Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bir iki aşamalı kolajenes perfüzyon prosedür ile insan Hepatositlerin İzolasyonu

Published: September 3, 2013 doi: 10.3791/50615
Automatic Translation
1,2, 1, 2,3, 3, 4
1Experimental Surgical Research, Grosshadern Hospital, Munich, 2Center for Liver Cell Research, Grosshadern Hospital, Munich, 3Hepacult LLC, Regensburg, 4Department of Surgery, Grosshadern Hospital, Munich

ERRATUM NOTICE

Summary

İnsan hepatositlerinin izole edilmesi için bir modifiye edilmiş iki aşamalı bir kolajenaz perfüzyon prosedür tarif edilmektedir. Bu yöntem, aynı zamanda, diğer memeli karaciğerinden uygulanabilir. Izole hepatositler onları böyle karaciğer rejenerasyonu, farmakokinetik ve toksikoloji gibi alanlarda bilimsel araştırmalar için uygun bir model yapma, yüksek verim ve canlılığı mevcuttur.

Abstract

Karaciğer, istisnai bir rejenerasyon kapasitesine sahip bir organ, örneğin detoks, metabolizma ve homeostasis gibi işlevleri geniş bir yelpazede, yürütmektedir. Gibi, hepatositler araştırma soruları büyük bir çeşitlilik için önemli bir model vardır. Özellikle, insan hepatosit kullanımı farmakokinetik, toksikoloji, karaciğer rejenerasyonu ve translasyonel araştırma alanlarında özellikle önemlidir. Bu yüzden, bu yöntem, Seglen 1 tarafından tarif edildiği gibi hepatositleri izole etmek için iki aşamalı bir kolajenaz perfüzyon prosedürünün modifiye edilmiş bir versiyonunu göstermektedir.

Daha önce, hepatositler, mekanik yöntemlerle izole edilmiştir. Bununla birlikte, enzimatik yöntemler hepatosit izolasyonundan sonra, yapısal bütünlüğü ve işlevi muhafaza üstün olduğu gösterilmiştir. Burada yer Bu yöntem, 77 ±% 10 arasında bir canlılığı ile hepatosit büyük bir verimle insan karaciğer parçaları ve sonuçlar sıçan karaciğer için daha önce tasarlanmış yöntemini uyarlar. AnaBu prosedürde fark kan damarlarının kanülasyon işlemidir. Bundan başka, burada tarif edilen yöntem, ayrıca, karaciğer karşılaştırılabilir veya kan damarı boyutları ile diğer türlerden elde edilen karaciğer uygulanabilir.

Introduction

Bir karaciğer hücre süspansiyonu, mekanik ya da enzimatik yöntemlerle karaciğer hazırlanabilir. Bütün karaciğer hücreleri hazırlamak için kullanılan mekanik yöntemler, tülbentten 2 vasıtasıyla karaciğeri zorlayan bir Kahn çalkalayıcı 3 cam boncuklar ile bir karaciğer parçası sallayarak, yılda vb gevşek havan elleri 4,5 ile cam homohenizatörlerin kullanarak dahil, mekanik yöntemler dışına düşmüş nedeniyle hücre zarlarına hasar ve izole edilmiş hepatositlerin 6,7 fonksiyon kaybına lehine. Sonuç olarak, bir enzimatik yöntem şu anda kullanımı hepatositlerin izolasyonu için ana yöntem.

Berry ve Friend 8 sıçanlarda portal ven aracılığıyla karaciğerden kolajenaz ve hiyalüronidaz perfüze zaman, bir enzimatik yöntem ile hepatositlerin izolasyonu büyük ölçüde geliştirilmiştir. Bu perfüzyon işlemi yol açan, enzimler, hücrelerin çoğunluğu ile yakın temas için izin vermek üzere damarsal kullanılanhepatositlerin 8 veriminde 6-katlık bir artış. Bundan başka, bu yöntem, hemen hemen izole vezikülleri içine endoplazmik retikulum hiçbir dönüşüm ve hiçbir zarar mitokondriyal 8, yapısal bütünlüğünü muhafaza hücreleri elde edildi.

Bu yöntem, karaciğer hücre izolasyonu için iki aşamalı bir prosedür perfüzyon öncülük Seglen 1, modifiye edilmiştir. Bu prosedürde, sıçan karaciğer Ca 2 + 1 ihtiva eden bir kolajenaz perfüzyon tampon maddesi ile, ardından bir Ca2 + serbest tamponu ile perfüze edilmiştir. Ikinci aşamada Ca 2 + eklenmesinin uygun kolajenaz aktivitesi 1.9 için gerekli iken, birinci aşamada Ca 2 + kaldırılması, dezmozomlar bozmak için yardımcı olur.

