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Summary
Une procédure en deux étapes de la collagénase de perfusion modifié pour l'isolement d'hépatocytes humains est décrit. Cette méthode peut également être appliquée à d'autres foies de mammifères. Les hépatocytes isolés sont disponibles en haute rendement et la viabilité, les un modèle approprié pour la recherche scientifique dans des domaines tels que la régénération du foie, la pharmacocinétique et la toxicologie faire.
Abstract
Le foie, un organe d'une capacité de régénération exceptionnelle, effectue un large éventail de fonctions, telles que la désintoxication, le métabolisme et l'homéostasie. En tant que tel, les hépatocytes sont un modèle important pour une grande variété de questions de recherche. En particulier, l'utilisation d'hépatocytes humains est particulièrement important dans les domaines de la pharmacocinétique, la toxicologie, la régénération du foie et de la recherche de translation. Ainsi, ce procédé présente une version modifiée d'une procédure de perfusion de collagénase en deux étapes pour isoler les hépatocytes, comme décrit par une Seglen.
Auparavant, les hépatocytes ont été isolés par des méthodes mécaniques. Cependant, les méthodes enzymatiques ont été montré supérieur hépatocytes conservent leur intégrité et leur fonction structurale après isolement. Cette méthode présentée ici adapte le procédé précédemment conçu pour les foies de rats à des pièces et des résultats de foie humain dans un grand rendement des hépatocytes avec une viabilité de 77 ± 10%. Le principaldifférence de ce procédé est le processus de cannulization des vaisseaux sanguins. En outre, le procédé décrit ici peut également être appliquée à des foies provenant d'autres espèces avec foie ou des vaisseaux sanguins de tailles comparables.
Introduction
Une suspension de cellules de foie peut être préparé à partir du foie par des méthodes mécaniques ou enzymatiques. Les méthodes mécaniques utilisées pour préparer les cellules du foie entier comprennent forcer le foie à travers une étamine 2, secouant un morceau de foie avec des perles de verre dans un shaker Kahn 3, en utilisant des homogénéisateurs de verre avec des pilons en vrac 4,5 etc Au fil des ans, les méthodes mécaniques ont baissé de favoriser raison des dommages à la membrane cellulaire et la perte de la fonction des hépatocytes isolés 6,7. Par conséquent, l'utilisation d'un procédé enzymatique est actuellement la principale méthode pour l'isolement d'hépatocytes.
L'isolement des hépatocytes en utilisant une méthode enzymatique a été considérablement améliorée lorsque Berry et Friend 8 perfusées la collagénase et la hyaluronidase dans le foie via la veine porte chez des rats. Ce processus de perfusion utilisé le système vasculaire pour permettre aux enzymes de venir en contact étroit avec la majorité des cellules, conduisant àune augmentation de 6 fois le rendement des hépatocytes 8. En outre, cette méthode a donné des cellules qui ont conservé leur intégrité structurelle, avec pratiquement aucune transformation de réticulum endoplasmique dans des vésicules isolées et aucun dommage mitochondrial 8.
Cette méthode a été modifiée par une Seglen, pionnier une procédure de perfusion en deux étapes pour l'isolation des cellules du foie. Dans cette procédure, le foie de rat est perfusé avec un tampon 2 + Ca libre suivie d'une perfusion avec un tampon contenant de la collagénase de Ca 2 + 1. L'élimination de Ca 2 + dans la première étape permet de perturber les desmosomes, tandis que l'addition de Ca 2 + dans la deuxième étape est requise pour l'activité de la collagénase 1,9 optimum.
Étant donné que les travaux publiés décrite ci-dessus a été réalisée chez le rat, cet article vise à démontrer une procédure modifiée qui peut être utilisé pour l'isolement des hépatocytes avec une grande viabilité de bourdonnementun foie. L'utilisation d'hépatocytes humains reste important pour la recherche de translation et de validation des expériences utilisant des modèles animaux. Les morceaux de foie humain utilisés dans cette étude ont été acquis avec le consentement de la gouvernance à travers la Fondation de tissus humains et de cellules de recherche, une fondation contrôlée par l'État à but non lucratif 10. Après un pathologiste supprimé ce qui était nécessaire pour le diagnostic, des morceaux de foie ont été prélevés dans le tissu restant. Le tissu sectionnée par le pathologiste était morphologiquement tissus sains obtenus à partir des marges de résection après résection hépatique.
