Summary
السيطرة الأكسجين ميكروفلويديك يمنح أكثر من مجرد الراحة والسرعة على غرف ميتة لإجراء تجارب بيولوجية. خصوصا عندما نفذت عبر نشر عبر غشاء، يمكن توفير الأكسجين السائل ميكروفلويديك المتزامن والتحويرات المرحلة الغاز على مستوى الميكروسكيل. هذه التقنية تتيح ديناميكية تجارب متعددة حدودي الحرجة لدراسة جزيرة الفيزيولوجيا المرضية.
Abstract
الأوكسجين في وقت واحد ورصد العوامل اقتران تحفيز إفراز الجلوكوز في تقنية واحدة هو أمر حاسم لنمذجة الدول المرضية في جسم المريض من جزيرة نقص الأكسجة، وخاصة في بيئات زرع. تقنيات غرفة ميتة قياسي لا يمكن أن تعدل كل من التحفيز في نفس الوقت ولا توفر مراقبة الوقت الحقيقي من العوامل اقتران تحفيز إفراز الجلوكوز. لمعالجة هذه الصعوبات، طبقنا تقنية ميكروفلويديك متعدد الطبقات لدمج كلا مائي والتحويرات المرحلة الغاز عبر غشاء نشرها. وهذا يخلق شطيرة التحفيز في جميع أنحاء الجزر microscaled داخل polydimethylsiloxane شفافة (PDMS) الجهاز، مما يتيح رصد العوامل المذكورة آنفا عن طريق اقتران مضان المجهري. بالإضافة إلى ذلك، يتم التحكم في إدخال الغاز بواسطة زوج من microdispensers، وتوفير، التحويرات دقيقة الفرعية الكمية من الأوكسجين بين 0-21٪. يتم تطبيق هذا نقص الأكسجين متقطع للتحقيق في ظاهرة جديدة من جزيرةر شروط مسبقة. وعلاوة على ذلك، مسلحة مع المجهري المتعدد الوسائط، استطعنا أن ننظر إلى الكالسيوم مفصلة وديناميات قناة K ATP خلال هذه الأحداث ميتة. نحن نتصور نقص الأكسجة ميكروفلويديك، وخاصة المرحلة المزدوجة هذه التقنية في وقت واحد، وأداة قيمة في دراسة الجزر فضلا عن العديد من أنسجة الجسم الحي السابقين.
Introduction
نقص الأكسجة ديناميكية المهم في البيولوجيا، وتحديدا لزرع جزيرة
نقص الأكسجة ديناميكية هو الفسيولوجية الهامة وكذلك المعلمة المرضية في جسم المريض في العديد من الأنسجة البيولوجية. التغيير في الأكسجين، على سبيل المثال، هو إشارة قوية التنموية في الأوعية الدموية. علاوة على ذلك، الأنماط المكانية والزمانية في نقص الأكسجة تعدل HIF1 ألفا وتلعب دورا في أمراض مثل سرطان البنكرياس. نقص الأكسجين هو أيضا عامل التباس مؤثرة على نتائج زرع جزيرة. في الآونة الأخيرة، وقد أثبتت زمنيا التذبذبات من نقص الأكسجة، أو نقص الأكسجة متقطعة (IH) الفوائد في "شروط مسبقة" الجزر 1. ومع ذلك، آثار نقص الأكسجين على حد سواء ثابتة وعابرة على جزيرة علم وظائف الأعضاء لديها حتى الآن يجب أن يفهم جيدا أو درس، ويرجع ذلك أساسا إلى عدم وجود الأدوات المناسبة للسيطرة على جزيرة في المكروية.
وأوعية دموية الجزر بشكل جيد في الجسم الحي
الجزر البنكرياسية هي 50-400 المجاميع م كروي من خلايا الغدد الصماء، بما في ذلك خلايا بيتا وألفا الخلايا التي هي المسؤولة عن توازن الجلوكوز؛ 56. عندما تتعرض الجزر إلى الجلوكوز تنشيطية في الدم، وامتصاص تحلل يؤدي إلى إنتاج ATP، والذي يفتح البوتاسيوم ATP-الحساسة (K ATP) القنوات والنتائج في تدفق الكالسيوم الذي يقوم بتشغيل إيماس من حبيبات الأنسولين. الأكسجين مهم لدفع هذه العملية الأيضية بشكل كبير ويتأثر افراز الانسولين بشكل كبير من قبل ديناميكية تدفق الدم والأوكسجين، بالإضافة إلى تدرجات الجلوكوز. الجزر أداء بسهولة هذا الرد على الأنسولين الجلوكوز في الجسم الحي كما و perfused غاية في البنكرياس، كل في طول خلية واحدة من وعاء الشعرية. ومع ذلك، تتم إزالة شبكة كثيفة من الشعيرات الدموية intraislet بواسطة كولاجيناز خلال جزيرة العزلة 2،3. بالتالي، مقيدة سواء الأوكسجين والمغذيات الإمدادات إلى 100 ميكرومتر محيط بسبب القيود نشرها.
خطوة "> التقنيات الحالية حدت النجاح في إعادة جزيرة المكرويةالأوكسجين والجلوكوز ديناميات إعادة جزيرة في الأم، المفتاح لنمذجة الظروف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض، من الصعب تحقيق مع الغرف ميتة القياسية التي تتطلب تدفق تفصيلا ويفتقر الرصد المستمر للوظائف جزيرة. علاوة على ذلك، علاجات زرع للنوع الأول من مرض السكري فضح الجزر المعزولة لنقص الأكسجين في النظام البابي الكبدي 4 التي لديها أقل بكثير ص 2 (<2٪، 5-15 ملم زئبقي) مقابل البنكرياس الفسيولوجية (5.6٪، 40 مم زئبق). بعد الزرع، الطعوم جزيرة يستغرق أسبوعين أو أكثر إلى أن revascularized. وقد ثبت أن التعرض ميتة يضعف الجلوكوز الأنسولين آلية اقتران جزيرة ل. من بين العوامل تحفيز إفراز اقتران، إشارات الكالسيوم وإمكانات الميتوكوندريا، والأنسولين حركية يمكن بسهولة رصدها باستخدام على microfluidics. أظهرت أسلوبنا ميكروفلويديك السابقة هذا إعادةمراقبة آل الوقت مع التشكيل الدقيق للالمكروية مائي حول جزيرة واحدة 5،6. ومع ذلك، يتم وضع حرج الكمي من ضعف ميتة جزيرة عن طريق عدم وجود التحفيز ورصد التقنيات في وقت واحد. وبالتالي، والجمع بين السيطرة ميكروفلويديك الأكسجين ورصد جزيرة يمكن أن تحسن الدراسات نقص الأكسجة جزيرة.
يمكن على microfluidics إعادة وتعدل المكروية المائية والأكسجين
وقد استند تقنية قياسية للأنسجة والثقافة نقص الأكسجة دراسات عن غرف ميتة. بشكل عام، غرف ميتة توفر تركيزات الأكسجين واحدة مع موازنة مرات في ~ 10-30 دقيقة، تتعارض مع تحجيم دقيقة نقص الأكسجة الحيوية. استخدام اثنين من الدراسات الحديثة غرف مخصصة صغيرة لنقص الأكسجة التعرض المتقطع على الفئران كله، وكانت النتائج متضاربة بشأن الناجم عن استجابة الأنسولين الجلوكوز 7،8. نضع في اعتبارنا أنه في مستوى الحيوان كله، والأكسجين متنفس ليس تران مباشرةمن المقرر أن جزيرة بو الشعرية 2، وذلك بسبب التحكم في الجهاز التنفسي. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الدراسات لم يكن لديك مستويات الأكسجين موحدة، كما أنها لا توفر تدابير في الوقت الحقيقي على مستوى الأنسجة من الجزر.
من ناحية أخرى، يمكن على microfluidics الأكسجين تجاوز هذه القيود عن طريق التحكم الأكسجين عبر شبكات قناة الغاز. علاوة على ذلك، على microfluidics متوافق مع التصوير الحي خلال التشكيل الأكسجين، وهو انجاز غير ممكن حاليا مع الغرف ميتة القياسية. وهناك عدد من هذه الرواية على microfluidics نهج الاستفادة من نفاذية الغاز من polydimethylsiloxane بحل تركيزات الأكسجين في microchannels التي تتدفق عبر وسائل الاعلام الخلايا المستهدفة 9-14. هذه الأجهزة أيضا دمجت عدة تركيزات الأكسجين منفصلة، مضان مقرها أجهزة الاستشعار الأوكسجين، وحتى توليد الأوكسجين الكيميائي على رقاقة.
على microfluidics القائم على انذياب السائل يجدون صعوبة في الحفاظ على الاستقرار، التدرجات مستمر كما قلتر يعتمد على خلط الحمل الحراري وهي حساسة في التدفق الظروف. في المقارنة، والتقنية التي نستخدمها هنا يركز على خفض مسار انتشار تسليم الأوكسجين. يتم القضاء على انذياب الغاز وتدفق القص عن طريق نشرها مباشرة الأكسجين عبر غشاء المصنف مع الخلايا أو الأنسجة جزيرة. هذا يزيل على microfluidics الإضافية المطلوبة للسيطرة على انذياب ويمنع إجهاد القص لا لزوم لها على الجزر، والتي يمكن أن تؤدي في حد ذاته إفراز الأنسولين. وقد استخدم هذا المنبر لإظهار أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) يصل التنظيم في كلا النقيضين مفرط التأكسج ونقص الأوكسجين (2-97٪ O 2) في خلية ثقافة 1،15. بسبب التسليم المباشر من الأكسجين وإزالة تدفق القص، وبرنامجنا القائم على نشر يوفر الحل الأمثل لدراسة ميكروفلويديك جزيرة نقص الأكسجة.
التحفيز متعدد الوسائط والرصد
يجلب على microfluidics القائم على نشر أيضا فوائد إضافية عند تكييفها لدراسة ميل جزيرةcrophysiology. باستخدام غشاء كحاجز نشرها، السائل يمكن أن تكون معزولة من التحويرات الأكسجين، مما يتيح التحكم من التحفيز الجلوكوز مائي مستقل من التحفيز ميتة. وهذا يخلق مثل شطيرة التحفيز المتزامنة التي مكانيا التسليم نقطة دبوس إلى الجزر. علاوة على ذلك، كما هو التضمين الغاز زمنيا عبر microinjectors المحوسبة، يمكننا أن تعدل تركيز الأكسجين 21-0٪ رقميا مع الوقت عابر أقل من 60 ثانية. عناصر التحكم الديناميكي من الأكسجين والجلوكوز المكروية في المجهر تسمح في الوقت الحقيقي بروتوكول المتعدد الوسائط التي لن يكون من الممكن أو مرهقة للغاية باستخدام غرف ميتة القياسية. باستخدام هذا الجهاز، تم رصد إشارات الكالسيوم (FURA-AM)، إمكانات الميتوكوندريا (رودامين 123)، وحركية الأنسولين (ELISA) لتوفير صورة كاملة للاستجابة الديناميكية الجلوكوز الأنسولين تحت نقص الأكسجين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الفشوت ماوس
- تشريح C57BL / 6 الفئران وعزل الجزر عن طريق الهضم كولاجيناز وFicoll الفصل المتدرج الكثافة. (راجع المواد المشار إليها في JOVE 2،3).
- احتضان الجزر في المتوسط RPMI-1640 تحتوي على 10٪ FBS، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين، و 20 ملي HEPES في أطباق بتري (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2). بعد العزلة، والجزر الثقافة لمدة 24 ساعة قبل استخدامها في التجارب. استخدام الجزر في غضون 1-2 أيام لضمان تحقيق نتائج متسقة.
2. جعل منهاج ميكروفلويديك
- توليد هندستها المجهرية على photomasks الشفافية لكل طبقة الجهاز: 1) مدخل ومخرج، 2) طبقة ميكروفلويديك الجلوكوز مع غرفة perifusion (8 مم × 3 مم، 150 ميكرولتر)، 3) 200 ميكرون الغشاء مع microwells (500 ميكرون القطر، 100 ميكرون عميق)، و 4) طبقات ميكروفلويديك الغاز.
- لتلفيق طبقة مدخل ومخرج، صب degassed، PDMS خلط لعلى ارتفاع 1.5 مم في طبق بيتري فارغة والعلاج في 80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. لكمة 2 مم الإدخال / خارج الموانئ.
- لتلفيق طبقة ميكروفلويديك الجلوكوز، وتدور اثنين 350 ميكرون طبقات من SU8-2150 لتشكيل واحدة 700 ميكرون طبقة على 4 في رقاقة السيليكون.
- كشف ضوء الأشعة فوق البنفسجية من خلال الضوئية المناسبة لنقل نمط متناهية على SU8 بعد التطوير، وانتاج 700 ميكرون سيد طويل القامة.
- صب degassed، PDMS خلط على هذا الماجستير إلى ارتفاع 3 ملم وعلاج في 80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. خفض هذا PDMS لتشكيل بشفرة حلاقة.
- لكمة 2 مم منافذ الإدخال / الإخراج فضلا عن غرفة قطر 8 مم.
- الى افتعال غشاء 200 ميكرون مع microwells، وتدور SU8-2100-100 ميكرون. تطبيق نفس الأشعة فوق البنفسجية الطباعة الحجرية لنقل أنماط microwell على هذا 100 ميكرومتر سيد طويل القامة.
- تدور degassed، خلط PDMS على هذا الماجستير في 900 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية وعلاج عند 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. الصبانطبقة نا الثانية على رأس الأولى باستخدام نفس الظروف، مما أدى إلى 200 ميكرون PDMS الغشاء تحتوي على أنماط microwell.
- لكمة 2 مم منافذ الإدخال / الإخراج من خلال هذا الغشاء
- لتلفيق طبقة ميكروفلويديك الغاز، وتدور SU8-2100-100 ميكرون. تطبيق نفس الأشعة فوق البنفسجية الطباعة الحجرية لنقل الغاز أنماط ميكروفلويديك على هذا 100 ميكرومتر سيد طويل القامة.
- صب degassed، PDMS خلط على هذا الماجستير إلى ارتفاع 1.5 مم وعلاج في 80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. قطع PDMS لتشكيل بشفرة حلاقة.
- لكمة 2 مم منافذ الإدخال / الإخراج من خلال هذه الطبقة
- لسندات طبقات متعددة، إعدادهم عن طريق تنظيف مع الاسكتلندي، وفضح لالاكليل القوس، ومن ثم مواءمة باليد بالترتيب التالي.
- السندات الغشاء إلى طبقة الغاز أسفل مع microwells مواجهة.
- السندات وميكروفلويديك الجلوكوز على رأس الغشاء microwell.
- السندات مدخل ومخرج طبقة سن أعلى جدا، التغليف والتجميع كله.
- تعزيز الترابط بإضافة 1 كجم الوزن على رأس والخبز في 100 درجة مئوية لمدة 3 ساعة.
- تسرب اختبار الجهاز الانتهاء من تحميل الماء في الطبقة المائية، ثم غمر الجهاز بأكمله تحت الماء. ثم، وتدفق الهواء من خلال طبقة الغاز مع حقنة فارغة.
- تعقيم الأجهزة تسرب خالية مع الايثانول 70٪ من خلال طبقة مائي ثم مطاردة مع برنامج تلفزيوني العازلة، والتي يتم تخزينها في الجهاز على 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
3. إعداد Microdispenser
- الحصول على 2 microdispensers، 5 V و 20 V إمدادات الطاقة العاصمة، ومجلس I / O الرقمية لبناء خلط الأكسجين والإعداد التسليم.
- ربط الخيوط سيطرة microdispensers 'إلى وحدات السائق المدرجة.
- ربط السائقين إلى الرقمي الأول / O المجلس في الموانئ المقابلة لضوابط ابفيف.
- توصيل إمدادات الطاقة 5 V و 20 V إلى جهات الاتصال على محرك أحادي المقابلةنهاية الخبر.
- ربط الرقمية I / O إلى جهاز كمبيوتر محمول لتنفيذ رموز ابفيف للسيطرة على الغاز (الملحق).
- الاتصال microdispenser إلى النيتروجين في حين آخر لالهواء المضغوط، سواء مع 5٪ CO 2. تعيين كل الغازات إلى 2 رطل. عقف مخرجات موزعات 'في تي تقاطع قبل دخول الجهاز ميكروفلويديك.
- باستخدام جهاز اختبار التسرب، تميز استجابة عابرة التشكيل الأكسجين من قبل ركوب الدراجات في microdispensers بين 5-21٪ من الأكسجين، بينما قياس الأوكسجين المذاب في الماء مع جهاز استشعار الأكسجين الألياف البصرية (انظر قائمة المعدات ونتائج ممثل).
4. إعداد في المجهر
- تركيب جهاز لمرحلة ساخنة على مجهر مقلوب.
- الاتصال 0٪ و 21٪ O 2 الغازات إلى الجهاز ومعايرة مع مستشعر الاوكسجين.
- ربط ميناء إخراج على microfluidics الجلوكوز إلى جامع الكسر.
- إعداد بيكربونات كريبس قارع الأجراسالعازلة (KRB): 129 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5 مم 3 NaHCO، 4.7 ملي بوكل، 1.2 ملي KH 2 PO 4، 1 مم CaCl 2 · 2H 2 O، 1.2 ملي MgSO 4 · 7H 2 O، 10 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7،35-7،40 ، 2 ملي الجلوكوز القاعدية، و 5٪ FBS.
- إعداد حلين العازلة التي تحتوي على 2 ملي و 14 ملي الجلوكوز على التوالي في أنابيب مخروطية 50 مل استحم في 37 ° C حمام الماء.
- توصيل مضخة تحوي رسم العازلة في 250 ميكرولتر / دقيقة في الأنابيب. تدفق أنابيب على موقد 37 درجة مئوية قبل دخول الجهاز ميكروفلويديك.
- وصمة عار على الجزر، إضافة FURA-2 صباحا في DMSO وRh123 في الإيثانول بنسبة 100٪ إلى 2 مل من KRB لتصل إلى تركيزات صبغ النهائي من 5 ميكرومتر و 2.5 ميكرومتر، على التوالي.
- التقاط الجزر مع ماصة 10 ميكرولتر واحتضان في الأصباغ لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- تحميل ما يقرب من 20 الجزر في الجهاز عبر مدخل متناهية الجلوكوز. توجيه الجزر في غرفة عازلة بواسطة فتيلة من مأخذ مرة أخرى إلى رانه مدخل.
- يروي الجزر في المخزن لمدة 10 دقيقة ليغسل الأصباغ الزائدة.
5. تشغيل الأوكسجين في وقت واحد والجلوكوز تحفيز
- تسليم نبض التحفيز الجلوكوز مع 5 دقائق من خط الأساس التي وضعتها KRB2، تليها 15 دقيقة من 14 ملي التحفيز، ثم يغسل لمدة 15 دقيقة في KRB2.
- سجل 340/380 نانومتر الإثارة الطول الموجي للFURA-2 و 534 الانبعاثات لRh123.
- جعل قياسات النبض الطبيعي (14 ملي normoxic) قبل كل تجربة.
- لتعديل الأكسجين (نقص الأكسجة / نقص الأكسجين متقطعة)، لا تنطبق إلا تدفق العازلة خلال التحفيز وغسل الخطوات وأي تدفق في خطوات أخرى، لتقليل الحمل الحراري الاضطرابات.
- جمع النفايات السائلة من منفذ الجلوكوز في فترات 1 دقيقة لفحص ELISA الأنسولين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
المركزية إلى هذا الأسلوب جزيرة نقص الأكسجة هو القدرة على تعديل المائي والغازي التحفيز المرحلة في نفس الغرفة ميكروفلويديك مع العابرين دقيقة الحجم. الشكل 1 هو نتيجة ممثل أ) التحفيز المزدوج وب) التحويرات بسرعة تقاس داخل غرفة جزيرة. التشكيل المائي، كما هو موضح من قبل إدخال فلوريسئين في غرفة، يحقق التوازن في 3:57 دقيقة من الخلط. وعلاوة على ذلك، والأكسجين يمكن صعدت 5-21٪ مع العابرين سريع، مما يتيح الدراجات الأكسجين مع فترات قصيرة قدر 2 دقيقة. يمكن أيضا أن يتحقق أعماق مختلفة وركوب الدراجات والترددات كما هو مبين في الشكل 2.
عندما يتم تطبيق هذه الدراجات لخلق نقص الأكسجين متقطعة في الجزر، ويمكن للمرء أن يلاحظ فوائد الجزر شروط مسبقة ضد نقص الأكسجة، بالمقارنة مع العادية، نبض normoxic، الشكل 3A. بسبب تدفق الكالسيوم داخل الخلايا ويشير mechanisم الأنسولين إفراز-يتم رصد في الوقت الحقيقي، والآثار المترتبة على نقص الأكسجة وIH يمكن ملاحظتها في التجاوز والتذبذب التخميد من العابرين الكالسيوم والشكل 3B. هذه هي المعالم الهامة المرتبطة اقترح قنوات K ATP للسيطرة على عملية شروط مسبقة. وعلاوة على ذلك، وصلة الميتوكوندريا في عملية التمثيل الغذائي ونقص الأكسجة يمكن تصور من خلال رصد إمكانات الميتوكوندريا باستخدام Rh123. أخيرا، وجمع النفايات السائلة ميكروفلويديك يسمح ELISA مقايسة من إجمالي كمية الأنسولين. الكالسيوم، وإمكانات الميتوكوندريا، والأنسولين هي المعلمات الثلاث التي تبدأ في بناء الرأي المتعدد الوسائط للاستجابة الجلوكوز الأنسولين تحت العابرين ميتة، الشكل 3C.
الشكل 1. الأوكسجين والجلوكوز في وقت واحد التحفيز. (أ) الضوابط ثابت. أعلى: غرفة إدخال جزيء FITC في 250 ميكرولتر / دقيقة تستقر داخل 3 دقائق من خلط الوقت. القاع: يوفر سيطرة تسليم الغاز مستقرة من 5، 10، و 21٪ أكسجين في الغشاء (ب) التحكم الزمني. ركوب الدراجات من الأوكسجين بين 5-21٪ هو ممكن مع 1 دقيقة الفترة التي تقاس على حد سواء في تسليم الغاز (موزع) وسطح microwells (المنحلة).
الشكل 2. يمكن أيضا إنشاء جهاز ميكروفلويديك ملامح الأكسجين الأخرى. يمكن الحصول على لمحات IH مختلفة من خلال تغيير عمق (5-10-15٪) وكذلك فترات (3-6-1 دقيقة) من ركوب الدراجات عبر خلط الغاز من microinjectors المحوسبة .
3 "FO: محتوى العرض =" 5.5in "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50616/50616fig3highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/50616/50616fig3.jpg "/>
الرقم 3. IH شروطا مسبقة الجزر تحسنت الردود على نقص الأكسجة (أ) نظرة عامة ممثل شروط مسبقة باستخدام IH، بلغ مجموعها 30 دقيقة التعرض بنسبة 5٪، والتي تبين تعزيز استجابة ميتة مقارنة نبض normoxic (نفس الدفعة جزيرة في التجربة السابقة). لا يزال أكثر من 10 دقيقة نقص الأكسجة اللاحقة يحتفظ شروط مسبقة. (ب) مقارنة مضافين من normoxic متوسط، ميتة، ميتة والاستجابات شروطا مسبقة. أقحم تظهر آثار ممثل مع انتعاش سلوك التذبذب (ج) المتعدد الوسائط FURA-2، الانسولين، وRh123 الاستجابات للأوكسجين مختلفة والظروف الكيميائية: 21٪ أكسجين و 5٪ من الأكسجين، شروط مسبقة (P +5٪)، ديازوكسيد (D + 5٪)، و5HD (5HD + P +5٪). ديازوكسيد يتسق مع شروط مسبقة بينما 5HD ينفي فوائد شروط مسبقة من قبل فتح وblockiقنوات نانوغرام KATP، على التوالي. اثنين الذيل تي الاختبارات: 5٪ مقابل 21٪، 5٪ مقابل P +5٪، D +5٪ مقابل 5HD + P +5٪؛ * ع <0.05، ** ع <0.01، *** ع <0.001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طرائق متعددة متكاملة في هذا الأسلوب جزيرة نقص الأكسجة الحاضر عدة نقاط لاحظ هنا لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. أول مواصلة الجزر المعزولة أن تتحلل وتتفكك في الثقافة بسبب الانزيمات الهاضمة من خلايا عنيبية. توحيد التجارب ل1-2 أيام بعد جزيرة العزلة وبالتالي حاسما في الحصول على نتائج متسقة. الثانية، أوقف تدفق مائي خلال نقص الأكسجة ونقص الأكسجين متقطع لمنع الحمل الحراري التخليص على الحدود بين تدفق الصفحي ونشرها. هذا يبدو للحد من مدة جزيرة شروط مسبقة. التكامل في المستقبل من تبادل الغازات في القناة المائية يمكن القضاء على هذه التخليص طفيفة في حين لا يزال يسمح التحويرات الغاز السريع في الغشاء. الثالث، أثناء تحميل الجزر، ينبغي إعادة توصيل الأنابيب المائية بعناية في ترتيب عكسي (منفذ ثم مدخل) لتجنب احتباس فقاعات الهواء. أخيرا، الجهاز المستقبل يمكن زيادة مع موزع ميكروفلويديك-انتشروا، للمساعدة في التوزيعالشركة المصرية للاتصالات ومجموعة من الجزر على الحجرة بأكملها، في الجزء السفلي من التي يمكن منقوشة مع مجموعة من جيوب الصياد. وهذا التوزيع ميكروفلويديك بالإضافة إلى مجموعة جيب تساعد في خلق مجموعة من الجزر الصغيرة الموضعية للتجارب الإنتاجية العالية.
قبل هذا الأسلوب جزيرة نقص الأكسجة ميكروفلويديك، تحققت التحويرات نقص الأكسجة أسرع متقطعة في 2:59 دورات دقيقة باستخدام غرف صغيرة مخصصة ميتة مع تدفق عالية من الغاز المضغوط. ومع ذلك، وهذه لا يمكن استخدامها إلا على الحيوانات كلها وليس على مستوى جزيرة واحدة. إلى جانب عدم التيقن من مستوى نقص الأكسجة الفعلية التي تحققت في البنكرياس الحيوانات كلها '(بعد التوازن في الجهاز التنفسي) وهناك أيضا عدم القدرة على تحقيق استجابة الجلوكوز الأنسولين في الوقت الحقيقي، وmicroenvironments تسيطر عليها بشكل جيد. في المقارنة، يتم التحكم في كل من التحفيز مائي والغاز إلى جداول زمنية دقيقة في على microfluidics لدينا. هي التي شنت هذه التحويرات أيضا مباشرة في المجهر FOص الرصد multiparametric. قبل أسلوبنا، لم يكن للتكرار، وتميزت جيدا جزيرة مسبق للتحقيق. فيفو السابقين الأنسجة الحساسة للأكسجين مثل الجزر هي مناسبة بشكل مثالي لهذه المنصة ميكروفلويديك كأبعاد microscaled بهم (أي نصف قطرها 100 ميكرون) محاصرون بين أصغر منصة خلية ثقافة وأجهزة غرفة أكبر. أبعد من الجزر، وعدد من فيفو السابقين الأنسجة بما في ذلك أنسجة القلب، شرائح الدماغ، ويمكن أن الأجنة يتم التحقيق باستخدام هذه التقنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 DK091526 (JO)، جبهة الخلاص الوطني 0852416 (DTE)، ومشروع شيكاغو للسكري.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Spinner | Laurell | WS-400 | |
| SU8 | MicroChem | SU8-2150/SU8-2100 | |
| Digital Hotplate | PMC Dataplate | 722A | |
| UV Curing Lamp | OmniCure | S1000 | |
| PMDS | Dow Chemical | Sylgard 184 | |
| Corona Wand | ETP | BD-20AC | |
| Vacuum Chamber | Bel-Art | 420220000 | |
| Microdispensers | The Lee Company | IKTX0322000A | |
| 5 V and 20 V DC Power | Radio Shack | ||
| NI USB | National Instrument | NI USB-6501 | |
| Thermometer | Omega Engineering, Inc. | ||
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipulse 2 | |
| Oxygen Sensor | Ocean Optics | NeoFox | |
| Fraction Collector | Gilson | 203 | |
| Pippette | Fisher Scientific | Finnpipette II 100μl | |
| Inverted Epifluorescence Microscope | Leica | DMI 4000B | |
| 50 ml Conical Tubes | Fisher Scientific | ||
| Fura-2 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Rhodamine 123 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Culture Media | Sigma-Aldrich | RPMI-1640 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| 30 in Silicone Tubings | Cole-Parmer | 1/16 in x 1/8 in | |
| 1.5 ml Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | ||
| Y-connectors | Cole-Parmer | 1/16 in and 4 mm | |
| Syringe Connectors | Cole-Parmer | female Luer plug 1/16 in | |
| Straight Connectors | Cole-Parmer | 1/16 in | |
| Elbow Connector | Cole-Parmer | 1/16 in | |
References
- Lo, J. F., Wang, Y., et al. Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia. Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).
- Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp.. , e1125 (2009).
- Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets. J. Vis. Exp.. , e1343 (2009).
- Shapiro, A. M., et al. Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen. N. Engl. J. Med. 343 (4), 230-238 (2000).
- Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device. J. Vis. Exp.. , e1649 (2010).
- Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
- Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period. AJP - Regu Physiol. 303 (7), 700-709 (2012).
- Lee, E. J., et al. Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia. Eur. J. Appl. Physiol. , (2012).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).
- Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator. Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).
- Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures. Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).
- Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).
- Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium. Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).
- Chen, Y., et al. Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions. Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).
- Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).