Yukarıda tarif edilen yayınlanmış çalışma sıçanlarda gerçekleştirildi olduğu göz önüne alındığında, bu makalede yüksek uğultu canlılığı ile hepatositlerin izolasyonu için kullanılabilecek modifiye edilmiş bir prosedürü ortaya koymayı amaçlamaktadırBir ciğeri. İnsan hepatositlerinin kullanılması translasyonel araştırma için ve hayvan modelleri kullanılarak deneyler doğrulamak için önemli olmaya devam etmektedir. Bu çalışmada kullanılan insan karaciğer parçaları İnsan Doku ve Hücre Araştırma Vakfı, bir devlet kontrolündeki kâr amacı gütmeyen vakfın 10 ile yönetişim için rıza ile elde edildi. Bir patolog tanı için gerekli ne uzaklaştırıldıktan sonra, karaciğer parçaları ve geri kalan dokulardan toplanmıştır. Patolog tarafından kapalı kesitli doku morfolojik karaciğer rezeksiyonu sonrası rezeksiyon marjları elde edilen sağlıklı doku oldu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Perfüzyon ve Yalıtım Çözümleri hazırlanması

  1. Karaciğer parçası ve Tablo 1 'e göre hepatositlerin izolasyon perfüzyon için gerekli olan çözümler hazırlayın. Çözümler, kullanılana kadar 4 ° C'de muhafaza edilebilir.
  2. Steril filtre 0.22 mikron filtre kullanılarak tüm çözümler.
  3. Karaciğer ile temas eden bütün çözeltiler steril olmalıdır.

2. Perfüzyon Ekipman ve Çözümleri hazırlanması

  1. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, karaciğer parçanın perfüzyon için donatım kadar ayarlanmalıdır.
  2. Su banyosu her bir deneysel kurulum farklıdır uygun bir sıcaklıkta, en ayarlanmalıdır da karaciğer parça ulaştıklarında çözeltiler 37 ° C sıcaklıkta şekildedir. Bu durumda, su banyosu Çözümleri 1, 2 ve 3 ile kaplanmış cam soğutucu ısınmaya 41 ° C'de ayarlanır. Çözüm 4 ısındı edilmelidirKollajenaz aktivite kaybını azaltmak için kullanım için ayrı bir su banyosu içinde 37 ° C.
  3. Kısa bir süre karaciğer perfüzyon önce,% 95 O 2 /% 5 CO 2 oksijenlenme aparatı (Şekil 1E) gaz içeren gaz tankı regülatör açın.

3. Karaciğer Perfüzyon

  1. Sadece 1 kesme yüzeyi ile ideal mümkün ve olduğunca sağlam Glisson kapsülü ile bir karaciğer parçası perfüzyon için bir patolog elde edilmelidir.
  2. Delikli bir filtre diski (Şekil 1 B) içeren bir Büchner hunisi üzerinde, bu parça karaciğer yerleştirin.
  3. Perfüzyon sistemi Çözüm 1 ile astarlanmalıdır.
  4. Düşük bir akış oranı ile, zeytin uçları eğri bir sulama kanüller karaciğer parçasının kesme yüzeyi üzerinde daha büyük kan damarlarının içine yerleştirilmelidir. Kan karaciğerden dışarı basması gibi, doku perfüzyonu iyi olan yerlerde hafif olur. Çeşitli boyutlarda için kullanılan kanül sayısıkaraciğerinin Şekil 2A'da gösterilmiştir. Seçilen göstergesi boyutu yerinde kanüller yapacak oturması sonuçlanmalıdır. Küçük kan damarları, karaciğer parçasının dışarı boşaltmak için perfüzyon tamponu için açık bırakılmalıdır.
  5. Karaciğer (Şekil 2B) büyüklüğüne bağlı olarak, ml / dak 110-460 arasına peristaltik pompa ile ilgili akış hızını artırır. Bu, 44 ± 16 arasında bir ortalama akış oranında ml / dak kanül başına (Şekil 2C) ile sonuçlanır. Seçilen hızı karaciğer parça bağlıdır ve karaciğer parçasının hafif plumping kadar sonuçlanmalıdır. Bazı durumlarda, yukarıda bahsedilen hafif plumping elde etmek için mikro vasküler kıskaçlar ile açık kapların bir kapalı sıkıştırılması için gerekli olabilir. Karaciğer parçası boyunca açık renk olduğunda iyi bir perfüzyon görülebilir.
  6. Fizyolojik ile ıslatılmış gazlı bez parçası ile kaplayıp perfüzyon sırasında nemli karaciğer parçasını tutun.
  7. Herhangi r dışarı atılması için Çözüm 1 1 L serpmekkaraciğer parça kan emaining.
  8. Çözüm 2 perfüzyon sıvısı değiştirin ve 10 dakika boyunca perfüze.
  9. Çözüm 3 perfüzyon sıvısı açın ve 0,5 L. ile serpmek
  10. Kollajenaz (Tablo 2) 0.1-0.15% içerir Çözüm 4'e perfüzyon sıvısını değiştirin.
  11. Karaciğer yeterli sindirilir kadar bu adım için, perfüzyon 9-12 dakika boyunca, bir devri daim şekilde gerçekleştirilebilir veya olmalıdır; karaciğer dokusu Glisson kapsülü altında ayrı hafif kırmak ve bir de kör tarafı ile problanmıştır zaman yumuşatılmış hissetmek görünmelidir neşter.

4. Hepatositlerin izolasyonu

  1. Peristaltik pompayı kapatın ve karaciğer parça kanüller kaldırın.
  2. Çözüm 5 100-200 ml ihtiva eden bir kristalizasyon çanağında karaciğer parça yerleştirin.
  3. Dikkatle Glisson kapsülü kaldırın ve yavaşça hücreleri silkelemek. De perfüze olmayan bölgeler yoksa, bir neşter kesmek için kullanılabilirBu bölgeler içinde bulunan hücreleri serbest bırakmak için. Gibi sürecinde ihtiyaç duyulan daha Çözüm 5 ekleyin.
  4. 500 ml'lik bir nihai hacim elde edilene kadar daha fazla Çözüm 5 ekleyin.
  5. Iki hücre süspansiyonu filtre, ilk önce bir 70 mikron naylon elek, ardından bir 210 um naylon elekle. Daha sonra, 200 ml santrifüj tüplerine hücre süspansiyonu dökün.
  6. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 72 g hücre süspansiyonu santrifüj Aspire edilen süpernatan ve yavaşça Çözüm 5 200 ml yavaşça tekrar süspansiyon hücre topağı.
  7. Yıkama adım numarasını 4.6 üç kez tekrarlayın. Son santrifüj adım, soğuk depolama çözümü tekrar süspansiyon hücreleri (malzemelerin listesine bakınız). Hücreler, bir hemositometre tabanlı bir tripan mavi dışlama tahlili kullanılarak verim ve canlılığı değerlendirilmesi için mililitre başına yaklaşık 2-5000000 hepatositler olmalıdır.
  8. Bir tripan mavi dışlama tahlili gerçekleştirmek için, tripan mavi soluti, 0.5 ml ihtiva eden bir mikrofüj tüpüne (≈ 2-5000000 / ml), uygun şekilde seyreltilmiş 0.1 ml hücre eklemekon (% 0.4 tripan mavi fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde çözülmüş) ve 0.4 ml PBS. İyice karıştırdıktan sonra hücre süspansiyonu, süspansiyon ile bir hemasitometre yük ve 100X büyütme ile mikroskop altında incelenmiştir. Canlı hücreler boyanmamış görünür iken mikroskobu altında, ölü hücreleri mavi boyanmış olacaktır. Menositometrede işaretli 1 mm 2 bloğun her birinde canlı ve toplam hücre sayısını. Canlılık (%), canlı hücre verimi (ml soğuk depolama çözümü (CSS) başına milyon hepatositler veya g karaciğer başına milyon hepatositler) aşağıdaki formüller kullanılarak hesaplanabilir.

Denklem 1
Not: Bu durumda, tripan mavi seyreltme faktörü 10 ve hemositometre faktör 10.000 'dir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Perfüzyon Kur

Karaciğer perfüzyon için gerekli ekipman, Şekil 1'e göre ayarlanmış olmalıdır.

Canlılık ve İzole İnsan Hepatositlerin Verim

Izole edilmiş insan hepatositlerinin ortalama canlılığı, 77 ±% 10 ve hepatositlerin ortalama verim ± standart sapma olarak ifade edilen değerler ile, 13 ± 11000000 hepatositler / g karaciğer idi. Hepatosit izolasyonların sayısı bu ortalama 648 izolasyonların Aralık 2012 Ocak 1999 yürütülen oldu elde etmek için yapılmıştır.

