Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Isolering av humana hepatocyter med två steg kollagenas perfusion

Published: September 3, 2013 doi: 10.3791/50615

ERRATUM NOTICE

Summary

En modifierad två steg kollagenas perfusion procedur för isolering av humana hepatocyter beskrivs. Denna metod kan också tillämpas på andra däggdjurs levrar. De isolerade hepatocyter finns med högt utbyte och lönsamhet, vilket gör dem en lämplig modell för vetenskaplig forskning inom områden som lever förnyelse, farmakokinetik och toxikologi.

Abstract

Levern, ett organ med en exceptionell förmåga till återväxt, utför en mängd olika funktioner, såsom avgiftning, metabolism och homeostas. Som sådana hepatocyter är en viktig modell för en stor mängd olika frågeställningar. I synnerhet är särskilt viktigt när det gäller farmakokinetik, toxikologi, lever förnyelse och translationell forskning användning av humana hepatocyter. Således presenterar denna metod en modifierad version av en tvåstegs kollagenasperfusion förfarande för isolering av hepatocyter, såsom beskrivs av Seglen 1.

Tidigare har hepatocyter isolerats med mekaniska metoder. Emellertid har enzymatiska metoder visat sig vara överlägsen som hepatocyter bibehåller sin strukturella integritet och funktion efter isolering. Metoden presenteras här anpassar metod utformad tidigare för råttlevrar till humana leverbitar och resulterar i ett stort utbyte av leverceller med en bärkraft på 77 ± 10%. Den huvudsakligaskillnaden i detta förfarande är en process för cannulization av blodkärlen. Vidare kan den här beskrivna metoden även tillämpas på levrarna från andra arter med jämförbara lever-eller kärlstorlekar.

Introduction

En levercellsuspension kan framställas från levern genom mekaniska eller enzymatiska metoder. Mekaniska metoder som används för att framställa hela leverceller inkluderar tvinga levern genom cheesecloth 2, skakar en lever stycke med glaspärlor i en Kahn skakapparat 3, med användning av glas-homogenisatorer med lösa pestles 4,5 etc. Under årens lopp har mekaniska metoder fallit ur gynna grund av skador på cellmembran och förlust av funktionen hos de isolerade hepatocyter 6,7. Följaktligen är användningen av en enzymatisk metod som för närvarande den huvudsakliga metoden för isolering av hepatocyter.

Isolering av hepatocyter med hjälp av en enzymatisk metod förbättrades avsevärt när Berry och Friend 8 perfusion kollagenas och hyaluronidas genom levern via portalen ven hos råttor. Denna perfusion process utnyttjas vaskulaturen för att tillåta enzymerna att komma i nära kontakt med huvuddelen av cellerna, vilket leder tillen 6-faldig ökning i utbyte av hepatocyter 8. Vidare gav denna metod celler som behållit sin strukturella integritet, med praktiskt taget ingen omvandling av endoplasmatiska nätverket i isolerade blåsor och inga mitokondriell skada 8.

Denna metod modifierades av Seglen 1, som banat väg för en två-steg perfusion förfarande för levercellisolering. Vid detta förfarande är det råttlever perfunderad med en Ca2 +-fri buffert följt av perfusion med en kollagenasbuffert innehållande Ca 2 + 1. Avlägsnandet av Ca 2 + i ett första steg hjälper till att störa desmosomer, medan tillsatsen av Ca 2 + i det andra steget erfordras för optimal genasaktivitet 1,9.