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Protocol
Une. Préparation de la perfusion et l'isolement Solutions
- Préparer les solutions nécessaires pour la perfusion de la pièce de foie et de l'isolement des hépatocytes, conformément au tableau 1. Les solutions peuvent être stockées à 4 ° C jusqu'à utilisation.
- Filtre stérile toutes les solutions en utilisant un filtre de 0,22 um.
- Toutes les solutions qui viennent en contact avec le foie doivent être stériles.
2. Préparation de l'équipement et des solutions de perfusion
- L'équipement pour la perfusion de la pièce de foie doit être mis en place comme représenté sur la figure 1.
- Le bain d'eau doit être réglée à une température appropriée, qui est différent dans chaque montage expérimental particulier, tel que les solutions sont à la température de 37 ° C quand ils atteignent la pièce de foie. Dans ce cas, le bain d'eau est réglée à 41 ° C pour chauffer les solutions 1, 2 et 3 et le condenseur en verre à double enveloppe. Solution 4 doit être réchauffé à37 ° C dans un bain d'eau séparée pour utilisation pour réduire la perte d'activité de la collagénase.
- Peu de temps avant la perfusion du foie, mettez le régulateur du réservoir de gaz contenant 95% d'O 2/5% de CO 2 au gaz de l'appareil d'oxygénation (figure 1E).
3. Perfusion du foie
- Un morceau de foie avec autant capsule intacte de Glisson que possible et idéalement avec une surface de seulement 1 coupe doit être obtenue à partir d'un pathologiste pour perfusion.
- Placer cette pièce de foie sur l'entonnoir Büchner qui contient un disque de filtre perforé (figure 1B).
- Le système de perfusion doit être amorcée avec la solution 1.
- Avec une vitesse d'écoulement faible, incurvée canules d'irrigation avec des embouts d'olive doit être inséré dans les vaisseaux sanguins plus grands sur la surface de la pièce de foie de coupe. Comme le sang évacue par le foie, le tissu devient plus léger dans les zones avec une bonne perfusion. Le nombre de canules utilisées pour différentes taillesdes foies est représenté sur la figure 2A. La taille de la jauge choisie devrait se traduire par un ajustement confortable qui tiendra les canules à la place. Les vaisseaux sanguins plus petits doivent être laissés ouverts pour le tampon de perfusion à s'écouler hors de la pièce de foie.
- Augmenter le débit de la pompe péristaltique à entre 110 à 460 ml / min selon la taille du foie (Figure 2B). Il en résulte un débit moyen de 44 ± 16 ml / min par la canule (figure 2C). La vitesse choisie est fonction de la pièce de foie et devrait se traduire par une légère repulpant place de la pièce de foie. Dans certains cas, il peut être nécessaire de serrer fermer certains des récipients ouverts avec des micro clamps vasculaires pour atteindre la légère repulpant mentionné ci-dessus. Une bonne perfusion peut être observé lorsque la pièce de foie est une couleur plus claire partout.
- Gardez la pièce humide du foie pendant la perfusion en le recouvrant d'un morceau de gaze trempé dans une solution saline.
- Perfuser avec 1 L de solution 1 pour débusquer tout remaining sang dans la pièce du foie.
- Changer le liquide de perfusion à la solution 2 et perfuser pendant 10 min.
- Commuter le liquide de perfusion pour perfuser la solution 3 et avec 0,5 L.
- Changer le liquide de perfusion de la solution 4, qui contient de 0,1 à 0,15% de collagénase (Tableau 2).
- Pour cette étape, la perfusion doit être effectuée de manière à recirculation pour 9-12 minutes ou jusqu'à ce que le foie est suffisamment digéré, le tissu du foie devrait apparaître à briser un peu moins de la capsule de Glisson et sentir ramolli lorsque sondé avec le côté émoussé d'un scalpel.
4. Isolement des hépatocytes
- Arrêter la pompe péristaltique et retirer les canules de la pièce de foie.
- Placez le morceau de foie dans un cristallisoir contenant 100-200 ml de solution 5.
- Retirez la capsule de Glisson soigneusement et secouez doucement les cellules. Si il ya des régions qui ne sont pas bien perfusés, un scalpel peut être utilisé pour couper à traversces régions pour libérer les cellules contenues à l'intérieur. Ajouter plus de solutions 5 au besoin pendant le processus.
- Ajouter plus de solution 5 jusqu'à un volume final de 500 ml est atteinte.
- Filtrer la suspension de cellules à deux reprises, d'abord à travers une maille de 210 um de nylon suivi d'un filet de nylon de 70 um. Ensuite, versez la suspension de cellules dans 200 ml tubes de centrifugation.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 72 g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant et le culot de cellules doucement remis en suspension doucement dans 200 ml de Solution 5.
- Répéter le lavage numéro de l'étape 4.6 à trois reprises. Sur l'étape de centrifugation finale, les cellules remettre en suspension dans une solution de stockage à froid (voir la liste des matériaux). Les cellules doivent être d'environ 2,5 millions hépatocytes par millilitre pour l'évaluation du rendement et la viabilité en utilisant un trypan test d'exclusion au bleu en fonction de hématimètre.
- Pour effectuer un test d'exclusion au bleu trypan, ajouter 0,1 ml de cellules diluées de manière appropriée (≈ 2-5 millions / ml) dans un tube de centrifugeuse contenant 0,5 ml de soluti bleu trypanle (0,4% de bleu trypan dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)) et 0,4 ml de PBS. Après avoir mélangé la suspension de cellules à fond, charger un hémocytomètre avec la suspension et examiner au microscope à un grossissement de 100X. En microscopie, les cellules mortes seront colorées en bleu tandis que les cellules vivantes apparaissent sans tache. Compter le nombre de cellules vivantes et totales dans chacun des 1 mm 2 grilles marquées sur la hématimètre. Viabilité (%), le rendement des cellules vivantes (en millions hépatocytes par une solution de stockage à froid ml (CSS) ou million hépatocytes par g de foie) peut être calculé en utilisant les formules ci-dessous.
Remarque: Dans ce cas, le bleu trypan facteur de dilution est de 10 et le facteur de hématimètre est 10000.
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Representative Results
Configuration de perfusion
L'équipement requis pour la perfusion du foie doit être mis en place selon la figure 1.
Viabilité et le rendement des hépatocytes humains isolés
La viabilité moyenne des hépatocytes humains isolés était de 77 ± 10% et le rendement moyen des hépatocytes était de 13 ± 11 millions hépatocytes / g de foie, avec des valeurs exprimées en moyenne ± écart-type. Le nombre d'isolements d'hépatocytes effectué pour obtenir ces moyennes était de 648 isolements effectués à partir de Janvier 1999 to Décembre 2012.
Convient perfusion Paramètres
Afin de réaliser un rinçage avec succès et la perfusion du foie, le nombre de canules utilisé ne doit varier en fonction du poids du foie (figure 2A). En général, les canules 8.4 doit être utilisé pour les foies allant de moins de 20 g à plus de 80 g. Un taux approprié de perfusion, Qui est également dépendant de la masse du foie, devraient être choisis pour une perfusion du foie avec succès (Figures 2B et C). Il a été trouvé que la vitesse de perfusion moyenne de 44 ml / min -1 canule est idéal à travers une gamme de différents poids du foie et par conséquent les vitesses de perfusion doit être ajustée de manière appropriée si plusieurs canules sont utilisés. Si la perfusion est réussie, le foie doit être de couleur pâle et légèrement repulpée.
Pureté des hépatocytes
Au moyen d'immunofluorescence, il a été constaté que des hépatocytes isolés, qui se colorent positivement pour l'albumine, avait une pureté de 94 ± 1% (n = 4 avec 5 répliques de chaque) (figures 3A et B). Figure 3C est une image représentative de contraste de phase montrant les caractéristiques morphologiques des hépatocytes telles que la taille de cellule large et de cellules de forme polygonale.
Figure 1. installation de perfusion. (A) de piège à bulles, (B) morceau de foie de courbe canules d'irrigation avec des conseils oliviers insérés dans les vaisseaux sanguins sur Büchner, (C) en verre à double enveloppe condenseur, (D) bain d'eau (E) appareil d'oxygénation, ( F) de 95% O 2/5% CO 2, du réservoir de gaz et (G) une pompe péristaltique.
Figure 2. (A) Le nombre de canules utilisées, (B) le taux de perfusion (ml / min), ou (C) le taux de perfusion (ml / min. Une significativement différente de la 0-20 g état, P <0,05. ab significativement différente de l'20-40 g, 40-60 g et 60-80 g état, P <0,05.
Figure 3. Des images d'immunofluorescence de cellules isolées positives pour (A) l'albumine (teinté en vert) et le contrôle négatif correspondant (B) (200X de grossissement). Noyaux sont colorés en bleu en utilisant DAPI. L'image de contraste (C) de la phase de cellules isolées (100X de grossissement).
| Solution | Constituant | Concentration finale | |||
| Solution 1 | Chlorure de sodium | 154 mM | |||
| HEPES | 20 mM | ||||
| Le chlorure de potassium | 5,6 mM | ||||
| Glucose | 5 mM | ||||
| de carbonate acide de sodium | 25 mM | ||||
| Solution 2 | Chlorure de sodium | 152,5 mM | |||
| HEPES | 19,8 mM | ||||
| Le chlorure de potassium | 5,5 mM | ||||
| Glucose | 5,0 mM | ||||
| de carbonate acide de sodium | 24,8 mM | ||||
| EGTA | 0,1 mM | ||||
| Pour préparer la solution 2, ajouter 10 ml de 100 mM d'EGTA pour 990 ml de solution 1. | Solution 3 | Chlorure de sodium | 152,5 mM | ||
| HEPES | 19,8 mM | ||||
| Le chlorure de potassium | 5,5 mM | ||||
| Glucose | 5,0 mM | ||||
| de carbonate acide de sodium | 24,8 mM | ||||
| Chlorure de calcium dihydraté | 0,5 uM | ||||
| Pour préparer la solution 3, ajouter 10 ml de 0,5 M de chlorure de calcium dihydrate à 990 ml de solution 1. | |||||
| Solution 4 | Chlorure de sodium | 152,5 mM | |||
| HEPES | 19,8 mM | ||||
| Le chlorure de potassium | 5,5 mM | ||||
| Glucose | 5,0 mM | ||||
| hydr de sodiumogen carbonate | 24,8 mM | ||||
| Chlorure de calcium dihydraté | 0,5 uM | ||||
| Collagénase | Voir le tableau 2 | ||||
| Pour préparer la solution 4, ajouter le montant approprié de la collagénase à la solution 3. | |||||
| Solution 5 | Chlorure de sodium | 120 mM | |||
| HEPES | 10 mM | ||||
| Chlorure de calcium dihydraté | 0,9 mM | ||||
| Le chlorure de potassium | 6.2 mM | ||||
| Albumine | 0,1% p / v | ||||
Tableau 1. Perfusion et solutions d'isolation.
| Taille de la pièce de foie (g) | concentration de collagénase(%) | l'activité de la collagénase (U / ml) |
| <25 | 0,10 | 250 |
| 25 - 40 | 0,11 | 300 |
| 41-80 | 0,13 | 350 |
| > 80 | 0,15 | 400 |
Tableau 2. Les concentrations de collagénase (en%) et des activités (U / ml) à utiliser pour différentes tailles de morceaux de foie (g).
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Discussion
Ce protocole conduit à l'isolement d'hépatocytes humains à forte viabilité et de la pureté. Afin de parvenir à ces résultats, il est important de commencer par une pièce appropriée de foie. Le morceau de foie devrait avoir la capsule de Glisson intact sur toutes les surfaces à l'exception de une surface de coupe. Un autre facteur important est le lot particulier de collagénase utilisée, comme différents lots peuvent entraîner des différences marquées dans les viabilités des hépatocytes après digestion 11. Par conséquent, différents lots de collagénase doivent être testés et le lot qui produit des hépatocytes avec la meilleure viabilité peuvent être obtenus en grande quantité. Enfin, un temps de digestion approprié doit être choisi en fonction du rendement et la viabilité des cellules obtenues. Par exemple, une viabilité élevée avec un faible rendement pourrait indiquer un temps de digestion insuffisante, et un rendement élevé avec une faible viabilité pourrait indiquer que le temps de digestion est trop long.
Cette méthode peut être adaptée to isoler les cellules et les hépatocytes non parenchymateuses du même morceau de foie. Une façon de le faire est d'utiliser le surnageant de la première étape de centrifugation (étape 4.6) directement pour l'isolement de cellules non-parenchymateuse 12. Un deuxième moyen consiste à supprimer l'aliquote nécessaire de la suspension cellulaire après filtration à travers la maille de nylon pour les hépatocytes isolation (étape 4.5) et soumettre la suspension cellulaire restante à une étape de la pronase de digestion supplémentaire avant l'isolement de cellules non parenchymateuses, afin d'augmenter le rendement de les cellules non parenchymateuses 13. Pour un rendement plus élevé de cellules non parenchymateuses, au détriment des hépatocytes, ce procédé peut être modifié par la substitution de la collagénase seule (étape 3.10) pour la pronase et la collagénase et l'utilisation de la suspension de cellules résultante pour l'isolement de cellules non parenchymateuses 14.
En plus de l'isolement des hépatocytes humains, cette méthode présentée peut également être adapté à isoler les hépatocytes à partir de morceaux de foie prélevés from d'autres espèces ayant des tailles comparables ou tailles de vascularisation comparables. Cela peut être important pour les chercheurs qui utilisent des modèles alternatifs, tels que porcins, canine ou des modèles primates.
Isolements d'hépatocytes humains sont généralement effectuées en utilisant des foies de deux sources: foies entiers considérés comme impropres à la transplantation ou tissu hépatique morphologiquement normaux de marges de résection. L'avantage de cette dernière source utilisée dans cette méthode est que les morceaux de foie sont mises à la disposition du laboratoire tôt. Immédiatement après la résection, la résection hépatique est amené à un pathologiste qui élimine ce qui est nécessaire pour le diagnostic. Le pathologiste puis retirer un morceau de foie morphologiquement normal pour l'isolement des hépatocytes de ce qui est prévu pour le jeter. En général, une pièce de foie arrive au laboratoire prêt pour la perfusion dans un temps moyen de 56 ± 29 min (n = 103). En comparaison, les foies entiers qui ne sont pas acceptables pour la transplantation ne seront relassouplies au laboratoire entre 13 ± 2 heures et 16 ± 12 h 15. En outre, en raison de considérations éthiques et la pénurie de foies de donneurs, l'isolement des hépatocytes de foies entiers qui ne répondent pas à tous les critères pour la transplantation est évitée dans la région Eurotransplant. C'est parce que ces foies pourraient encore être utilisées pour des greffes des critères de donateurs prolongées. Certaines études ont montré que la maximisation de l'accès des patients aux résultats de la transplantation de la mortalité de la liste d'attente a diminué et les résultats satisfaisants à des destinataires sélectionnés 16,17. Un autre avantage est que les cellules obtenues à partir de morceaux de résection du foie sont isolées à partir de foie morphologiquement en bonne santé, tandis que les foies inappropriés pour une transplantation peuvent être stéatosique, fibreux ou cirrhotique. En tant que tel, le procédé ici se traduit par un rendement élevé de 13 ± 11 millions par gramme hépatocytes du foie par rapport aux 0,7 ± 0,3 million ou 3 ± 2000000 hépatocytes par gramme de foie obtenus par Baccarani, et al15. Utilisant des foies cirrhotiques ou de stéatose respectivement. Toutefois, les pièces de résection du foie se traduisent par un rendement global inférieur des hépatocytes en tant que la taille de la pièce disponible est généralement de petite taille avec une gamme de 2 à 250 g et une moyenne de 37 ± 29 g (N = 648).
En comparaison avec d'autres groupes, ce protocole permet d'éviter l'utilisation d'adhésifs à base de cyanoacrylate. Alexandre, et al 18. Trouvé que l'utilisation de cyanoacrylate d'éthyle, un adhésif tout usage couramment utilisé, afin de couvrir les surfaces du foie, se traduit par une augmentation du rendement des hépatocytes de 3,5 ± 0,7 à 6,0 ± 1,6 millions d'hépatocytes par gramme coupées foie avec des valeurs exprimées en moyenne ± erreur standard de la moyenne. A titre de comparaison, ce protocole est en mesure d'atteindre un rendement de 13,5 ± 0,4 M par g de foie des hépatocytes (exprimés en moyenne ± erreur type de la moyenne), sans l'utilisation d'adhésifs à base de cyanoacrylate. Bien que les adhésifs à base de cyanoacrylate ont été utilisés pour la fermeture des plaies <sup> 19,20, adhésifs à base de cyanoacrylate de qualité médicale comme l'octyl cyanoacrylate et cyanoacrylate de butyle peut être cher par rapport à cyanoacrylate d'éthyle. Cependant, les dérivés à chaîne courte tels que le cyanoacrylate d'éthyle ont été trouvés pour être plus longues que histotoxiques dérivés à chaîne 21,22.
Cette méthode est plus simple et plus efficace du temps en raison de l'utilisation de canules courbe irrigation avec des conseils d'olive. L'utilisation de canules de taille appropriée se traduira par un ajustement serré qui détient les canules en place sans l'utilisation de colle 18 ou 23 points de suture. Les canules utilisées ont des diamètres allant de 1-2 mm de diamètres de pointe de taille de 1,25 à 4,5 mm. Un assortiment de différentes tailles de la canule doit être mis à la disposition lorsqu'un morceau de foie est prêt à recevoir une canule, de sorte que la canule de taille appropriée pour un vaisseau sanguin particulier peut être choisi comme le montre la vidéo d'accompagnement. Cette méthode utilise aussi plus canules en général (figure2A) par rapport à d'autres études où 2 ou 23 2-4 18 canules sont utilisés. Cela peut aider à atteindre une meilleure perfusion au long du morceau de foie conduisant à une viabilité et le rendement dans une période de digestion plus court.
En conclusion, ce protocole isole les hépatocytes humains, qui sont un modèle important pour étudier le métabolisme cellulaire, la pharmacocinétique et la toxicologie des xénobiotiques, la régénération du foie et de la recherche translationnelle. Une enquête précédente sur 150 médicaments qui causent la toxicité pour l'homme ont montré que la concordance entre la toxicité trouvé dans les études chez l'animal et celle observée dans la pratique clinique est de 70% 24. Ainsi, les hépatocytes humains restent un modèle important pour la validation des recherches effectuées dans des modèles animaux et pour le dépistage des drogues entraîne des effets indésirables avant d'aller à des essais cliniques. En outre, l'utilisation des hépatocytes humains isolés à partir d'échantillons de foie résiduelles ou des hépatocytes isolés à partir d'animaux d'abattoir 25 en tant que modèle esten ligne avec le cadre éthique 3R 26 pour remplacer l'utilisation d'animaux lors de recherche possibles.
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Disclosures
Optimisation de ce protocole a été partiellement financée par une subvention de Hepacult GmbH. Dr. Wolfgang Thasler est l'un des fondateurs de Hepacult GmbH et demeure l'un des membres du conseil d'administration de cette société. L'emploi de Maresa Demmel est partiellement par Hepacult. Maria Hauner est employé par Hepacult GmbH. Hepacult est une société biotechnologique spin-off de l'Université, qui offre des hépatocytes humains avec le consentement et l'accès libre à des fins de recherche.
Acknowledgments
Ce travail a été rendu possible par la Fondation Human Tissue et recherche sur les cellules, ce qui rend les tissus humains disponibles pour la recherche. Le soutien financier pour ce travail a été reçu par le ministère fédéral de l'éducation et de la recherche (nom de subvention: Virtual foie réseau, le numéro de subvention: 0315759) et Hepacult GmbH. Nos remerciements vont également aux assistants techniques de la banque de tissus Hôpital Grosshadern pour la collecte des échantillons de foie et les assistants techniques de la cellule d'isolement de base Facilité pour la réalisation de la perfusion du foie et de l'isolement des hépatocytes. En particulier, nous tenons à remercier Natalja Löwen pour démontrer cette procédure dans la vidéo. Enfin, nous tenons à remercier Natalja Löwen et Edeltraud Hanesch pour créer des illustrations de la Figure 1 et les chiffres dans la vue d'ensemble schématique de la vidéo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bubble trap | Gaßner Glastechnik | ||
| Glass jacketed condenser | Gaßner Glastechnik | ||
| 41 °C Water bath | Julabo | 35723-H24/EG | |
| 37 °C Water bath | GFL | 1083 | |
| Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2) | Linde | ||
| Gas permeable tubing | Neolab | 2-4440 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | IP65 | |
| Scalpel | Feather | 320010 | |
| Forceps | Omnilab | 5171014 | |
| Conical flasks 1 L | Schott Duran | 2121654 | |
| Conical flasks 5 L | Schott Duran | 2121673 | |
| Beakers | Schott Duran | 2110654 | |
| 200 ml centrifuge tubes | Becton Dickinson | 352075 | |
| Crystallizing dish | Omnilab | 5144063 | |
| Curved irrigation cannulae with ball tips | Ernst Kratz GmbH | 1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL | |
| Micro vascular clamps | Ernst Kratz GmbH | ||
| Büchner funnel | Carl Roth | HT38.1 | |
| Nylon mesh 210 μm | Neolab | 4-1413 | |
| Nylon mesh 70 μm | Neolab | 4-1419 | |
| 0.22 μm sterile filters | Peske | 99505 | |
| 500 ml bottles | Schott Duran | 2180144 | |
| 1 L bottles | Schott Duran | 2180154 | |
| Hemocytometer | Peske | 06-0001 | |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 0030 120,086 | |
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Ice bucket | Neolab | 1508454 | |
| Sterile Pasteur pipettes | Brand | 747715 | |
| Motorised pipette filler (Pipette boy acu) | Integra | 155017 | |
| Refridgerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Laminar flow | Kendro | Hera safe-KS9 | |
| Aspirator (Low-flow surgical suction pump) | Atmos | C361 | |
| Laboratory Gas Burner | Integra | Fire Boy eco | |
| Disposable laboratory coat | Paperlynen GmbH | MD0202414 | |
| Surgical mask with visor | Kimberly-Clark | 48247 | |
| Surgical hood | Barrier | 42072 | |
| Latex gloves | Semper Care | CE0321 | |
| Collagenase (Batch number NB 4G) | Serva | 17465 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 2382 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Sodium chloride | Roth | 9265.2 | |
| Hepes | Roth | 9105.3 | |
| Potassium chloride | Serva | 26868 | |
| Albumin | Biomol | 01400-2 | |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Serva | 30180 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Lonza | 17-942E | |
| Cold storage solution | Hepacult GmbH |
References
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Formal Correction: Erratum: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
Posted by JoVE Editors on 07/01/2016.
Citeable Link.
A correction was made to: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
The changes listed below have been made to Table 1.
1). In the recipe for Solution 2, the Final Concentration of EGTA has been changed from:
| EGTA | 0.1mM |
to:
| EGTA | 1mM |
2). In the recipes for Solution 3 and 4, the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate has been changed from:
| Calcium chloride dihydrate | 0.5µM |
to:
| Calcium chloride dihydrate | 5mM |