Uygun Perfüzyon Parametreler

Başarılı bir yıkama ve karaciğer perfüzyon gerçekleştirmek amacıyla, kullanılan kanül sayısı karaciğer (Şekil 2A) 'nin ağırlığına göre değişmelidir. Genel olarak, 4-8 kanül 20 g aşağıdaki üzerinde 80 g arasında değişen karaciğer için kullanılmalıdır. Perfüzyon oranı, uygun bir, Karaciğer ağırlığına bağlı olduğu, karaciğer (Şekil 2B ve C) başarılı bir perfüzyon için seçilmelidir. Bu, 44 ml / min -1 kanül arasında bir ortalama perfüzyon hızı farklı karaciğer ağırlıkları aralığında idealdir ve daha kanül kullanıldığı takdirde, bu nedenle perfüzyon hızı uygun şekilde ayarlanması gerektiği bulunmuştur. Perfüzyon başarılı olursa, karaciğer renk soluk olabilir ve hafifçe dolgun gerekir.

Hepatositlerin Saflık

Imuno olarak, bu pozitif albümin için, 94 ±% 1 arasında bir saflığa sahip izole edilmiş bir leke hepatositler, (5-N = 4, her çoğaltır) (Şekil 3A ve B). Şekil 3C temsil eden bir faz kontrast görüntü olduğu bulundu Bu tür büyük hücre boyutu ve çok kenarlı-hücreleri gibi hepatositlerin morfolojik özelliklerini gösteren.


Şekil 1. Bir Büchner, (C) cam ceketli kondansatör, (D) su banyosu, (E) oksijenlenme aparat kan damarlarının takılı zeytin ipuçları, (kavisli sulama kanüller ile perfüzyon kurulum. (A) kabarcık tuzak, (B) karaciğer parçası F)% 95 O 2 /% 5 CO 2 gaz tankı ve (G) peristaltik pompa.

Şekil 2,
Şekil 2,. Kullanılan kanül (A) sayısı, (B) perfüzyon oranı (ml / dak) ya da (C) perfüzyon hızı (ml / dakika. Bir Anlamlı farklı 0-20 g durum, p <0.05. 20-40 g, 40-60 g ve 60-80 g durumda, P <0.05 önemli biçimde farklı ab.

Şekil 3,
Şekil 3,. (Yeşil lekeli) (A) albümin için pozitif izole edilmiş hücreleri ve (B) karşılık gelen negatif kontrol (200 X büyütme) Immunofluorescent görüntüler. Çekirdekler DAPI kullanılarak mavi ile lekelenir. Izole edilmiş hücre (C) Faz kontrast görüntüsü (100 x büyütme).

Çözüm Kurucu Final Konsantrasyon
Çözüm 1 Sodyum klorür 154 mM
Hepes 20 mM
Potasyum klorür 5.6 mM
Glikoz 5 mM
Sodyum hidrojen karbonat 25 mM
Çözüm 2 Sodyum klorür 152.5 mM
Hepes 19.8 mM
Potasyum klorür 5.5 mM
Glikoz 5.0 mM
Sodyum hidrojen karbonat 24.8 mM
EGTA 0.1 mM
Çözüm 2 hazırlamak için, Çözüm 1 990 ml 100 mM EGTA 10 ml ekleyin. Çözüm 3 Sodyum klorür 152.5 mM
Hepes 19.8 mM
Potasyum klorür 5.5 mM
Glikoz 5.0 mM
Sodyum hidrojen karbonat 24.8 mM
Kalsiyum klorür dihidrat 0.5 uM
Çözüm 3 hazırlamak için, Çözüm 1 990 ml 0.5 M kalsiyum klorür dihidrat, 10 ml.
Çözüm 4 Sodyum klorür 152.5 mM
Hepes 19.8 mM
Potasyum klorür 5.5 mM
Glikoz 5.0 mM
Sodyum hydrogen karbonat 24.8 mM
Kalsiyum klorür dihidrat 0.5 uM
Kolajenaz Tablo 2'ye bakınız
Çözüm 4 hazırlanması için, 3 Çözüm için kolajenazın uygun miktarda ekleyin.
Çözüm 5 Sodyum klorür 120 mM
Hepes 10 mM
Kalsiyum klorür dihidrat 0.9 mM
Potasyum klorür 6.2 mM
Albümin 0.1% w / v

Tablo 1. Perfüzyon ve izolasyon çözümleri.