Med tanke på att det publicerade arbetet som beskrivs ovan har utförts på råtta, denna artikel syftar till att visa en modifierad procedur som kan användas för isolering av hepatocyter med hög lönsamhet från humen levrar. Användning av humana hepatocyter fortfarande viktigt för translationell forskning och för att validera försök med djurmodeller. De humana leverbitar som används i denna studie har förvärvats med samtycke för styrning via mänskliga vävnader och celler Research Foundation, en statskontrollerad ideell stiftelse 10. Efter en patolog bort vad som krävs för diagnos, var leverbitar som samlats in från den kvarvarande vävnad. Vävnaden sektioneras av patologen var morfologiskt frisk vävnad erhålls från resektion marginaler efter leverresektionskirurgi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av perfusion och Isolation Solutions

  1. Bered lösningar krävs för perfusion av levern stycket och isolering av hepatocyter i enlighet med tabell 1. Lösningar kan förvaras vid 4 ° C fram till användning.
  2. Sterilfiltrera alla lösningar med användning av ett 0,22 ^ m filter.
  3. Alla lösningar som kommer i kontakt med levern bör vara sterila.

2. Beredning av Perfusion utrustning och lösningar

  1. Utrustning för perfusion av levern stycket bör inrättas som visas i figur 1.
  2. Vattenbadet skall ställas in vid en lämplig temperatur, som är olika i varje särskild försöksuppställningen, så att de lösningar som är vid en temperatur av 37 ° C när de når levern stycket. I detta fall är den vattenbad vid 41 ° C för att värma Lösningar 1, 2 och 3 och det mantlade glas kondensor. Lösning 4 bör värmas upp till37 ° C i ett separat vattenbad för användning för att minska förlusten av kollagenas-aktivitet.
  3. Strax före leverperfusion, slå på regulatorn av gasen tank innehållande 95% O2 / 5% CO2 till gas syrsättningsapparaten (figur 1E).

3. Perfusion av levern

  1. En leverstycke med så mycket intakt Glisson kapsel som möjligt och helst med bara 1 snittyta bör erhållas från en patolog för perfusion.
  2. Placera denna lever bit på Biichner-tratt, som innehåller en perforerad filterskivan (Figur 1B).
  3. Perfusionssystemet primas med Lösning 1.
  4. Med ett lågt flöde, bör böjd bevattning kanyler med oliv tips sättas in i de större blodkärlen i snittytan i levern stycket. Som blod spolar ut från levern, blir vävnaden tändaren i områden med god perfusion. Antalet kanyler används för olika storlekari lever visas i fig. 2A. Mätaren storlek väljs bör resultera i en perfekt passform som håller kanylerna på plats. De mindre blodkärl bör lämnas öppen för perfusionsbuffert rinna ut ur leverstycket.
  5. Ökning av flödeshastigheten på den peristaltiska pumpen till mellan 110 till 460 ml / min beroende på storleken av levern (Figur 2B). Detta resulterar i en genomsnittlig flödeshastighet av 44 ± 16 ml / min per kanyl (figur 2C). Den valda hastigheten beror på levern bit och bör resultera i en lätt fyllighet upp av levern stycket. I vissa fall kan det vara nödvändigt att spänna fast stänga några av de öppna kärl med mikrokärlklämmor för att åstadkomma den obetydliga plumping nämnts ovan. En bra perfusion kan observeras när levern pjäs är en ljusare färg hela.
  6. Håll levern bit fuktigt under perfusion genom att täcka den med en bit gasbinda indränkt i saltlösning.
  7. BEGJUTA med 1 L av Lösning 1 för att spola ut alla remaining blod i levern stycket.
  8. Ändra perfusionsfluidumet till Lösning 2 och perfundera under 10 min.
  9. Slå perfusionsfluidumet till lösning 3 och BEGJUTA med 0,5 L.
  10. Ändra perfusionsfluidumet till Lösning 4, som innehåller från 0,1 till 0,15% av kollagenas (tabell 2).
  11. För detta steg bör perfusion utföras i ett återcirkulerande sätt under 9-12 min eller tills levern är tillräckligt digere; levervävnad skulle tyckas bryta isär något under Glisson kapsel och känna mjukas när sonderades med den trubbiga sidan av en skalpell.

4. Isolering av hepatocyter

  1. Stäng av den peristaltiska pumpen och ta bort kanyler från levern stycket.
  2. Placera leverstycket i en kristallisationsskål innehållande 100-200 ml lösning 5.
  3. Avlägsna Glisson kapsel noggrant och försiktigt skaka ut cellerna. Om det finns områden som inte är väl perfusion, kan en skalpell användas för att skära igenomdessa regioner för att frigöra celler som finns inom. Lägg mer Lösning 5 som behövs under processen.
  4. Lägg mer Lösning 5 tills en slutlig volym på 500 ml uppnås.
  5. Filter cellsuspensionen två gånger, först genom en 210 ìm nylonnät följt av en 70 ìm nylonnät. Därefter häll cellsuspension i 200 ml centrifugrör.
  6. Centrifugera cellsuspensionen vid 72 g under 5 min vid 4 ° C. Aspirera supernatanten och försiktigt resuspendera cellpelleten försiktigt i 200 ml lösning 5.
  7. Upprepa tvättsteget nummer 4.6 tre gånger. På den sista centrifugsteget, resuspendera celler i förvaringslösningen (se lista på material). Celler bör vara cirka 2-5 Mkr hepatocyter per milliliter för bedömning av avkastning och lönsamhet med hjälp av en hemocytometer baserad trypanblåttuteslutning analys.
  8. För att utföra en exklusion med trypanblått, tillsätt 0,1 ml av på lämpligt sätt utspädda celler (≈ 2-5000000 / ml) till ett mikrofugrör med 0,5 ml trypanblått solutipå (0,4% trypanblått löstes i fosfatbuffrad saltlösning (PBS)) och 0,4 ml PBS. Efter blandning cellsuspensionen ordentligt, ladda en hemocytometer med fjädring och undersöka i mikroskop vid 100 gångers förstoring. Under mikroskop, kommer de döda cellerna färgas blått medan de levande celler verkar ofärgade. Räkna antalet levande och totala celler i var och en av de 1 mm 2 galler markerade på hemocytometer. Viabilitet (%), utbyte av levande celler (miljoner hepatocyter per ml förvaringslösningen (CSS) eller miljoner hepatocyter per g lever) kan beräknas med nedanstående formler.

Ekvation 1
Anmärkning: I detta fall är den trypanblått utspädningsfaktor 10 och hemocytometer faktor är 10000.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Perfusion Setup

Den utrustning som krävs för leverperfusion bör inrättas enligt figur 1.

Lönsamhet och avkastning av isolerat humana hepatocyter

Den genomsnittliga lönsamheten för isolerade humana hepatocyter var 77 ± 10% och den genomsnittliga avkastningen av hepatocyter var 13 ± 11 miljoner hepatocyter / g lever, med värden som uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse. Antalet hepatocyte isoleringar utförs för att erhålla dessa genomsnitt var 648 isoleringar utförts från januari 1999 till december 2012.

Lämplig Perfusion Parametrar

För att kunna genomföra en lyckad spolning och perfusion av levern, bör antalet kanyler som används varierar beroende på vikten av levern (Figur 2A). I allmänhet bör 4-8 kanyler användas för levrar som sträcker sig från under 20 g till mer än 80 gram. En lämplig hastighet av perfusion, Som också är beroende av levervikt, bör väljas för en lyckad perfusion av levern (fig. 2B och C). Det har visat sig att en genomsnittlig perfusion hastighet på 44 ml / min kanyl -1 är idealisk för en rad olika levervikt och därför perfusion hastigheter bör justeras på lämpligt sätt om fler kanyler används. Om perfusionen är framgångsrik bör levern vara blek i färgen och något plumped upp.

Renhet av Hepatocyter

Medelst immunofluorescens visade det sig att isolerade hepatocyter, vilken fläck positivt för albumin, hade en renhet av 94 ± 1% (N = 4 med 5 replikat vardera) (fig. 3A och B). Figur 3C är en representativ faskontrastbilden visar de morfologiska egenskaper hepatocyter såsom stor cellstorlek och polygonala formade-celler.


Figur 1. Perfusion inställning. (A) bubbelfälla, (B) leverstycke med böjda bevattning kanyler med oliv tips insatta i blodkärl på en Buchner-tratt, (C) glas mantlat kondensor, (D) vattenbad, (E) syresättning apparat, ( F) 95% O2 / 5% CO2 gas tank och (G) peristaltisk pump.

Figur 2
Figur 2. (A) Antalet kanyler användas, (B) perfusion hastighet (ml / min), eller (C) perfusion hastighet (ml / min. En signifikant skiljer sig från den 0-20 g skick, P <0,05. ab Signifikant skild från 20-40 g, 40-60 g och 60-80 g skick, P <0,05.

Figur 3
Figur 3. Immunofluorescerande bilder av isolerade celler positiva för (A) albumin (målat i grönt) och motsvarande (B) negativ kontroll (200 gångers förstoring). Kärnor färgas i blått med hjälp DAPI. (C) Faskontrast bild av isolerade celler (100 gångers förstoring).

Lösning Konstituerande Slutlig koncentration
Lösning 1 Natriumklorid 154 mM
HEPES 20 mM
Kaliumklorid 5.6 mM
Glukos 5 mM
Natriumvätekarbonat 25 mM
Lösning 2 Natriumklorid 152,5 mM
HEPES 19,8 mM
Kaliumklorid 5,5 mM
Glukos 5,0 mM
Natriumvätekarbonat 24,8 mM
EGTA 0,1 mM
För att förbereda Lösning 2, tillsätt 10 ml 100 mM EGTA till 990 ml av lösning 1. Lösning 3 Natriumklorid 152,5 mM
HEPES 19,8 mM
Kaliumklorid 5,5 mM
Glukos 5,0 mM
Natriumvätekarbonat 24,8 mM
Kalciumkloriddihydrat 0,5 pM
För att förbereda Lösning 3, tillsätt 10 ml 0,5 M kalciumkloriddihydrat till 990 ml av lösning 1.
Lösning 4 Natriumklorid 152,5 mM
HEPES 19,8 mM
Kaliumklorid 5,5 mM
Glukos 5,0 mM
Natrium hydrogen karbonat 24,8 mM
Kalciumkloriddihydrat 0,5 pM
Kollagenas Se Tabell 2
För framställning av lösning 4, tillsätt lämplig mängd kollagenas till Lösning 3.
Lösning 5 Natriumklorid 120 mM
HEPES 10 mM
Kalciumkloriddihydrat 0.9 mM
Kaliumklorid 6,2 mM
Albumin 0,1% vikt / vol

Tabell 1. Perfusion och isoleringslösningar.

Storlek av leverstycket (g) Kollagenas koncentration(%) Kollagenas-aktivitet (U / ml)
<25 0,10 250
25 - 40 0,11 300
41-80 0,13 350
> 80 0,15 400

Tabell 2. Kollagenas-koncentrationer (%) och aktiviteter (U / ml) som ska användas för olika storlekar av leverstyckena (G).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll resulterar i isolering av humana hepatocyter med hög livsduglighet och renhet. För att uppnå dessa resultat, är det viktigt att börja med en lämplig bit av levern. Den bit av levern bör ha intakt Glisson kapsel på alla ytor utom 1 snittyta. En annan viktig faktor är den speciella sats av kollagenas som används, eftersom olika satser kan resultera i markanta skillnader i viabilitet av hepatocyter efter digestion 11. Därför bör olika partier av kollagenas testas och det parti som producerar hepatocyter med den bästa lönsamheten bör erhållas i stora mängder. Slutligen har en lämplig matsmältning tid väljas baserat på avkastningen och livskraften hos cellerna som erhållits. Exempelvis skulle en hög viabilitet med lågt utbyte indikerar en otillräcklig matsmältning tid, och ett högt utbyte med låg viabilitet skulle kunna tyda på att uppslutningstiden är för lång.

Denna metod kan anpassas to isolera icke-parenkymceller och hepatocyter från samma leverstycke. Ett sätt att göra detta är att använda den överstående vätskan från det första centrifugeringssteget (steg 4,6) direkt för icke-parenkymala cellisolering 12. Ett annat sätt är att ta bort det som krävs alikvot av cellsuspension efter filtrering genom nylonnät för hepatocyte isolering (steg 4,5) och utsätta den återstående cellsuspension till ett extra pronase matsmältningen steg före icke-parenkymala cellisolering för att öka utbytet av icke-parenkymceller 13. För ett högre utbyte av icke-parenkymceller på bekostnad av hepatocyter, kan denna metod modifieras genom att ersätta kollagenas ensamt (steg 3.10) för pronase och kollagenas och använda den resulterande cellsuspension för icke-parenkymala cellisolering 14.

Förutom att isolera humana hepatocyter, kan denna metod presenteras också anpassas för att isolera leverceller från leverbitar som samlats tillbakam andra arter med jämförbara storlekar eller jämförbara kärlstorlekar. Detta kan vara viktigt för forskare som använder alternativa modeller, exempelvis svin, hund eller primatmodeller.

Isola av humana hepatocyter är generellt sett gjort genom att använda levrar från två källor: hela levrar anses vara olämpliga för transplantation eller morfologiskt normal levervävnad från resektion marginaler. Fördelen med den senare källan som används i denna metod är att de små leverstycken görs tillgängligt i laboratoriet tidigare. Omedelbart efter resektion är opererande levern bringas till en patolog som avlägsnar det som krävs för diagnos. Patologen kommer då att ta bort en lämplig bit av morfologiskt normal lever för hepatocyte isolering från det som är planerat till kassering. I allmänhet anländer en leverstycket i laboratoriet redo för perfusion i en genomsnittlig tid på 56 ± 29 min (N = 103). I jämförelse kommer hela levrar som inte är lämpliga för transplantation endast rellättade till laboratoriet mellan 13 ± 2 timmar och 16 ± 12 timmar 15. Dessutom, på grund av etiska överväganden och brist på donerade levrar, är isolering av hepatocyter från hela levrar som inte uppfyller alla kriterier för transplantation undvikas i Eurotransplant regionen. Detta beror på att dessa levrar fortfarande kunde användas för transplantation med förlängda donor kriterier. Vissa studier har visat att maximera patientens tillgång till transplantationsresulterar i minskad väntelistan dödlighet och tillfredsställande resultat till utvalda mottagare 16,17. En annan fördel är att de celler som erhålls från leverresektion bitar är isolerade från morfologiskt frisk lever, medan levrar är olämpliga för transplantation kan vara steatotic, fibrotisk eller cirros. Som sådan, där metoden här resulterar i ett högt utbyte av 13 ± 11 miljoner hepatocyter per gram lever jämfört med 0,7 ± 0,3 miljoner eller 3 ± 2000000 hepatocyter per gram lever erhållna genom Baccarani et al. 15 med hjälp cirrotiska eller steatotic levrar respektive. Emellertid leverresektion bitar resultera i ett lägre totalt utbyte av hepatocyter som storleken på den bit som finns i allmänhet är liten med ett intervall från 2 till 250 g, och ett genomsnitt av 37 ± 29 g (N = 648).

I jämförelse med andra grupper, undviker detta protokoll för användning av cyanoakrylatlim. Alexandre, et al. 18 funnit att användningen av etylcyanoakrylat, ett vanligt allrengöringsmedel lim, för att täcka de skurna ytorna på levern, resulterar i ett ökat utbyte av hepatocyter från 3,5 ± 0,7 till 6,0 ± 1,6 miljoner hepatocyter per gram levern med värden som uttrycks i medel ± medelvärdets medelfel. I jämförelse är detta protokoll kan uppnå en avkastning på 13,5 ± 0,4 milj hepatocyter per g lever (uttryckt i medel ± standardfel av medelvärdet) utan användning av cyanoakrylatlim. Medan cyanoakrylatlim har använts för tillslutning av sår <sup> 19,20, medicinsk kvalitet cyanoakrylatlim såsom oktyl cyanoakrylat och butylcyanoakrylat kan vara dyra jämfört med etylcyanoakrylat. Emellertid har kortare kedja derivat såsom etylcyanoakrylat befunnits vara mer histotoxic än långkedjiga derivat 21,22.

Denna metod är enklare och mer tidseffektivt på grund av användningen av krökta bevattning kanyler med oliv tips. Användningen av kanylerna i en lämplig storlek kommer att resultera i en tät passning som håller kanyler på plats utan användning av lim 18 eller suturer 23. Den kanyler som används har diametrar från 1-2 mm med spetsdiametrar dimensionerade 1,25-4,5 mm. Ett sortiment av olika kanylstorlekar bör ställas till förfogande när en lever pjäs är klar för kanylering, så att kan väljas av lämplig storlek kanyl för en viss blodkärl som visas i den medföljande videon. Denna metod använder också mer kanyler i allmänhet (figur2A) jämfört med andra studier där två 23 eller 2-4 18 kanyler används. Detta kan bidra till en bättre genomblödning i hela levern stycket som leder till hög lönsamhet och avkastning på kortare matsmältning period.

Sammanfattningsvis, isolerar detta protokoll humana hepatocyter, som är en viktig modell för att studera cellulär metabolism, farmakokinetik och toxikologi av xenobiotika, lever förnyelse och translationell forskning. En tidigare undersökning på 150 läkemedel som orsakar humantoxicitet visade att överensstämmelse mellan toxicitet som finns i djurstudier och som observerats i klinisk praxis är 70% 24. Således humana hepatocyter förbli en viktig modell för validering forskningen i djurmodeller samt för att testa läkemedel leder till biverkningar innan du går till kliniska prövningar. Vidare användning av humana hepatocyter isolerade från kvarleva leverprover eller hepatocyter isolerade från slakteri djur 25 som modell äri linje med den 3R etiska ramverket 26 för att ersätta användningen av försöksdjur när möjligt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Optimering av detta protokoll delvis finansieras av ett bidrag från Hepacult GmbH. Dr Wolfgang Thasler är en av grundarna av Hepacult GmbH och förblir en av ledamöterna i styrelsen i detta bolag. Anställning av Maresa Demmel är delvis av Hepacult. Maria Hauner är anställd av Hepacult GmbH. Hepacult är en spin-off biotekniska företag från universitetet, som erbjuder humana hepatocyter med samtycke och öppen tillgång till forskningsändamål.

Acknowledgments

Detta arbete har gjorts möjlig genom den mänskliga vävnader och celler Research Foundation, som gör mänskliga vävnader tillgängliga för forskning. Ekonomiskt stöd till detta arbete kom från förbundsministeriet för utbildning och forskning (bidrag namn: Virtual Lever Network, licensnummer: 0.315.759) och Hepacult GmbH. Vårt tack går också till de tekniska experter från Grosshadern Sjukhusvävnadsbank för insamling av leverprover och de tekniska konsulter från Cell Isolation Core Facility för att utföra levern perfusion och hepatocyte isolering. Framför allt vill vi tacka Natalja Löwen för att demonstrera detta förfarande i videon. Slutligen vill vi tacka Natalja Löwen och Edeltraud Hanesch för att skapa illustrationer till figur 1 och figurerna i den schematiska översikten i videon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bubble trap Gaßner Glastechnik  
Glass jacketed condenser Gaßner Glastechnik  
41 °C Water bath Julabo 35723-H24/EG  
37 °C Water bath GFL 1083  
Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2) Linde  
Gas permeable tubing Neolab 2-4440  
Peristaltic pump Ismatec IP65  
Scalpel Feather 320010  
Forceps Omnilab 5171014  
Conical flasks 1 L Schott Duran 2121654  
Conical flasks 5 L Schott Duran 2121673  
Beakers Schott Duran 2110654  
200 ml centrifuge tubes Becton Dickinson 352075  
Crystallizing dish Omnilab 5144063  
Curved irrigation cannulae with ball tips Ernst Kratz GmbH 1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL  
Micro vascular clamps Ernst Kratz GmbH  
Büchner funnel Carl Roth HT38.1  
Nylon mesh 210 μm Neolab 4-1413  
Nylon mesh 70 μm Neolab 4-1419  
0.22 μm sterile filters Peske 99505  
500 ml bottles Schott Duran 2180144  
1 L bottles Schott Duran 2180154  
Hemocytometer Peske 06-0001  
1.5 ml tubes Eppendorf 0030 120,086  
50 ml conical tubes BD Biosciences 352070  
Ice bucket Neolab 1508454  
Sterile Pasteur pipettes Brand 747715  
Motorised pipette filler (Pipette boy acu) Integra 155017  
Refridgerated centrifuge Eppendorf 5810R  
Laminar flow Kendro Hera safe-KS9  
Aspirator (Low-flow surgical suction pump) Atmos C361  
Laboratory Gas Burner Integra Fire Boy eco  
Disposable laboratory coat Paperlynen GmbH MD0202414  
Surgical mask with visor Kimberly-Clark 48247  
Surgical hood Barrier 42072  
Latex gloves Semper Care CE0321  
Collagenase (Batch number NB 4G) Serva 17465  
Calcium chloride dihydrate Merck 2382  
EGTA Sigma E4378  
Sodium chloride Roth 9265.2  
Hepes Roth 9105.3  
Potassium chloride Serva 26868  
Albumin Biomol 01400-2  
Glucose Serva 22700  
Sodium hydrogen carbonate Serva 30180  
0.4% Trypan blue solution Lonza 17-942E  
Cold storage solution Hepacult GmbH  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
  2. Schneider, W. C., Potter, V. R. The assay of animal tissues for respiratory enzymes II. Succinic dehydrogenase and cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 149, 217-227 (1943).
  3. Aubin, P. M. G., Bucher, N. L. R. A Study of Binucleate Cell Counts in Resting and Regenerating Rat Liver Employing a Mechanical Method for the Separation of Liver Cells. Anat. Rec. 112, 797-809 (1952).
  4. Anderson, N. G. The Mass Isolation of Whole Cells from Rat Liver. Science. 117, 627-628 (1953).
  5. Jacob, S. T., Bhargava, P. M. New Method for Preparation of Liver Cell Suspensions. Experimental Cell Research. 27 (62), 453-467 (1962).
  6. Berry, M. N. Metabolic Properties of Cells Isolated from Adult Mouse Liver. Journal of Cell Biology. 15, 1-8 (1962).
  7. Laws, J. O., Stickland, L. H. Metabolism of Isolated Liver Cells. Nature. 178, 309-310 (1038).
  8. Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. The Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).
  9. Seglen, P. O. Preparation of Rat-Liver Cells .3. Enzymatic Requirements for Tissue Dispersion. Experimental Cell Research. 82 (73), 391-398 (1973).
  10. Thasler, W. E., et al. Charitable State-Controlled Foundation Human Tissue and Cell Research: Ethic and Legal Aspects in the Supply of Surgically Removed Human Tissue For Research in the Academic and Commercial Sector in Germany. Cell and Tissue Banking. 4, 49-56 (2003).
  11. Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver. Analytical Biochemistry. 138, 235-237 (1984).
  12. Smedsrod, B., Pertoft, H. Preparation of Pure Hepatocytes and Reticuloendothelial Cells in High-Yield from a Single-Rat Liver by Means of Percoll Centrifugation and Selective Adherence. J. Leukocyte Biol. 38, 213-230 (1985).
  13. Cantrell, E., Bresnick, E. Benzpyrene Hydroxylase-Activity in Isolated Parenchymal and Nonparenchymal Cells of Rat-Liver. Journal of Cell Biology. 52, 316-321 (1972).
  14. Weiskirchen, R., Gressner, A. M. Isolation and culture of hepatic stellate cells. Methods in Molecular Medicine. 117, 99-113 (2005).
  15. Baccarani, U., et al. Steatotic versus cirrhotic livers as a source for human hepatocyte isolation. Transplant P. 33, 664-665 (2001).
  16. Renz, J. F., et al. Utilization of extended donor criteria liver allografts maximizes donor use and patient access to liver transplantation. Annals of Surgery. 242, 556-563 (2005).
  17. Schemmer, P., et al. Extended donor criteria have no negative impact on early outcome after liver transplantation: a single-center multivariate analysis. Transplant Proc. 39, 529-534 (2007).
  18. Alexandre, E., et al. Influence of pre-, intra- and post-operative parameters of donor liver on the outcome of isolated human hepatocytes. Cell and Tissue Banking. 3, 223-233 (2002).
  19. Spotnitz, W. D., Burks, S. State-of-the-art review: Hemostats, sealants, and adhesives II: Update as well as how and when to use the components of the surgical toolbox. Clinical and applied thrombosis/hemostasis : official journal of the International Academy of Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16, 497-514 (2010).
  20. Spotnitz, W. D., Burks, S. Hemostats, sealants, and adhesives III: a new update as well as cost and regulatory considerations for components of the surgical toolbox. Transfusion. 52, 2243-2255 (2012).
  21. Toriumi, D. M., Raslan, W. F., Friedman, M., Tardy, M. E. Histotoxicity of cyanoacrylate tissue adhesives. A comparative study. Archives of otolaryngology--head & neck surgery. 116, 546-550 (1990).
  22. Vinters, H. V., Galil, K. A., Lundie, M. J., Kaufmann, J. C. The histotoxicity of cyanoacrylates. A selective review. Neuroradiology. 27, 279-291 (1985).
  23. Bhogal, R. H., et al. Isolation of primary human hepatocytes from normal and diseased liver tissue: a one hundred liver experience. PloS ONE. 6, e18222 (2011).
  24. Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharm. 32, 56-67 (2000).
  25. Koebe, H. G., Pahernik, S. A., Sproede, M., Thasler, W. E., Schildberg, F. W. Porcine hepatocytes from slaughterhouse organs. An unlimited resource for bioartificial liver devices. ASAIO Journal. 41, 189-193 (1995).
  26. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. , Methuen. (1959).

Tags

Medicin cellbiologi Medicinsk teknik anatomi fysiologi Kirurgi Life Sciences (General) Human hepatocyte isolering mänsklig hepatocyte kollagenas perfusion kollagenas perfusion hepatocyter lever mänsklig cell isolering kliniska tillämpningar kliniska tekniker

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
Posted by JoVE Editors on 07/01/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The changes listed below have been made to Table 1.

1). In the recipe for Solution 2, the Final Concentration of EGTA has been changed from:

EGTA  0.1mM

to:

EGTA  1mM

2). In the recipes for Solution 3 and 4, the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate has been changed from:

Calcium chloride dihydrate  0.5µM

to:

Calcium chloride dihydrate  5mM
Isolering av humana hepatocyter med två steg kollagenas perfusion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, S. M. L., Schelcher, C.,More

Lee, S. M. L., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure. J. Vis. Exp. (79), e50615, doi:10.3791/50615 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter