L'isolamento di epatociti umani da un Two-step Collagenase perfusione procedura

Summary

A due fasi procedura di perfusione con collagenasi modificata per l'isolamento di epatociti umani è descritta. Questo metodo può essere applicato anche ad altri fegati mammiferi. Gli epatociti isolati sono disponibili in alta resa e redditività, che li rende un modello adatto per la ricerca scientifica in settori quali la rigenerazione epatica, farmacocinetica e tossicologia.

Abstract

Il fegato, un organo con una capacità di rigenerazione eccezionale, svolge un'ampia gamma di funzioni, quali la disintossicazione, il metabolismo e l'omeostasi. Come tale, gli epatociti sono un modello importante per una grande varietà di domande di ricerca. In particolare, l'uso di epatociti umani è particolarmente importante nel campo della farmacocinetica, tossicologia, rigenerazione epatica e ricerca traslazionale. Così, questo metodo presenta una versione modificata di una procedura in due fasi perfusione con collagenasi per isolare epatociti come descritto da Seglen ^1.

In precedenza, gli epatociti sono stati isolati con metodi meccanici. Tuttavia, i metodi enzimatici hanno dimostrato di essere superiore come epatociti mantengono la loro integrità e la funzione strutturale dopo l'isolamento. Questo metodo qui presentato si adatta il metodo precedentemente progettata per fegati di ratto a pezzi di fegato umano ed i risultati in un grande rendimento di epatociti con agibilità di 77 ± 10%. Il principaledifferenza di questa procedura è il processo di cannulization dei vasi sanguigni. Inoltre, il metodo qui descritto può essere applicato anche ad fegati da altre specie con malattie epatiche o vaso sanguigno dimensioni comparabili.

Introduction

Una sospensione di cellule di fegato può essere preparato dal fegato con metodi meccanici o enzimatici. Metodi meccanici utilizzati per preparare le cellule del fegato includono intere costringendo il fegato attraverso una garza ^2, agitando un pezzo di fegato con perle di vetro in uno shaker Kahn ^3, utilizzando omogeneizzatori vetro con pestelli sciolti ^4,5 ecc Nel corso degli anni, metodi meccanici sono caduti fuori favorire causa dei danni alle membrane cellulari e la perdita della funzione degli epatociti isolati ^6,7. Di conseguenza, l'uso di un metodo enzimatico è attualmente il metodo principale per l'isolamento di epatociti.

Isolamento di epatociti utilizzando un metodo enzimatico è stata notevolmente migliorata quando Berry e Friend ⁸ perfusi collagenasi e ialuronidasi attraverso il fegato attraverso la vena porta nei ratti. Questo processo perfusione utilizzato il sistema vascolare per consentire gli enzimi di entrare in stretto contatto con la maggior parte delle cellule, portando adun aumento di 6 volte della resa degli epatociti ^8. Inoltre, questo metodo ha prodotto cellule che mantenevano la loro integrità strutturale, praticamente senza trasformazione del reticolo endoplasmatico in vescicole isolate e nessun danno mitocondriale ^8.

Questo metodo è stato modificato da Seglen ^1, che ha aperto una procedura di perfusione in due fasi per l'isolamento delle cellule epatiche. In questa procedura, il fegato di ratto è perfuso con un Ca ^{2 +} tampone privo seguita da perfusione con collagenasi un tampone contenente Ca ^{2 + 1.} La rimozione di Ca ^{2 +} nel primo passaggio consente di interrompere desmosomi, mentre è necessaria l'aggiunta di Ca ^{2 +} nel secondo passo per un'attività ottimale collagenasi ^1,9.

Dato che il lavoro pubblicato sopra descritto è stato eseguito su ratti, questo articolo si propone di dimostrare una procedura modificata che può essere utilizzato per l'isolamento di epatociti con alta vitalità da Humun fegati. L'uso di epatociti umani rimane importante per la ricerca traslazionale e per validare gli esperimenti su modelli animali. I pezzi di fegato umano utilizzati in questo studio sono stati acquisiti con il consenso della governance attraverso il tessuto umano e Cell Research Foundation, una controllata dallo Stato fondazione non-profit ^10. Dopo un patologo rimosso a quanto necessario per la diagnosi, pezzi di fegato sono stati raccolti dal tessuto rimanente. Il tessuto sezionato fuori dal patologo era morfologicamente il tessuto sano ottenuto da margini di resezione dopo resezione epatica.