Karaciğer parçasının boyutu (g) Kollajenaz konsantrasyonu(%) Kolajenaz aktivitesi (U / ml)
<25 0.10 250
25 - 40 0.11 300
41-80 0.13 350
> 80 0.15 400

Tablo 2. Kollajenaz konsantrasyonu (%) ve aktiviteler (U / ml), karaciğer parçaları (g) çeşitli boyutları için kullanılır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol, yüksek sağlamlık ve saflıkta insan hepatositlerinin izolasyonu ile sonuçlanır. Bu sonuçları elde etmek için, bu karaciğer uygun bir parça ile başlamak önemlidir. Karaciğer parçası 1 kesme yüzeyi hariç tüm yüzeylerde bozulmadan Glisson kapsülü olmalıdır. Bir diğer önemli faktör farklı partisi sindirim 11 sonra hepatositlerin canlılığında belirgin farklılıklara neden olabilir olarak, kullanılan kolajenazın belirli bir küme olduğu. Bu nedenle, kolajenaz, farklı gruplar halinde test edilmelidir ve en canlılığı ile hepatositleri üreten toplu büyük miktarlarda elde edilmelidir. Son olarak, uygun bir sindirim süresi elde hücrelerinin verimi ve canlılığı göre seçilmelidir. Örneğin, düşük verimle yüksek canlılığı yetersiz sindirim süresini gösterebilir ve düşük canlılığı ile yüksek verim sindirim süresi çok uzun olduğunu gösteriyor olabilir.

Bu yöntem, t uyarlanabiliro, aynı parça karaciğer olmayan parankimal hücreler ve hepatositlerde izole eder. Bunu yapmanın bir yolu, non-parenkimal hücreli izolasyonu 12 direkt olarak (adım 4.6), birinci santrifüj aşamasından gelen süpernatan kullanmaktır. Ikinci bir yöntem, hepatosit izolasyonundan (adım 4.5) için naylon elekle filtrelenmiştir sonra hücre süspansiyonu gerekli kısım çıkarın ve verimini artırmak amacıyla olmayan parenkimal hücreli izolasyonundan önce ilave bir Pronaz sindirim aşamasından kalan hücre süspansiyonu tabi tutulmasıdır non-parankimal hücreler 13. Hepatositlerin pahasına olmayan parankimal hücrelerin daha yüksek bir verim için, bu yöntem, Pronaz ve kolajenaz için (adım 3.10), tek başına kolajenaz ikame olmayan parankimal hücre izolasyonu 14 için elde edilen hücre süspansiyonu kullanılarak modifiye edilebilir.

İnsan hepatositleri izole ek olarak, bu yöntem, aynı zamanda ileri geri toplanan sunulan karaciğer hepatositleri parçalarından izole etmek için uyarlanabilirkıyaslanabilir boyutlarda veya benzer damar boyutları ile m diğer türler. Bu, domuz, köpek veya primat modeller gibi alternatif modelleri kullanmak araştırmacılar için önemli olabilir.

İnsan hepatositlerinin İzolasyonlar genellikle iki kaynaktan karaciğerleri kullanılarak yapılır: Bütün ciğeri rezeksiyon marjları nakli veya morfolojik normal karaciğer dokusu için uygun sayılır. Bu yöntemde kullanılan ikinci kaynağının avantajı karaciğer parçaları daha önce laboratuara hazır olmasıdır. Hemen rezeksiyon sonrası, rezeke karaciğer tanı için gerekli olan ne kaldırır bir patolog getirilir. Patolog sonra atılması hedefleniyor ne hepatosit izolasyonu için morfolojik olarak normal karaciğer uygun bir parça çıkarmak olacaktır. Genel olarak, bir karaciğer parçası 56 ± 29 dakika boyunca (N = 103) arasında bir ortalama süre içinde perfüzyon için hazır laboratuarda gelir. Buna karşılık, transplantasyon için uygun değildir, bütün karaciğer tek rel olacak13 ± 2 saat ve 16 ± 12 saat 15 arasındaki laboratuvara hafifletti. Buna ek olarak, nedeniyle etik kaygılar ve donör karaciğerinin sıkıntısı, nakli için tüm kriterleri uymayan bütün karaciğerlerinden hepatositlerin izolasyon Eurotransplant bölgede önlenir. Bu ciğeri yine uzatılmış verici kriterlere nakli için kullanılabilir olmasıdır. Bazı çalışmalar seçilen alıcılara 16,17 geriledi bekleme listesi mortalite ve tatmin edici sonuçlara transplantasyon sonuçlarına hasta erişimi maksimize olduğunu göstermiştir. Diğer bir avantajı nakli için uygun karaciğer, yağlanmış fibrotik veya siroz olabilir iken karaciğer rezeksiyonu parçalarından elde edilen hücreler, morfolojik olarak sağlıklı bir karaciğer izole olmasıdır. Bu nedenle, burada yöntem, et al Baccarani ile elde gram karaciğer başına 0.7 ± 0300000 ya da 3 ± 2000000 hepatosit ile karşılaştırıldığında gram karaciğer başına 13 ± 11000000 hepatositlerin yüksek bir verimle sonuçlanır. 15. sırasıyla siroz veya yağlanmış karaciğerleri kullanarak. Ancak, karaciğer rezeksiyonu adet mevcuttur parçasının boyutu olarak hepatositlerin daha düşük bir toplam verimle sonuçlanır 2-250 g aralığında ve 37 ± 29 g (N = 648) bir ortalama ile, genellikle küçüktür.

, Diğer gruplara kıyasla, bu protokol, siyanoakrilat yapıştırıcı kullanılmasını önler. Alexandre, et al. 18 etil siyanoakrilat, yaygın olarak kullanılan bir çok amaçlı yapıştırıcı kullanımıdır gramı başına 3,5 ± 0,7-6,0 ± 1600000 hepatositlerden hepatositlerin artan verimle karaciğer, sonuçların kesme yüzeyleri kaplamak için bulundu vasıtalarının değerler ile karaciğer ortalamanın standart hatası ±. Buna karşılık, bu protokol, siyanoakrilat yapıştırıcı kullanılmadan (ortalama ± standart hata olarak ifade aracı) g karaciğer başına 13.5 ± 0400000 hepatositlerin bir verim elde edebilmektedir. Siyanoakrilat yapıştırıcılar yara kapanması için kullanılmış olsa da <sup> gibi octyl siyanoakrilatın ve butil siyanoakrilatın olarak 19,20, medikal siyanakrilat yapıştırıcılar etil siyanoakrilatın göre pahalı olabilir. Bununla birlikte, örneğin etil siyanoakrilat gibi daha kısa zincirli türevler uzun zincir türevlerini 21,22 daha histotoxic olduğu tespit edilmiştir.

Bu metot, zeytin uçları eğri sulama kanül kullanımına zaman etkili basit ve daha fazlasıdır. Uygun boyutta bir kanül kullanılması tutkal 18 ya da 23 dikiş kullanılmadan yerinde tutan bir kanül sıkı bir uyum ile sonuçlanır. Kullanılan kanüller 1.25-4.5 mm ila boyutlu uç çapları 1-2 mm arasında değişen çaplara sahip. Bir parça karaciğer kanülasyon için hazır olduğunda, ekteki videonun gösterildiği gibi, belirli bir kan damarı için uygun büyüklükte bir kanül seçilebilir, böylece kanül çeşitli boyutlarda bir çeşit, hazır olmalıdır. Bu yöntem, aynı zamanda, genel olarak daha kanül (Şekil kullanır2A) 2 23 veya 2-4 18 kanüller kullanılmaktadır, diğer çalışmalara kıyasla. Bu yüksek canlılığı ve daha kısa bir sindirim sürede verime yol açan karaciğer parçası boyunca daha iyi perfüzyon ulaşmak için yardımcı olabilir.

Sonuç olarak, bu protokol hücre metabolizmasını, farmakokinetik ve Ksenobiyotiklerin toksikoloji, karaciğer rejenerasyonu ve öteleme araştırma eğitim için önemli bir model olan insan hepatositler, izole eder. İnsan zehirlenmeye neden 150 uyuşturucu bir önceki anket klinik pratikte gözlenen hayvan çalışmalarında bulundu toksisite arasında ve uyum% 70 24 olduğunu gösterdi. Bu nedenle, insan hepatositler klinik denemelere gitmeden önce advers için neden hayvan modellerinde yapılan araştırma doğrulamak için ve uyuşturucu testi için önemli bir model kalır. Bir model olarak Ayrıca, numune kalan karaciğer ya da karaciğer izole İnsan hepatositlerinin kullanımı mezbaha hayvanlardan izole edilen 253R etik çerçeve 26 doğrultusunda olası araştırma hayvanların kullanımı yerine.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Bu protokolün optimizasyonu kısmen Hepacult GmbH bir hibe ile finanse edildi. Dr Wolfgang THASLER Hepacult GmbH kurucularından biri olan ve bu şirkette yönetim kurulu üyelerinden biri olmaya devam etmektedir. Maresa Demmel istihdam Hepacult tarafından kısmen. Maria Hauner Hepacult GmbH tarafından istihdam edilmektedir. Hepacult rızası ve araştırma amaçlı açık erişimli insan hepatositleri sunmaktadır Üniversitesi'nden bir spin-off biyoteknolojik firmadır.

Acknowledgments

Bu çalışma araştırma için insan dokuları kullanılabilir hale İnsan Doku ve Hücre Araştırma Vakfı tarafından mümkün olmuştur. Ve Hepacult GmbH bu iş için finansal destek Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (: Sanal Karaciğer Ağ, hibe sayısı 0.315.759 hibe adı) alındı. Bizim sayesinde de karaciğer perfüzyon ve hepatosit izolasyonu yapılması için karaciğer örnekleri ve Hücre İzolasyon Çekirdek Tesisinden teknik asistanların koleksiyonu için Grosshadern Hastanesi Doku bankası teknik asistanlar gidin. Özellikle, biz video Bu prosedürü göstermek için Natalja Löwen teşekkür etmek istiyorum. Son olarak, videonun şematik genel Şekil 1 için illüstrasyonlar ve şekiller oluşturma için Natalja Löwen ve Edeltraud Hanesch teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bubble trap Gaßner Glastechnik  
Glass jacketed condenser Gaßner Glastechnik  
41 °C Water bath Julabo 35723-H24/EG  
37 °C Water bath GFL 1083  
Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2) Linde  
Gas permeable tubing Neolab 2-4440  
Peristaltic pump Ismatec IP65  
Scalpel Feather 320010  
Forceps Omnilab 5171014  
Conical flasks 1 L Schott Duran 2121654  
Conical flasks 5 L Schott Duran 2121673  
Beakers Schott Duran 2110654  
200 ml centrifuge tubes Becton Dickinson 352075  
Crystallizing dish Omnilab 5144063  
Curved irrigation cannulae with ball tips Ernst Kratz GmbH 1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL  
Micro vascular clamps Ernst Kratz GmbH  
Büchner funnel Carl Roth HT38.1  
Nylon mesh 210 μm Neolab 4-1413  
Nylon mesh 70 μm Neolab 4-1419  
0.22 μm sterile filters Peske 99505  
500 ml bottles Schott Duran 2180144  
1 L bottles Schott Duran 2180154  
Hemocytometer Peske 06-0001  
1.5 ml tubes Eppendorf 0030 120,086  
50 ml conical tubes BD Biosciences 352070  
Ice bucket Neolab 1508454  
Sterile Pasteur pipettes Brand 747715  
Motorised pipette filler (Pipette boy acu) Integra 155017  
Refridgerated centrifuge Eppendorf 5810R  
Laminar flow Kendro Hera safe-KS9  
Aspirator (Low-flow surgical suction pump) Atmos C361  
Laboratory Gas Burner Integra Fire Boy eco  
Disposable laboratory coat Paperlynen GmbH MD0202414  
Surgical mask with visor Kimberly-Clark 48247  
Surgical hood Barrier 42072  
Latex gloves Semper Care CE0321  
Collagenase (Batch number NB 4G) Serva 17465  
Calcium chloride dihydrate Merck 2382  
EGTA Sigma E4378  
Sodium chloride Roth 9265.2  
Hepes Roth 9105.3  
Potassium chloride Serva 26868  
Albumin Biomol 01400-2  
Glucose Serva 22700  
Sodium hydrogen carbonate Serva 30180  
0.4% Trypan blue solution Lonza 17-942E  
Cold storage solution Hepacult GmbH  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
  2. Schneider, W. C., Potter, V. R. The assay of animal tissues for respiratory enzymes II. Succinic dehydrogenase and cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 149, 217-227 (1943).
  3. Aubin, P. M. G., Bucher, N. L. R. A Study of Binucleate Cell Counts in Resting and Regenerating Rat Liver Employing a Mechanical Method for the Separation of Liver Cells. Anat. Rec. 112, 797-809 (1952).
  4. Anderson, N. G. The Mass Isolation of Whole Cells from Rat Liver. Science. 117, 627-628 (1953).
  5. Jacob, S. T., Bhargava, P. M. New Method for Preparation of Liver Cell Suspensions. Experimental Cell Research. 27 (62), 453-467 (1962).
  6. Berry, M. N. Metabolic Properties of Cells Isolated from Adult Mouse Liver. Journal of Cell Biology. 15, 1-8 (1962).
  7. Laws, J. O., Stickland, L. H. Metabolism of Isolated Liver Cells. Nature. 178, 309-310 (1038).
  8. Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. The Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).
  9. Seglen, P. O. Preparation of Rat-Liver Cells .3. Enzymatic Requirements for Tissue Dispersion. Experimental Cell Research. 82 (73), 391-398 (1973).
  10. Thasler, W. E., et al. Charitable State-Controlled Foundation Human Tissue and Cell Research: Ethic and Legal Aspects in the Supply of Surgically Removed Human Tissue For Research in the Academic and Commercial Sector in Germany. Cell and Tissue Banking. 4, 49-56 (2003).
  11. Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver. Analytical Biochemistry. 138, 235-237 (1984).
  12. Smedsrod, B., Pertoft, H. Preparation of Pure Hepatocytes and Reticuloendothelial Cells in High-Yield from a Single-Rat Liver by Means of Percoll Centrifugation and Selective Adherence. J. Leukocyte Biol. 38, 213-230 (1985).
  13. Cantrell, E., Bresnick, E. Benzpyrene Hydroxylase-Activity in Isolated Parenchymal and Nonparenchymal Cells of Rat-Liver. Journal of Cell Biology. 52, 316-321 (1972).
  14. Weiskirchen, R., Gressner, A. M. Isolation and culture of hepatic stellate cells. Methods in Molecular Medicine. 117, 99-113 (2005).
  15. Baccarani, U., et al. Steatotic versus cirrhotic livers as a source for human hepatocyte isolation. Transplant P. 33, 664-665 (2001).
  16. Renz, J. F., et al. Utilization of extended donor criteria liver allografts maximizes donor use and patient access to liver transplantation. Annals of Surgery. 242, 556-563 (2005).
  17. Schemmer, P., et al. Extended donor criteria have no negative impact on early outcome after liver transplantation: a single-center multivariate analysis. Transplant Proc. 39, 529-534 (2007).
  18. Alexandre, E., et al. Influence of pre-, intra- and post-operative parameters of donor liver on the outcome of isolated human hepatocytes. Cell and Tissue Banking. 3, 223-233 (2002).
  19. Spotnitz, W. D., Burks, S. State-of-the-art review: Hemostats, sealants, and adhesives II: Update as well as how and when to use the components of the surgical toolbox. Clinical and applied thrombosis/hemostasis : official journal of the International Academy of Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16, 497-514 (2010).
  20. Spotnitz, W. D., Burks, S. Hemostats, sealants, and adhesives III: a new update as well as cost and regulatory considerations for components of the surgical toolbox. Transfusion. 52, 2243-2255 (2012).
  21. Toriumi, D. M., Raslan, W. F., Friedman, M., Tardy, M. E. Histotoxicity of cyanoacrylate tissue adhesives. A comparative study. Archives of otolaryngology--head & neck surgery. 116, 546-550 (1990).
  22. Vinters, H. V., Galil, K. A., Lundie, M. J., Kaufmann, J. C. The histotoxicity of cyanoacrylates. A selective review. Neuroradiology. 27, 279-291 (1985).
  23. Bhogal, R. H., et al. Isolation of primary human hepatocytes from normal and diseased liver tissue: a one hundred liver experience. PloS ONE. 6, e18222 (2011).
  24. Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharm. 32, 56-67 (2000).
  25. Koebe, H. G., Pahernik, S. A., Sproede, M., Thasler, W. E., Schildberg, F. W. Porcine hepatocytes from slaughterhouse organs. An unlimited resource for bioartificial liver devices. ASAIO Journal. 41, 189-193 (1995).
  26. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. , Methuen. (1959).

Tags

Tıp Sayı 79 Hücresel Biyoloji Biyomedikal Mühendisliği Anatomi Fizyoloji Cerrahi Yaşam Bilimleri (Genel) İnsan hepatosit izolasyon insan hepatosit kollajenaz perfüzyon kollajenaz perfüzyon hepatosit karaciğer insan hücre izolasyon klinik uygulamalar klinik teknikleri

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
Posted by JoVE Editors on 07/01/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The changes listed below have been made to Table 1.

1). In the recipe for Solution 2, the Final Concentration of EGTA has been changed from:

EGTA  0.1mM

to:

EGTA  1mM

2). In the recipes for Solution 3 and 4, the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate has been changed from:

Calcium chloride dihydrate  0.5µM

to:

Calcium chloride dihydrate  5mM
Bir iki aşamalı kolajenes perfüzyon prosedür ile insan Hepatositlerin İzolasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, S. M. L., Schelcher, C.,… More

Lee, S. M. L., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure. J. Vis. Exp. (79), e50615, doi:10.3791/50615 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter