İnsan Araştırma Koruma Programı bizim kurumsal Dairesi tarafından onaylandı.

1. Bir kolorektal cerrah ile araştırma işbirliği araştırma için insan doku elde edebilmek için gereklidir. Insan kolon dokusu elde etmek için bir protokol gönderilen ve kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmış olması gerekir.
2. Yazılı izin önce cerrahi prosedür için hastadan elde edilir.
3. Cerrah standında bir kolon rezeksiyonu yapacakard moda. Kolon hastadan çıkarıldıktan sonra, numune, hemen patolojiye alınır. Patolojik değerlendirilmesi için gerekli değildir kolon duvarının tam kat bölümünde 0,5 sağlanır ve hemen buz soğukluğunda PBS yerleştirilir. Bu numune kolon mezenter içermemelidir ve yağ mevcudiyeti, sindirim süreci etkiler çünkü epiploik uzantılar, aynı zamanda kaldırılması gerekir.

2. Epitel Hücreleri soymak

1. 50 ml konik bir tüp içinde HBSS içinde 5 mM EDTA (oda sıcaklığı) 25 ml tüm fare kolon inkübe edin. 15 dakika boyunca 37 ° C hava banyosu çalkalanarak (250 rpm) 'de konik tüp yerleştirin. 15 dakika sonra, dikkatli bir şekilde sıvı dökün ve 5 mM EDTA, 25 ml dolum tüpü, 5 yıkama toplam tekrarlayın. Insan kolon için, patolog gelen kolon duvarının ½ inç şeridi aldıktan sonra dört eşit büyüklükte parçalara makasla kolon kesti. Bir 50 ml konik bir tüp içine parçalarının iki yerleştirin veAyrı bir 50 mL konik tüp içine kolon dokusunun geri kalan iki adet yerleştirin. Daha sonra yukarıda tarif edildiği gibi, HBSS içinde 5 mM EDTA, 25 ml ile inkübe edilir ve yıkama yapar.
2. Buz soğukluğunda 20 ml PBS içinde iki kez kolon durulayın.
3. RPMI-5 20 ml, dispaz 10 U ve kolajenaz D 2000 U (oda sıcaklığı) içeren yeni bir 50 ml konik bir tüp içinde, fare kolon doku yerleştirin. Insan kolon dokusunun için, dispaz ve kolajenaz iki katı (20 U dispaz, 4000 U kolajenaz D) kullanın.
4. (Yatay yerleştirilmiş ise, çok fazla havalandırma ve hücre hasarı var) dikey yönelimli bir 37 ° C sallayarak hava banyoda tüpü yerleştirin. Kadar 60 dakika boyunca 250 rpm'de çalkalanır. Dispase ve kollajenaz D maruz kaldıktan sonra, kolon doku sindirimi başlayacak ve kolon doku lifli bakmaya başlayacaktır. Bu genellikle yaklaşık 30 dakika sürer. Bu kolon görünüme sahip olduğunda, enzimlerden kolon çıkarın.
5. Dokusu kırmak için yukarı ve aşağı 2-4 kez her tüpü çalkalayın. P5 dakika boyunca masa üstü bir santrifüj (4 ° C) de 200 xg'de doku ellet. Dikkatlice süpernatant dökün ve atın.

3. Miyofibroblast İzolasyon ve Kültür

1. 10 ml ACK lisiz tamponu (47 ° C) eklenerek her pelet tekrar. Tekrar santrifüj 5 dakika (4 ° C) için 200 xg, kapalı dökün ve süpernatant atın.
2. Bir pipet ile 10 ml RPMI-5 ekleyerek her pelet tekrar.
3. Bir 100 mm TC-muamele kabı içine 10 ml'lik bir pipet kullanılarak 70 mikron gözenekli süzgeç vasıtasıyla hücre süspansiyonu (5 mi) arasında yarı geçirir. Daha sonra RPMI-5 ek bir 15 ml. Farklı 100 mm TC-muamele kabına hücre süspansiyonu geri kalan 5 ml ile tekrarla. Bir fare kolon nedenle iki 100 mm TC-muamele yemekler verecektir. Insan kolon dokusunun ½ bir inçlik tabaka, dört adet 100-mm TC-muamele yemekler, toplam ürün olarak verecektir.
4. 37 ° C'de% 10 _CO2 inkübatör doku kültür kaplarına yerleştirin Kültür koşulları aynı fya da fare ve insan birincil hücreler.
5. 3 saat sonra, yavaşça HBSS iki değişiklik ile yıkanarak yapışmayan hücreler yıkayın. Enkaz kayan nazikçe yıkanmalıdır. Yapışık hücreler epitel hücreleri, makrofajlar ve miyofibroblastlar oluşmaktadır. Bir hafta sonrası tohumlama, sadece bölme miyofibroblastlar, makrofajlar ve epitel hücreleri ilk geçişinden sonra senesce. Taze RPMI-5'i ilave edin ve hücre kültüründe hücreler büyür.
6. Hücreler, 5 dakika boyunca tripsinizasyon ile pasajlanır ve 2:1 bölünür.

Kısaltmalar

HBSS: Hank'in dengeli tuz çözeltisi, RPMI-5: Roswell Park Memorial Institute medya; ACK: Amonyum Klorür-Potasyum; FCS: fetal buzağı serumu, TC-tedavi: doku kültürü tedavi

Çözümler

ACK lisiz tamponu - (4.15 g _NH4CI, 0.5 g KHCO _3, 18.6 mg Na ₂ EDTA, 400 ml ₂ H, O, 1 N HCI ile 7.2-7.4 pH ayarlamak için). Filtre Sterilize bir 0.2 mikron filtre ve mağaza üzerinden 4 ° C'de RPMI-5 - (500 ml yapmak için: 454,5 ml RPMI, 25 mi FCS, 5 ml 200 mM L-glutamin, 5 ml 1 M HEPES, pH 7.4, 5 mi 100 mM sodyum piruvat, 5 ml 100x Pen-Strep, PBS içinde 500 ml 50 mM B-ME).

Representative Results

Bir kez izole edilmiş, birincil insan miyofibroblastlar hücre kültürü içinde yetiştirilen ve (geçit 4 kadar) geçişlerinin sınırlı sayıda üzerinde kullanılabilir. Bu hücreler, bağırsak epitel altı miyofibroblastlar ^5,7 ile tutarlı a-düz kas aktin ve vimentin pozitif olarak karakterize edilir ve desmin-negatif (Şekil 1A) vardır. Ayrıca, tipik bir yıldız şeklinde bir morfoloji (Şekil 1 B) vardır. Birincil miyofibroblastlar daha sonra bir hücre çizgisinde tespit deneysel bulguları teyit etmek için kullanılabilir. Bu yaklaşım, pro-inflamatuar sitokin, TNF-α (10 ng / ml) EGF reseptör ekspresyonunun düzenlenmesine neden olduğu ve bu hücrelerin ^7'de sinyal olduğunu göstermek için kullanılmıştır. Upregüle EGF reseptör ekspresyon ve sinyalizasyon ilk olarak daha önce anlatılmış olan, insan kolon miyofibroblast hücre hattı 18Co (Şekil 2) kullanılarak saptanmıştır. Şekil 2A'da, biz için 18Co hücrelerinkinden maruz göstermektedir TNF-45; EGF reseptör ifadesinde zamana bağlı bir artışa yol açmıştır. Bu, bu hücrelerde gelişmiş EGF kaynaklı COX-2 ifadesi ile p42/44 MAPK fosforilasyon (Şekil 2B) ile ilişki içindedir. Bu deneysel bulguları doğrulamak için, deneyler, kolorektal kanser hastalarının cerrahi olarak kesilmiş kolon izole edilen primer insan miyofibroblastlar kullanılarak tekrar edilmiştir. Şekil 2C ve 2D'de gösterildiği gibi, birincil insan miyofibroblastlar yakından başlangıçta 18Co hücre hattı ^7'de tanımlanan deney bulguları taklit.

Şekil 1. Primer miyofibroblastlar insan kolon dokusunun ⁷ izole edilebilir. İzole primer hücreleri (sürekli bir-SMA ve vimentin pozitif (Şekil 1A) olan bir miyofibroblast gibi fenotip göstermek ve Stellate morfolojisini gösteren

Şekil 2. Bir hücre hattı deneysel bulgular, primer insan miyofibroblast ⁷ hücreleri kullanılarak doğrulanmıştır edilir. 18Co TNF-α göstermek için kullanılan insan kolon miyofibroblast hücre hattı bu hücrelerdeki EGF reseptör ekspresyonu ve sinyallemesinin yukarı düzenlemesini (Şekil 2A) neden olur. EGF reseptör ifadesi bu şekilde düzenlenmesi, EGF sonraki maruz kalma geliştirilmiş p42/44 MAPK fosforilasyonu ve COX-2 ifadesi yol Şekil 2B'de gösterildiği gibi, gelişmiş EGF reseptörü sinyallemesi ile ilişkilendirilmiştir. Bu etkiler tamamen EGF reseptör inhibitörü AG1478 ile inhibe edilmiştir. Kolorektal kanserli hastaların cerrahi rezeksiyon kolon izole birincil insan miyofibroblastlar bu deneysel bulguları onaylamak (Şekil 2Cve 2D). Tümör nekroz faktörü-alfa = TNF-α, EGFR = EGF reseptörü, AG = AG1478, COX-2 = siklooksijenaz-2. büyük rakam görmek için buraya tıklayın.

Şekil 3,. Birincil miyofibroblastlar fare kolon dokusundan izole edilebilir. Birincil fare miyofibroblast hücrelerinin bir 10X görünümü. büyük rakam görmek için buraya tıklayın.

Discussion

Fare ya da insan kolon kullanarak zaman genel teknik benzer. Bu teknik aynı zamanda ince bağırsaktan miyofibroblastlar izole etmek için kullanılabilir. 1 ila miyofibroblastlar izolasyonu için özel bilgiler. Fare ve 2. insan kolon aşağıda tartışılmaktadır.

1.. Fare Kolon

Fare kolon sulama kolonun bir ucuna 16 G Popper küt uç iğne, bir 4 takılarak kolaylaştırılır. Uzunlamasına kolon kesim bu da yardımcı olur. Sen iğne üzerine kolon doku Akordeon, sonra keskin ucu yukarı bakacak makasın bir ucu yere ve boyuna açmak için kesim sırasında makas kenar üzerinde kolon doku kaydırın.

Adım 2.1 'de, ölü hücrelerden nükleer malzeme hücre topaklanma neden olduğunu anlamak için önemlidir. DNase (50 mg / ml) ilave edilmesi, bu sorunu çözmek için kullanılabilir.

En kritik adım adım 2.4 olduğunu. Bir ca tutunkolon dokusunun reful izle. Kolon lifli bakmaya başladığında, enzimlerden kolon çıkarın. Sen tüm 60 dakika boyunca kolon inkübe gerekmez. Kolon dokusu uzun süre dispase ve kollajenaz D maruz kalırsa, hücreleri ölür. Bu düşük hücre verim neden ortak bir hatadır.

Hücrelerin kirlenmesi başka yaygın bir sorundur. Dikkatli tekniği, uygun yıkama ve filtreleme hücre kültürü çalışmaları için kullanılan standart, steril teknikleri ile birlikte, kontaminasyon riskini en aza indirecektir.

2. Human Colon

Enzimler ile inkübasyon için zamanın uzunluğu sindirilmiş olan numune büyüklüğüne bağlıdır. Biz genellikle insan kolon duvarının ½ inç tam kalınlıkta şeridini almak. Insan kolon dokusundan miyofibroblastlar izole ederken adım 2.3 'de bir değişiklik var. Adım 2.3 için, insan kolon için size dispase miktarını (20 U) ve co çift gerekirllagenase D (4000 U) kullanılır. Kolonun daha büyük bir bölümü daha uzun bir kuluçka zaman gerektirecektir. Ayrıca, enzimlerin spesifik aktivite dolu değişebilir unutmayın, bu yüzden buna göre kuluçka süresini ayarlamak gerekebilir.

Primer, fare ve insan miyofibroblastlar her ikisi için, izole edilen hücreler hücre saflığı değerlendirmek için ve hücrelerin miyofibroblast benzeri onaylamak için 0nce kültüründe yetiştirilen değerlendirilmelidir. Bu immünohistokimyasal boyama (işaretlerini miyofibroblast için antikorlar, a-düz kas aktin ve vimentin dahil içeren tekniğin çeşitli yapılabilir; CD68 monoklonal antikor makrofajlara özel olup, CD31 endotel hücrelerine özgüdür ve CD45 bağışıklık hücrelerine özeldir; e-kaderin ve çeşitli cytokeratins antikorları epitel hücreleri için spesifik olan. mRNA ekspresyonu, RT-PCR, aynı zamanda ¹² ile değerlendirilebilir. akış sitometri analizi, aynı zamanda, hücre ¹³ için kullanılabilir.

in vitro ve ko-kültür deneyleri için de kullanılabilir. Birincil hücreler, hücre-hücre etkileşimleri ¹⁴ çalışma farelerin deri altı doku içine implante edilebilir. Gelecek uygulamalar genetik manipülasyon aşağıdaki fare kolonoskopi kullanan bir singenik fare kolon duvarına birincil miyofibroblastlar yeniden implantasyonu içerebilir.

İnsan ve fare kolon birincil miyofibroblastlar izole etmek için alternatif bir dizi yöntem de tarif edilmiştir. İki aşağıda sıralanmıştır:

1. Mahida, et al. Am. J. Physiol. 273 G1341-1348, (1997).
2. De Wever, et al. Int. J. Oncol. 39, 393-400, (2011).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Dispase I	Invitrogen/GIBCO	#17105-041
Collagenase D	Roche	#1 088 858
4 in, 16 G Popper blunt-end needle	Fisher	#14-825-16K