Protocol

1. Preparazione di perfusione e di isolamento Solutions

1. Preparare le soluzioni richieste per la perfusione del fegato pezzo e l'isolamento di epatociti secondo la Tabella 1. Le soluzioni possono essere conservati a 4 ° C fino all'utilizzo.
2. Filtro sterile tutte le soluzioni utilizzando un filtro di 0,22 micron.
3. Tutte le soluzioni che vengono a contatto con il fegato devono essere sterili.

2. Preparazione di perfusione apparecchiature e soluzioni

1. L'apparecchiatura per la perfusione del fegato pezzo deve essere montata come mostrato nella Figura 1.
2. Il bagno d'acqua dovrebbe essere impostato ad una temperatura appropriata, che è differente in ogni particolare set-up sperimentale, tale che le soluzioni sono alla temperatura di 37 ° C quando raggiungono il pezzo fegato. In questo caso, il bagno di acqua è impostata a 41 ° C per riscaldare le soluzioni 1, 2 e 3 e il condensatore in vetro con camicia. Soluzione 4 deve essere riscaldato fino a37 ° C in un bagno d'acqua separato da utilizzare per ridurre la perdita di attività collagenasi.
3. Poco prima di perfusione epatica, accendere il regolatore del serbatoio di gas contenente il 95% O _2/5% di CO ₂ a gas l'apparato di ossigenazione (Figura 1E).

3. Perfusione del fegato

1. Un pezzo di fegato con tanto capsula integra di Glisson possibile e idealmente con superficie di 1 solo taglio deve essere ottenuto da un patologo per la perfusione.
2. Posizionare questo pezzo fegato sulla imbuto Büchner contenente un filtro a disco forato (Figura 1B).
3. Il sistema di perfusione deve essere innescato con Soluzione 1.
4. Con una portata bassa, curvo cannule irrigazione con punte oliva deve essere inserito nei vasi sanguigni più grandi sulla superficie di taglio del pezzo fegato. Mentre il sangue vampate dal fegato, il tessuto diventa più chiaro in zone con buona perfusione. Il numero di cannule utilizzati per vari formatidi fegati è mostrato in Figura 2A. La dimensione relativa scelta dovrebbe tradursi in una perfetta aderenza che si terrà il cannule in posizione. I vasi sanguigni più piccoli devono essere lasciati aperti per il buffer di perfusione a fuoriuscire del pezzo fegato.
5. Aumentare la portata della pompa peristaltica a tra 110-460 ml / min a seconda delle dimensioni del fegato (Figura 2B). Ciò si traduce in una portata media di 44 ± 16 ml / min per cannula (Figura 2C). La velocità scelta dipende dal pezzo fegato e dovrebbe comportare una lieve plumping up del pezzo fegato. In alcuni casi, può essere necessario bloccare chiuse alcune delle navi aperte con pinze vascolari Micro per ottenere la leggera volumizzante cui sopra. Una buona perfusione può essere osservata quando il pezzo fegato è un colore più chiaro in tutto.
6. Tenere il pezzo di fegato umido durante la perfusione coprendolo con un pezzo di garza imbevuta di soluzione fisiologica.
7. Profumato con 1 L di soluzione di 1 a stanare ogni remaining sangue nel pezzo fegato.
8. Cambiare il liquido di perfusione alla Soluzione 2 e profumato per 10 min.
9. Passare il liquido di perfusione alla Soluzione 3 e profumato con 0,5 L.
10. Sostituzione del liquido di perfusione alla Soluzione 4, che contiene 0,1-0,15% di collagenasi (Tabella 2).
11. Per questo passaggio, perfusione deve essere effettuata in maniera ricircolo per 9-12 minuti o fino a che il fegato è sufficientemente digerito; tessuto epatico dovrebbe apparire a spezzarsi leggermente sotto la capsula di Glisson grafico ammorbidito quando provata con il lato smussato di un bisturi.

4. Isolamento degli epatociti

1. Spegnere la pompa peristaltica e rimuovere cannule dal pezzo di fegato.
2. Posizionare il pezzo di fegato in un piatto di cristallizzazione contenente 100-200 ml di soluzione 5.
3. Rimuovere la capsula di Glisson con attenzione e scuotere delicatamente le cellule. Se ci sono regioni che non sono ben perfusi, un bisturi può essere usato per tagliarequeste regioni per liberare le cellule contenute all'interno. Aggiungere più Soluzione 5 come necessario durante il processo.
4. Aggiungere più Soluzione 5 fino a raggiungere un volume finale di 500 ml.
5. Filtro sospensione cellulare due volte prima attraverso una maglia di 210 micron nylon seguita da una rete di nylon 70 micron. Successivamente, versare la sospensione di cellule in 200 ml provette da centrifuga.
6. Centrifugare la sospensione cellulare a 72 g per 5 minuti a 4 ° C. Aspirare il surnatante e pellet cellulare delicatamente risospendere delicatamente in 200 ml di soluzione 5.
7. Ripetere il numero fase di lavaggio 4.6 tre volte. Nella fase centrifuga finale, risospendere le cellule in soluzione di storage a freddo (vedi elenco dei materiali). Le cellule dovrebbero essere di circa 2,5 milioni di epatociti per millilitro per la valutazione del rendimento e della redditività con un saggio di esclusione trypan blu a base di emocitometro.
8. Per eseguire un saggio trypan blue exclusion, aggiungere 0,1 ml di cellule opportunamente diluiti (≈ 2,5 milioni / ml) in una provetta da microcentrifuga contenente 0,5 ml di soluzione molto trypan blu(0.4% blu tripano sciolto in tampone fosfato salino (PBS)) e 0,4 ml di PBS. Dopo aver miscelato accuratamente la sospensione cellulare, caricare un emocitometro con la sospensione ed esaminare al microscopio ad ingrandimento 100X. Sotto microscopio, le cellule morte saranno colorate blu, mentre le cellule vive appaiono senza macchia. Contare il numero di cellule vive e totale indicato in ciascuna 1 mm ² griglie marcati sul emocitometro. Redditività (%), resa di cellule vive (milioni di epatociti per soluzione di conservazione a freddo ml (CSS) o milioni di epatociti per g di fegato) può essere calcolato utilizzando le formule seguenti.

Nota: In questo caso, il fattore di diluizione trypan blu è 10 e il fattore emocitometro è 10.000.

Representative Results

Setup perfusione

Il materiale necessario per la perfusione epatica deve essere impostato secondo la figura 1.

La vitalità e rendimento di isolati epatociti umani

La redditività media di isolati epatociti umani è stata del 77 ± 10% e il rendimento medio degli epatociti era di 13 ± 11 milioni di epatociti / g di fegato, con i valori espressi come media ± deviazione standard. Il numero di isolamenti epatociti svolto per ottenere queste medie era di 648 isolamenti effettuati dal gennaio 1999 al dicembre 2012.

Adatto perfusione Parametri

Al fine di effettuare un lavaggio efficace e perfusione del fegato, il numero di cannule utilizzato dovrebbe variare a seconda del peso del (Figura 2A) fegato. In generale, 4-8 cannule deve essere usato per fegati variano da meno del 20 a più di 80 g g. Un tasso adeguato di perfusione, Che dipende anche peso del fegato, dovrebbe essere scelto per una perfusione successo del fegato (Figure 2B e C). Si è trovato che una velocità media perfusione di 44 ml / min ^-1 cannula è ideale in un'ampia gamma di differenti pesi fegato e quindi le velocità di perfusione deve essere regolata in modo appropriato se si utilizzano più cannule. Se la perfusione è riuscita, il fegato dovrebbe essere di colore pallido e un po 'rimpolpata.

Purezza di epatociti

Mediante immunofluorescenza, si è constatato che gli epatociti isolati, che macchia positivamente per l'albumina, aveva una purezza di 94 ± 1% (N = 4 con 5 replicati ciascuno) (Figure 3A e B). Figura 3C è una immagine rappresentante contrasto di fase mostrando le caratteristiche morfologiche degli epatociti come dimensioni grandi cellule e sagomati cellule poligonali.

Figura 1. Installazione di perfusione. (A) trappola per bolle, (B) pezzo di fegato con curvo cannule di irrigazione con punte di ulivo inseriti nei vasi sanguigni in un imbuto Büchner, (C), vetro rivestito condensatore, (D) bagno d'acqua, (E), apparecchi di ossigenazione ( F) 95% O _2/5% di CO ₂ serbatoio gas e (G) pompa peristaltica.

Figura 2. (A) Il numero di cannule utilizzato, (B) tasso di perfusione (ml / min), o (C) tasso di perfusione (ml / ^min. Un significativamente diverso dal 0-20 g condizione, P <0.05. ^ab significativamente diverso dal 20-40 g, 40-60 g e 60-80 g condizione, P <0.05.

Figura 3. Immagini di immunofluorescenza su cellule isolate positive per (A) albumina (colorato in verde) e il corrispondente (B) controllo negativo (200 ingrandimenti). I nuclei sono colorate in blu con DAPI. Contrasto immagine (C) Fase di cellule isolate (ingrandimento 100X).

Soluzione	Costituente	Concentrazione finale
Soluzione 1	Cloruro di sodio	154 mm
	HEPES	20 mm
	Cloruro di potassio	5.6 mM
	Glucosio	5 mM
	Carbonato acido di sodio	25 mm
Soluzione 2	Cloruro di sodio	152.5 mM
	HEPES	19.8 mM
	Cloruro di potassio	5,5 mm
	Glucosio	5,0 mm
	Carbonato acido di sodio	24.8 mM
	EGTA	0,1 mm
Per preparare Soluzione 2, aggiungere 10 ml di EGTA 100 mM a 990 ml di soluzione 1.			Soluzione 3	Cloruro di sodio	152.5 mM
	HEPES	19.8 mM
	Cloruro di potassio	5,5 mm
	Glucosio	5,0 mm
	Carbonato acido di sodio	24.8 mM
	Cloruro di calcio diidrato	0,5 micron
Per preparare Soluzione 3, aggiungere 10 ml di 0,5 M cloruro di calcio diidrato a 990 ml di soluzione 1.
Soluzione 4	Cloruro di sodio	152.5 mM
	HEPES	19.8 mM
	Cloruro di potassio	5,5 mm
	Glucosio	5,0 mm
	Hydr sodioogen carbonato	24.8 mM
	Cloruro di calcio diidrato	0,5 micron
	Collagenase	Vedere la Tabella 2
Per preparare Soluzione 4, aggiungere la quantità appropriata di collagenasi alla Soluzione 3.
Soluzione 5	Cloruro di sodio	120 mm
	HEPES	10 mM
	Cloruro di calcio diidrato	0,9 mm
	Cloruro di potassio	6,2 mm
	Albumina	0,1% w / v

Tabella 1. Perfusione e soluzioni di isolamento.

Dimensioni del brano fegato (g)	Concentrazione Collagenase(%)	Attività collagenasi (U / ml)
<25	0.10	250
25 - 40	0.11	300
41-80	0.13	350
> 80	0.15	400

Tabella 2. Concentrazioni collagenasi (%) e attività (U / ml) da utilizzare per varie dimensioni di pezzi di fegato (g).

Discussion

Questo protocollo comporta l'isolamento di epatociti umani con alta vitalità e purezza. Per conseguire questi risultati, è importante iniziare con un pezzo adatto di fegato. Il pezzo di fegato dovrebbe avere capsula integra di Glisson su tutte le superfici tranne per 1 superficie di taglio. Un altro fattore importante è la particolare lotto di collagenasi utilizzato, come gruppi differenti possono provocare notevoli differenze Viabilità di epatociti dopo digestione ^11. Pertanto, diversi lotti di collagenasi devono essere testati e batch che produce epatociti alla miglior redditività devono essere ottenuti in grandi quantità. Infine, un tempo di digestione adatto deve essere scelto in base alla resa e la vitalità delle cellule ottenute. Ad esempio, una alta vitalità con bassa resa potrebbe indicare un tempo di digestione insufficiente, e una resa elevata con bassa redditività potrebbe indicare che il tempo di digestione è troppo lungo.

Questo metodo può essere adattato to isolare cellule non parenchimali e epatociti dallo stesso pezzo di fegato. Un modo per farlo è usare il surnatante dalla prima fase di centrifugazione (punto 4.6) direttamente per l'isolamento delle cellule non-parenchimali ^12. Un secondo modo è quello di rimuovere l'aliquota richiesta di sospensione cellulare dopo filtrazione attraverso la rete di nylon per l'isolamento degli epatociti (passo 4.5) e sottoporre la sospensione cellulare residua ad un ulteriore passo Pronasi digestione prima isolamento delle cellule non parenchimali, al fine di aumentare la resa di cellule non parenchimali ^13. Per una maggiore resa di cellule non parenchimali a scapito degli epatociti, questo metodo può essere modificato sostituendo solo collagenasi (passo 3.10) per pronasi e collagenasi e utilizzando la sospensione cellulare risultante per l'isolamento delle cellule non parenchimali ^14.

Oltre a isolare epatociti umani, questo metodo presentato può anche essere adattato per isolare epatociti da pezzi di fegato raccolti from altre specie con dimensioni paragonabili o dimensioni vascolare comparabili. Questo può essere importante per i ricercatori che utilizzano modelli alternativi, quali suini, canino o modelli di primati.

Isolamenti di epatociti umani sono generalmente fatto con fegati da due fonti: fegati interi ritenuti non idonei per il trapianto o morfologicamente normale tessuto epatico da margini di resezione. Il vantaggio di quest'ultima fonte utilizzata in questo metodo è che i pezzi di fegato sono resi disponibili al laboratorio prima. Subito dopo la resezione, il fegato resecato è portata ad un patologo che rimuove ciò che è richiesto per la diagnosi. Il patologo quindi rimuovere un pezzo adeguato di fegato morfologicamente normale per l'isolamento degli epatociti da ciò che è previsto per scartare. In generale, un pezzo di fegato arriva in laboratorio pronto per perfusione in un tempo medio di 56 ± 29 min (N = 103). In confronto, fegati interi che non sono adatti per il trapianto saranno solo relfacilitato al laboratorio tra il 13 ± 2 ore e 16 ± 12 ore ^15. Inoltre, a causa di considerazioni etiche e la mancanza di fegati donatori, isolamento di epatociti da fegati interi che non soddisfano tutti i criteri per il trapianto è evitata nella regione Eurotransplant. Questo perché questi fegati potrebbero anche essere utilizzate per trapianto con criteri donatori estesi. Alcuni studi hanno dimostrato che massimizzare l'accesso dei pazienti ai risultati trapianti nella diminuzione della mortalità in lista d'attesa e dei risultati soddisfacenti ai destinatari selezionati ^16,17. Un altro vantaggio è che le cellule ottenute da pezzi resezione epatica sono isolati da fegato morfologicamente sano, mentre fegati inadatti per trapianto possono essere steatosico, fibrotica o cirrosi. Come tale, il metodo qui traduce in un elevato rendimento di 13 ± 11 milioni di epatociti per grammo fegato rispetto ai 0,7 ± 0,3 milioni o 3 ± 2 milioni per grammo fegato epatociti ottenuti per Baccarani, et al^15. Utilizzando fegati cirrotici o steatosico rispettivamente. Tuttavia, pezzi resezione epatica determinano una resa totale inferiore epatociti come la dimensione del pezzo disponibile è generalmente piccolo con una gamma 2-250 g ed una media di 37 ± 29 g (N = 648).

In confronto ad altri gruppi, questo protocollo evita l'uso di adesivi cianoacrilati. Alexandre, et al ^18. Hanno trovato che l'uso di cianoacrilato etilico, un comunemente usato adesivo per tutti gli usi, per coprire le superfici di taglio del fegato, provoca un aumento della resa di epatociti di 3,5 ± 0,7-6,0 ± 1,6 milioni di epatociti per grammo fegato con valori espressi in mezzi ± errore standard della media. In confronto, questo protocollo è in grado di raggiungere una resa di 13,5 ± 0,4 milioni epatociti per g di fegato (espressi in media ± errore standard della media) senza l'uso di adesivi cianoacrilati. Mentre adesivi cianoacrilati sono stati utilizzati per la chiusura della ferita <sup> 19,20, adesivi di grado medico cianoacrilati come ottile cianoacrilato e butile cianoacrilato può essere costoso rispetto ad etilcianoacrilato. Tuttavia, i derivati ​​a catena corta come etilcianoacrilato sono stati trovati per essere più histotoxic dai derivati ​​catena più lunga ^21,22.

Questo metodo è più semplice e più tempo efficiente a causa dell'uso di irrigazione curvo cannule con punte oliva. L'uso di cannule di dimensioni adeguate si tradurrà in una misura stretta che tiene il cannule in posizione senza l'uso di colla ¹⁸ o suture ^23. Il cannule utilizzati hanno diametri 1-2 mm di diametro con punta di dimensioni 1,25-4,5 mm. Un assortimento di varie dimensioni cannula deve essere reso disponibile quando un pezzo fegato è pronto per incannulazione, in modo che la cannula di dimensioni appropriate per un determinato vaso sanguigno può essere scelto come mostrato nel video allegato. Questo metodo utilizza anche più cannule in generale (Figura2A) rispetto ad altri studi in cui vengono utilizzati 2 o ²³ 2-4 ¹⁸ cannule. Questo può aiutare a raggiungere una migliore perfusione tutto il pezzo di fegato che porta alta la redditività e la resa in un periodo di digestione breve.

In conclusione, questo protocollo isola epatociti umani, che sono un importante modello per lo studio del metabolismo cellulare, farmacocinetica e tossicologia di xenobiotici, rigenerazione epatica e ricerca traslazionale. Una precedente indagine su 150 farmaci che causano tossicità umana ha dimostrato che la concordanza tra la tossicità trovato in studi su animali e quella osservata nella pratica clinica è del 70% ^24. Così, epatociti umani rimangono un importante modello per la convalida ricerche effettuate in modelli animali e per la prova della droga porta a reazioni avverse prima di andare a sperimentazioni cliniche. Inoltre, l'uso di epatociti umani isolati da campioni di fegato remnant o epatociti isolati da animali macelli ²⁵ come modello èin linea con il quadro etico 3R ²⁶ per sostituire l'uso di animali, quando possibili di ricerca.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bubble trap	Gaßner Glastechnik
Glass jacketed condenser	Gaßner Glastechnik
41 °C Water bath	Julabo	35723-H24/EG
37 °C Water bath	GFL	1083
Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2)	Linde
Gas permeable tubing	Neolab	2-4440
Peristaltic pump	Ismatec	IP65
Scalpel	Feather	320010
Forceps	Omnilab	5171014
Conical flasks 1 L	Schott Duran	2121654
Conical flasks 5 L	Schott Duran	2121673
Beakers	Schott Duran	2110654
200 ml centrifuge tubes	Becton Dickinson	352075
Crystallizing dish	Omnilab	5144063
Curved irrigation cannulae with ball tips	Ernst Kratz GmbH	1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL
Micro vascular clamps	Ernst Kratz GmbH
Büchner funnel	Carl Roth	HT38.1
Nylon mesh 210 μm	Neolab	4-1413
Nylon mesh 70 μm	Neolab	4-1419
0.22 μm sterile filters	Peske	99505
500 ml bottles	Schott Duran	2180144
1 L bottles	Schott Duran	2180154
Hemocytometer	Peske	06-0001
1.5 ml tubes	Eppendorf	0030 120,086
50 ml conical tubes	BD Biosciences	352070
Ice bucket	Neolab	1508454
Sterile Pasteur pipettes	Brand	747715
Motorised pipette filler (Pipette boy acu)	Integra	155017
Refridgerated centrifuge	Eppendorf	5810R
Laminar flow	Kendro	Hera safe-KS9
Aspirator (Low-flow surgical suction pump)	Atmos	C361
Laboratory Gas Burner	Integra	Fire Boy eco
Disposable laboratory coat	Paperlynen GmbH	MD0202414
Surgical mask with visor	Kimberly-Clark	48247
Surgical hood	Barrier	42072
Latex gloves	Semper Care	CE0321
Collagenase (Batch number NB 4G)	Serva	17465
Calcium chloride dihydrate	Merck	2382
EGTA	Sigma	E4378
Sodium chloride	Roth	9265.2
Hepes	Roth	9105.3
Potassium chloride	Serva	26868
Albumin	Biomol	01400-2
Glucose	Serva	22700
Sodium hydrogen carbonate	Serva	30180
0.4% Trypan blue solution	Lonza	17-942E
Cold storage solution	Hepacult GmbH